中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法_陈瑛专利（试剂盒,耳聋,筛查）-早鸽网

中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法

专利名称

中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法
发明者

陈瑛
公开日

2012年8月1日
申请日期

2011年1月26日
优先权日

2011年1月26日
申请人

苏州市立医院
文档编号

C12Q1/68GK102618624SQ20111002743
关键字

试剂盒耳聋筛查基因人群中国
权利要求

1.ー种中国人群耳聋基因突变热点的筛查试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下内容 (1)PCR 反应试剂，包括 dNTP、5X 和 IOXPCR 缓冲液、Mg2+离子、FastTaq 酶、SNaPshotMultiplex 混合液； (2)等比例混合的针对耳聋基因6个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物； (3)按ー定比例混合的针对耳聋基因7个突变热点的PCR延伸引物； (4)纯化试剂，包括SAP酶、ExonI酶及其配套的缓冲液； (5)对照标本，包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照标本、阴性对照标本，所述试剂盒以GJB2基因235位点的delC和299-300位点delAT，SLC26A4基因2168位点的A — G突变和IVS7-2位点的A — G突变，线粒体DNA基因1555位点的A — G突变、3243位点的A — G突变和7445位点A — G突变共7个突变热点为检测对象，针对每个位点的突变分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的位点同时进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得7个位点的基因型2.如权利要求I所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述GJB2 基因 235 位点的扩增引物序列是 ATGCTTGCTTACCCAGAC 和 GATCTCCTCGATGTCCTTA3.如权利要求I所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述GJB2基因299位点的扩增引物序列与所述235位点的扩增引物序列一致4.如权利要求I所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在干，所述SLC26A4基因2168位点的扩增引物序列是GCCTGGGCAATAGAATGAGACT和CCCTCTTGAGATTTCACTTGGT5.如权利要求I所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在干，所述SLC26A4基因IVS7-2位点的扩增引物序列是ACAAAATCCCAGTCCCTATTCCTA和TATGGTTGTTTCTTCCAGATCACA6.如权利要求I所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述线粒体DNA基因1555位点的扩增引物序列是AAAACTACGATAGCCCTTATGAAAC和AGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTGTT7.如权利要求I所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述线粒体DNA基因3243位点的扩增引物序列是GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC和TGGCGTCAGCGAAGGGTTGT8.如权利要求I所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述线粒体DNA基因7445位点的扩增引物序列是ATCTAACTTTCTTCCCACAACACTT和AATGGTTTTTCTAATACCTTTTTGA9.如权利要求I所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在干，内装等比例混合的针对耳聋基因8个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物，及按一定比例混合的针对耳聋基因14个突变热点的PCR延伸引物，所述试剂盒以GJB2基因35位点delG、109位点G — A突变、176-191位点缺失16个碱基、235位点delC和299-300位点delAT, SLC26A4基因1174位点的A — T突变、1229位点的A — G突变、2027位点的T — A突变、2168位点的A — G突变和IVS7-2位点的A — G突变，线粒体DNA 1494位点的C — T突变、1555位点的A — G突变、3243位点的A — G突变和7445位点A — G突变共14个位点为检测对象，针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的区段同时进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得14个位点的基因型10.如权利要求9所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述GJB2基因35位点的扩增引物序列与所述235位点的扩增引物序列一致11.如权利要求9所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述GJB2基因109位点的扩增引物序列与所述235位点的扩增引物序列一致12.如权利要求9所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述GJB2基因176位点的扩增引物序列与所述235位点的扩增引物序列一致13.如权利要求9所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述SLC26A4 基因 1174 点的扩增引物序列是 CCCAAGTACCTATCACGG 和 CCTTCCTCTGITGCCAIT14.如权利要求9所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述SLC26A4基因1229点的扩增引物序列与所述1174位点的扩增引物序列一致15.如权利要求9所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述SLC26A4 基因 2027 位点的扩增引物序列是GGCAAAGTTCCACAATCA 和 ACCAGAACCTTACCACCC16.如权利要求9所述的用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述线粒体DNA基因1494位点的扩增引物序列与所述1555位点的扩增引物序列一致17.ー种用于筛查中国人群耳聋基因的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法步骤如下步骤一，用扩增引物针对耳聋基因进行多重PCR扩增；步骤ニ，对扩增产物进行纯化；步骤三，用延伸引物针对耳聋基因突变位点的扩增和纯化产物进行延伸标记反应和ニ次纯化；步骤四，对二次纯化产物进行毛细管电泳；步骤五，对毛细管电泳结果进行数据采集和分析
技术领域

本发明涉及基因工程技术领域中基因突变检测领域，具体涉及一种中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法
背景技术

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法律状态

专利名称：中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法耳聋是一种严重影响生活质量和交流的常见疾病。全世界现有7亿多人患有中度以上的听力损失，在我国6，100万残疾人口中，听力语言残疾者达2，700万，并以每年新生 3万聋儿的速度增长,其中遗传性NSHL (nonsyndromic hearing loss,非综合征性听力损害)约占40%左右。迄今为止，与非综合征耳聋相关的28个常染色体隐性基因、22个常染色体显性基因、I个X连锁基因已被克隆，而每个基因中又有数目众多的耳聋突变位点，其中以GJB2、SLC26A4基因及mtDNA的突变最为常见，其它型所占比例较小。国内研究人员也针对中国人群耳聋的基因突变类型进行了较大规模的流行病学调查。根据我们对43篇国内不同地区耳聋突变的分子流行病学调研文献的综合分析，统计了 16，704例NSHL患者，上述三个耳聋相关基因的常见突变中GJB2基因突变热点235delC、299-300 delAT、SLC26A4基因突变热点 IVS7-2A — G、2168A — G、mtDNA突变热点 1555A — G、1449C — T共6个突变热点在中国NSHL人群中突变达40%以上，并且存在区域人群突变差巳根据我们对我国苏南地区非综合征型耳聋患者7个耳聋致病基因突变热点的突变频率调查，125例非综合征型耳聋(Nonsyndromic hearing loss, NSHL)患者中,GJB2基因 235delC 突变频率为 24. 0%, 299_300delAT 突变频率为 7. 0% ；SLC26A4 基因 IVS7_2A>G 突变频率为15. 2%, 2168 A>G突变频率为3. 2% ；mtDNA 1555A>G突变频率为4. 8%, 7445 A>G突变频率为0. 8%，未发现mtDNA 3243 A>G位点突变，7个热点综合突变频率为53. 6%，统计结果见表I。此外GJB2基因35位点delG、109位点G — A突变、176-191位点缺失16个碱基，SLC26A4基因1174位点的A — T突变、1229位点的A — G突变、2027位点的T — A突变，线粒体DNA基因1494位点的C — T突变也有较高的突变频率。表I 125例NSHL患者热点突变统计 ^ 本发明公开了一种针对中国人群耳聋基因常见的7个突变位点的一次性定性筛查试剂盒及其使用方法，以GJB2基因235位点的delC和299-300位点delAT，SLC26A4基因2168位点的A→G突变和IVS7-2位点的A→G突变，线粒体DNA基因1555位点的A→G突变、3243位点的A→G突变和7445位点A→G突变共7个突变热点为检测对象，针对每个位点的突变分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的位点同时进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得7个位点的基因型。本发明的筛查方法及试剂盒使用方便，操作简单，成本低，通量高，检测结果直接可靠，适合于中国人群耳聋基因突变的大规模筛查。

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