专利名称：一种质粒dna或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法哺乳动物早期胚胎发育由其自身的遗传机制所控制，研究该遗传机制所采用的基本方法是调控关键基因的表达，观察后续的发育情况并分析该关键基因在发育过程中所发挥的作用。目前，将外源基因导入胚胎进行过表达或抑制基因的表达是研究基因功能一贯且经典的方法。把外源基因转入到细胞/胚胎或整合到基因组主要通过转染、病毒载体的感染和显微注射，而抑制基因的表达主要依靠基因敲低和基因敲除技术。然而，就附植前胚胎而言，通过转染或病毒载体的感染而把外源基因导入十分困难，因为附植前胚胎外面由一层透明带包裹。基因敲除技术虽好但不能广泛的应用，因为此技术费时费力且花费巨大。目前外源基因和下调基因表达的序列包括dsRNA、siRNA以及反义寡核苷酸主要通过显微注射导入附植前胚胎。此种方法效率很低，因为将外源基因和dsRNA、siRNA以及反义寡核苷酸导入2-细胞期以后的附植前胚胎需要逐个卵裂球的注射，费时费力且每次只能操作一个胚胎。抑制基因表达的方法根据原理不同大致可分为两类第一，利用siRNA或dsRNA降解靶mRNA，使关键基因失去翻译的模板；第二，利用反义寡核苷酸与靶mRNA进行结合，要么抑制靶mRNA的翻译，要么改变靶mRNA的剪切，进而表现出某关键基因失活的表型。以前， 抑制基因的表达时，运用最多的是siRNA和dsRNA，但最近几年，反义寡核苷酸的运用有上升的趋势，因为反义寡核苷酸不降解靶mRNA且不易被RNase H降解，在细胞或胚胎内能维持较长时间。目前，发育生物学家多采用显微注射的方法将反义寡核苷酸注入卵子或者斑马鱼、青蛙、海鞘、海胆等的受精卵中进而研究胚胎发育。此方法能准确控制反义寡核苷酸的导入时间，但该方法对操作人员的技术要求很高，且每次只能注射一个胚胎，效率很低因此，亟待寻求一种将外源基因或特异序列快速高效导入小鼠附植前胚胎的方法，为进一步深入研究小鼠早期胚胎发育机理提供技术支持。电穿孔技术主要是利用瞬时的脉冲电场改变细胞膜脂质双层的结构，使细胞膜形成暂时性的孔洞，大分子在电场的作用下进入细胞或胚胎。在成功的电转中，电通透作用和电泳作用起着非常关键的作用，此外，大分子的被动扩散和细胞内吞也起了一定的作用。而利用电穿孔技术将质粒DNA或反义寡核苷酸导入附植前胚胎的报道至今未见。
本发明解决的问题在于提供一种质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法，实现对胚胎进行安全、简便、高效的转染。本发明是通过以下技术方案来实现 一种质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法，包括以下步骤 1)将待转染的质粒DNA用电转缓冲液稀释至浓度为10 80 μ g/ml，得到质粒DNA电穿孔溶液；或者将待转染的反义寡核苷酸用电转缓冲液稀释至浓度为0. 2mM，得到反义寡核苷酸电穿孔溶液；2)将待转染的附植前胚胎置于酸性台氏液中，室温孵育10 20s，然后终止消化并清洗；3)将质粒DNA电穿孔溶液或反义寡核苷酸电穿孔溶液加入电转皿两根电极之间的凹槽中，将附植前胚胎线性排列在电转皿的两根电极之间，在脉冲电场下，利用电穿孔法对附植前胚胎进行转染。所述的质粒DNA在转染前还进行去内毒素处理，将去内毒素处理的质粒DNA用电转缓冲液Opti-MEM I进行稀释。所述的将附植前胚胎在进行酸性台氏液处理之前，还对胚胎用H-KSOM溶液清洗。所述的终止消化是将胚胎从酸性台氏液转移到H-KSOM溶液中清洗，然后再用 Opti-MEM I溶液清洗。所述的转染的质粒DNA为带有荧光基因的质粒DNA ；所述的反义寡核苷酸在转染前还进行lissamine标记，将lissamine标记的反义寡核苷酸用电转缓冲液Opti-MEM I进行稀释。所述的转染的质粒DNA包括一种或多种以上序列不同的质粒DNA。所述的附植前胚胎包括处于不同发育时期的附植前胚胎。所述的电穿孔法进行质粒DNA转染的参数控制为电压20V 40V ；脉冲时间1 2ms ；脉冲次数3 4次。所述的附植前胚胎为小鼠附植前胚胎，电转参数控制为电压20V 40V ；脉冲时间1 2ms ；脉冲次数3 4次。所述的电穿孔完成后，将转染后的胚胎清洗并转移入KSOMaa培养液中培养。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法，首先对胚胎透明带结构使用台氏液进行弱化处理，然后再将处理后的胚胎置于脉冲电场作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔，导致其通透性和膜电导瞬时增大，可以使在正常生理情况下细胞膜难以通透的质粒DNA或反义寡核苷酸进入细胞。由于采用了电穿孔转染的方法，本发明还能同时将两种或多种质粒DNA —起转入附植前胚胎，如果构建的质粒DNA所携带的外源片段是某个关键基因或靶向某个关键基因的干扰片段，则可具体研究某个关键基因在小鼠附植前胚胎的发育过程中所起的具体作用。由于采用了电穿孔转染的方法，本发明能将所设计的、与不同靶基因的mRNA结合的反义寡核苷酸转染到胚胎内，可用于研究目的基因在小鼠附植前胚胎的发育过程中所起的具体作用。为了进一步观察或跟踪转染效果，待转染的质粒DNA带有荧光基因，而待转染的反义寡核苷酸进行Iissamine(丽丝胺，可以发红色荧光)标记，这样在电穿孔转染后通过荧光显微镜可以直观的观察。本发明将质粒DNA或反义寡核苷酸转入附植前胚胎省时、省力、花费少、操作简单、对操作者以及操作的胚胎没有毒性、效率高、速度快。一次可操作50 100枚胚胎，电转时间在Imin以内。电转后体外培养Mh，通过荧光显微镜对胚胎进行观察并进行统计学分析表明，本发明的电转效率约为97%。为采用质粒DNA或反义寡核苷酸所针对的基因或基因转录物研究其在胚胎中的功能提供了有效的转染方法。图1为质粒DNA转入不同发育时期附植前胚胎的显微照片；图2为反义寡核苷酸转入不同发育时期附植前胚胎的显微照片。

1、首先对反义寡核苷酸进行预处理a、具体采用标准对照反义寡核苷酸为例进行说明，反义寡核苷酸根据需要可以针对不同的目的基因来设计，待转染的反义寡核苷酸一般带有荧光基团标记，以便于后续的观察及筛选；具体采用lissamine标记的标准对照反义寡核苷酸(商品化的)，不会影响任何基因的功能，在正常的实验中仅仅是一个对照组。由于反义寡核苷酸的序列非常短，仅仅25bp 左右，由人工合成。只要标准对照反义寡核苷酸能够转染成功，其它针对任何基因的反义寡核苷酸都能转进去。b、将lissamine标记的反义寡核苷酸稀释在Opti-MEM I溶液中，反义寡核苷酸不同，电转时稀释的浓度也不同，标准对照反义寡核苷酸稀释后的浓度控制为0. 2mM ；虽然每种反义寡核苷酸所针对的靶基因转录物都不尽相同，通过多次实验之后可适当调整其转染浓度。2、小鼠胚胎进行透明带弱化的预处理a、将收集得到的不同时期的小鼠附植前胚胎在H-KSOM操作液中洗3次，以除去组织碎片和颗粒细胞；100ml H-KS0M工作液配方同实施例1 ；b、将收集好的胚胎置入酸性台氏液(sigma，美国)中15s，进行透明带弱化处理； 不同胚胎的具体的弱化时间可通过多次实验进行筛选而获得；C、将弱化处理过的小鼠胚胎在H-KSOM操作液中洗3次，以除去酸性台氏液；d、将胚胎在Opti-MEM I溶液中洗3次，之后置入反义寡核苷酸稀释液中；完成对胚胎的预处理之后，对胚胎进行电穿孔，具体操作包括以下步骤1)使用电穿孔仪(ECM 2001Electro Cell Manipulator，BTX，美国)进行电穿孔， 反义寡核苷酸溶液加入电转皿取30 μ 1反义寡核苷酸溶液加入电转皿两根电极之间的凹槽；2)小鼠附植前胚胎置入电转皿两根电极之间将小鼠不同时期的附植前胚胎线性排列在电转皿的两根电极之间；3)反义寡核苷酸的电转电转参数是电压30V，脉冲长度1ms，脉冲次数2次，重复次数1次；4)电转后胚胎的培养将胚胎吸出并在操作液H-KSOM中洗3次，之后培养在KSOM 培养液中；100ml KSOM培养液配方同实施例1 ；5)在荧光显微镜下观察胚胎发绿色荧光的情况电转24h后，将不同时期的胚胎置于荧光显微镜下观察照相并计算电转效率。荧光显微镜观察结果如图2所示，图A、图B、图C、图D、图E和图F分别在1_细胞胚胎、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎和桑椹胚时进行的反义寡核苷酸电转结果，对荧光亮度的定性的观察结果显示，在不同时期的胚胎转染都达到了良好的转染效果。


本发明公开了一种质粒DNA或反义寡核苷酸转染附植前胚胎的方法，包括以下步骤1)配制待转染的电穿孔溶液；2)对胚胎透明带进行弱化处理；3)将胚胎移入配制好的含电穿孔溶液，室温静置，然后再将胚胎连同电穿孔溶液移入电转槽中进行电穿孔。由于采用了电穿孔转染的方法，本发明还能同时将两种或多种质粒DNA，或者反义寡核苷酸一起转入附植前胚胎，如果构建的质粒DNA所携带的外源片段是某个关键基因或靶向某个关键基因的干扰片段，则可具体研究某个关键基因在小鼠附植前胚胎的发育过程中所起的具体作用。