靶向多基因的siRNA分子及其抑制肿瘤的应用的制作方法[0002]RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA(double-strand RNA,dsRNA)引发其同源信使RNA(messenger RNA, mRNA)酶解的一种转录后基因沉默形式(Nature.1998，391:806-811)。长双链RNA进入细胞后，被Dicer酶结合并切割。Dicer酶的切割产物长度通常为20~25bp，且在每条链的3’末端有2个核苷酸悬垂的小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)。siRNA的一条链惨入到RNA-诱导的沉默复合物中(RNA-1nduced silencing complex, RISC),与互补 RNA 的序列配对。RISC 首先介导 siRNA双链解旋，与RISC耦合的单链的siRNA以序列特异的方式与靶mRNA结合，之后由RISC的催化组分切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻译，最终抑制该基因的表达。现已被证实在多种病毒感 染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。[0003]RNAi在医药领域有广阔的应用前景，如抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等。双链干扰核酸可设计成能被Dicer酶剪切的称做Dicer底物的长双链形式,或者是短的、不需Dicer酶剪切直接作为RISC底物的形式。合成的双链RNA与目的基因序列互补，导入细胞或生物体后，被内源的遗传物质识别，激活RNAi途径。利用这种机制，RNAi使靶基因的表达水平急剧下降。[0004]RNAi技术开辟了一个全新的治疗领域，目前国际上已有数十种siRNA药物进入临床阶段。其中有应用siRNA治疗老年性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、呼吸道合胞病毒病、实体肿瘤、肝癌、以及急性肾损伤等疾病。[0005]在最近的研究中，陈莉等人报道了 NET-1和Cortactin的蛋白在HCC组织中相对癌旁组织显著过表达。前期研究表明NET-1的表达与细胞增殖有关，显著上调癌症的形成(Chen L等.Tumor1.2010,96 =744-750)。该结果显示，NET-1的表达和功能可能会成为癌症发生发展的潜在靶标。[0006]最新报道的由EMSl (细胞骨架重组相关基因)编码的Cortactin (皮层肌动蛋白结合蛋白)，与癌症转移相关的(Kellye C.CellAdhesion&Migration5:2,187-198 ；March/April2011)。Cortactin可以结合到Arp2/3复合物上,激活Arp2/3复合物介导的肌动蛋白聚合，促进细胞迁移(Kowalaki JR.J Cell Sci, 2005,118 (Ptl):79-87)。以往的研究表明，Cortactin表达与门静脉癌栓和肝外转移显着相关,说明Cortactin的高表达可能是肝癌侵袭性增加的因素之一。[0007]血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor,VEGF)是诱导血管生成的促进因子，可促进内皮细胞分裂与增殖、促进血管生成以及增加微、小静脉的通透性，诱导丝氨酸蛋白酶与间质胶原酶的表达，使细胞质钙聚集，诱导血管生成，在创伤愈合、胚胎发育、肿瘤生长和转移过程中起着重要的作用。VEGF在成熟器官中表达较低，在一些代谢旺盛、血供丰富的组织细胞中表达较高，尤其是在肿瘤组织中。随着研究的深入，VEGF促进肿瘤血管生成的作用和与人类癌症的发病机制的关系是确定的，因此，抑制VEGF途径被确认为是一种重要的有效的抗癌治疗方法。

[0008]本发明要解决的技术问题是提供一种靶向多基因的siRNA分子，尤其是指同时靶向NET-1、EMSl及VEGF基因的siRNA分子及其抑制肿瘤应用。
[0009]为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是提供了一种同时靶向NET-1、EMSl和VEGF基因的siRNA分子，其特征在于，由正义链、反义链1、反义链2和反义链3组成，其序列为:
[0010]正义链:
[0011]5，-CCACAAUGG CUGAGCACUUGGAACAAGACCGAAUGGAUACGGAGUACCCUGAUGAGAUCNn-3，(SEQ ID NO:1),
[0012]反义链1:5’ -AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’ (SEQ ID NO:2)；
[0013]反义链2:5’ -UAUCCAUUCGGUCUUGUUCNn-3’ (SEQ ID NO:3)；
[0014]反义链3:5’ -GAUCUCAUCAGGGUACUCCNn-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0015]其中，N是胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT ；n代表N的个数，η是O~2的整数。
[0016]换言之，上述双链siRNA分子的主干序列为:
[0017]正义链:
[0018]5’-CCACAAUGGCUGAGCACUUGGAACAAGACCGAAUGGAUACGGAGUACCCUGAUGAGAUC-3’ (SEQID NO:5)，
[0019]反义链1:5’ -AAGUGCUCAGCCAUUGUGG-3’ (SEQ ID NO:6)；
[0020]反义链2:5’ -UAUCCAUUCGGUCUUGUUC-3’ (SEQ ID NO:7)；
[0021]反义链3:5’ -GAUCUCAUCAGGGUACUCC-3’ (SEQ ID NO:8)。
[0022]对于上述双链siRNA分子而言，
[0023]优选地，所述N为dT，且η为2。
[0024]优选地，所述的η为O。
[0025]本发明提供了上述的同时靶向NET-1、EMSI和VEGF基因的siRNA分子在制备同时抑制细胞中NET-1、EMSl和VEGF基因功能的药物中的用途。
[0026]本发明还提供了上述的同时靶向NET-1、EMS1及VEGF基因的siRNA分子在制备治疗肝癌药物中的用途。
[0027]体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链可特异性地与NET-1、EMSl和VEGF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到治疗肿瘤的目的。
[0028]本发明的s iRNA分子可以应用于制备同时调节细胞中NET-1、EMSI和VEGF基因功能的药物中发挥RNA干扰的作用，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到治疗肿瘤的目的。


[0029]图1是实时定量PCR检测不同实验组NET-1、EMSl和VEGF基因的mRNA表达水平结果图。其中，A为不同实验组NET-1基因mRNA相对表达水平；B为不同实验组EMSl基因mRNA相对表达水平，C为不同实验组VEGF基因mRNA相对表达水平。
[0030]图2是MTT法检测不同实验组的SMMC-7721细胞生长结果图。其中，A为不同实验组在不同时间点的生长曲线图；B为不同实验组在不同时间点的OD值柱形图。
[0031]图3是流式细胞术检测不同实验组SMMC-7721细胞凋亡结果图。其中，A为不同实验组的FCM分析结果图；B为Annexin V和PI双染阳性细胞的定量柱形图。图4是细胞划痕实验检测不同实验组SMMC-7721细胞迁移结果图。其中，A为不同实验组在0h、24h、48h和72h的细胞迁移照片；B为72h细胞相对迁移距离的柱形图。
[0032] 图5是Transwell细胞侵袭实验检测不同实验组SMMC-7721细胞侵袭结果图。其中，A为不同实验组在0h、24h、48h和72h的细胞侵袭照片；B为72h不同实验组侵袭细胞数的柱形图。

[0033]为方便起见，在下文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互换，它们表不的意思和范围相同。
[0034]其中，siRNA是正义链和反义链退火形成的双链结构。
[0035]本发明的siRNA分子来源于针对NET-1、EMS1及VEGF基因开放阅读框的功能保守区而设计。
[0036]siRNA的制备可采用多种方法，比如:化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。
[0037]本发明的siRNA分子可以作为制备调节细胞中NET-1、EMS1及VEGF基因功能药物的有效成分，尤其是抗肿瘤药物的有效成分。
[0038]出于应用目的，可将SiRNA分子作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如肿瘤组织。
[0039]本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。
[0040]任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学上可接受的载体及佐剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。
[0041]为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
[0042]下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。
[0043]实施例1
[0044]步骤1、细胞培养:
[0045]肝癌细胞株SMMC-7721购于上海中科院细胞研究所，用含10% FBS(Gibco公司)的DMEM培养基(Gibco公司)培养，所述培养基中加入青霉素和链霉素(Invitrogen公司)，青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和IOOy g/mL，培养于37°C二氧化碳培养箱。[0046]步骤2、siRNA体外转染
[0047]设计同时靶向NET-1、EMSl及VEGF基因的多靶siRNA序列:Multi_targetsiRNA (Mtg_siR)，设计阴性对照序列(NC)作为对照(NC_siR)。同时单靶siRNA(NET_l_siR、EMSl_siR、VEGF_siR)作为对照，序列见表1。
[0048]取步骤I中培养得到的处于对数生长期的细胞，96孔板的接种密度为5 X IO4/孔、24孔板按1.5 X IO5/孔、6孔板为I X IO6/孔接种细胞，将其分为实验组和不转染siRNA的未处理组，所述的实验组包括NC_siR组、Mtg_siR组、NET-l_siR组、EMSl_siR组和VEGF_siR
组。各实验组采用相应的siRNA按操作说明用脂质体Lipofectamine?: 2000 (Invitrogen公
司)转染到细胞内，使siRNA终浓度为50nM，37°C培养4h后，培养液换成含10% FBS (Gibco公司)的DMEM培养基(Gibco公司)。
[0049]所有的实验均重复3次，结果均用平均值土SD表示，用SPSS17.0进行统计学分析。统计学差异用单因素方差分析和双侧t检验。P <0.05表明差异显著。
[0050]表1:siRNA序列及对照序列
[0051]