专利名称：一种抗菌肽脂质体的制备方法抗菌肽(antibacterialpeptide, ABP)又称抗微生物肽 (antimicrobialpeptide, AMP)或肽抗生素(peptide antibiotics),广泛分布于细菌、病毒和各种动植物体内，具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽。抗菌肽是由生物细胞特定基因编码，经特定外界条件诱导产生的一类多肽。抗菌肽作为抵御外界微生物的第一道防线，有着强大而广泛的抗菌功能。抗菌效率高、抗菌谱广，无耐药性。 抗菌肽与常规的抗生素有着较大的差异，抗生素是通过一系列酶合成的产物，而抗菌肽则是某个特定基因编码的产物；在杀菌机制上，抗生素的抗菌一般是作用于几个特殊的受体， 所以细菌容易通过变异对抗生素产生抗性；而抗菌肽抗菌时一般没有特殊的受体，它一般是通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到广谱抗菌的效果，所以抗菌肽的使用不容易使细菌产生抗性和交叉抗性。大量的研究表明，抗菌肽的抗菌活性具有广谱性、高效性、稳定性、 快速杀菌和免疫系统协助等特点，而且，由于抗菌肽分子量小，极易扩散到感染部位，且进入机体后无有害残留。因此，抗菌肽在医疗、畜禽新品种培育、畜禽养殖及畜禽疾病防治上的研究与应用，将具有广阔的应用前景，是消除抗生素污染的重要途径之一。但是抗菌肽进入机体后，存在很容易被消化系统内的蛋白酶水解使其活性丧失的缺点并且在自然条件下也很容易失活。
基于上述原因，本发明提供一种载药量大，药效持久，利用率高，防止活性降低的抗菌肽脂质体的制备方法。本发明一方面提供抗菌肽脂质体的制备方法，以活性抗菌肽为主要成分，辅以包裹主要成分的脂质体为组分配制而成。其中所述活性抗菌肽为抗菌肽固体发酵产物烘干粉；辅料包括包裹活性抗菌肽的脂质体、保护剂。上述所述包裹活性抗菌肽的脂质体是由以下组分组成脂质体膜材 4. 53 9. 87g附加剂1. 0193 2. 221g稳定剂0. 0849 0. 1851g防腐剂0. 0284 0. 0616g。上述组分溶于溶于IOOmL乙醇中。上述所述包裹活性抗菌肽的脂质体各组分比例为脂质体膜材附加剂稳定齐[J 防腐剂=80 18 1.5 0. 5。上述脂质体膜材选自磷脂酰胆碱、脑磷脂、大豆磷脂、卵磷脂、合成二棕榈酰-DL-α-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、合成磷脂酰丝氨酸、神经鞘磷脂中的一种或组合。上述所述附加剂选自胆固醇、十八胺、磷脂酸中的一种或组合。上述所述防腐剂选自尼泊金酯类、氯化苯甲烃铵、乙醇、异丙醇、苯氧乙醇、溴硝基丙二醇、三氯叔丁醇苯甲酸、脱氢乙酸、山梨酸、肉桂酸中的一种或组合。上述所述稳定剂选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硝酸钠、硫代硫酸钠、 抗坏血酸、维生素Ε、没食子酸烷酯、丁羟基茴香醚、丁羟基甲苯、苯甲酸钠、异抗坏血酸、枸橼酸、酒石酸、EDTA、巯基二丙酸中的一种或组合。抗菌肽脂质体的制备方法为抗菌肽脂质体制备方法采用乙醇注入法制备活性抗菌肽脂质体，即定量称取脂质体膜材、附加剂、稳定剂、防腐剂溶于IOOmL乙醇中，超声处理使溶液均勻分散，所得类脂溶液缓慢勻速的注入到IOOmL恒温40°C含保护剂、活性抗菌肽水溶液中，用旋转蒸发仪IOOrpm减压旋转蒸发除去乙醇，得到乳白色混悬液，依次过 0. 45 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜后，冷冻干燥即得抗菌肽前体脂质体。上述所述恒温40°C含保护剂、活性抗菌肽水溶液中各成分含量为抗菌肽固体发酵产物烘干粉15· 2 21. 6% (W/V)保护剂6. 0 9. 0% (W/V)注射用水补至100%(W/V)。上述所述保护剂选自甘露醇、山梨醇、丙三醇、明胶、蔗糖、麦芽糖、右旋糖酐40、海藻糖、乳酸乙酯中的一种或组合。本发明的有益效果是1.脂质体可以提高被包裹药物的稳定性，延长抗菌肽抗活性；2.可以提高抗菌肽被动靶向性，提高药物的生物利用度，减少用量，降低毒副作用；3.抗菌肽脂质体缓慢释放，延缓肾排泄和代谢，从而延长作用时间；4.原料价格低廉，易于获取，利于扩大化生产和运输。甘露醇5. Og蔗糖2. 5g注射用水补至IOOmL该抗菌肽脂质体的配制方法(1)定量称取9. 87g磷脂酰胆碱、2. 221g胆固醇、0. 1851g维生素E、0. 0308g尼泊金乙酯和0. 0308g尼泊金丙酯溶于IOOmL乙醇中，超声处理使溶液均勻分散；(2)定量称取21. 6g抗菌肽固体发酵产物烘干粉、5. Og甘露醇和2. 5g蔗糖溶于 IOOmL注射水中并将其加热到40°C，使其完全溶解并保温；(3)将溶液(1)缓慢均勻的注入到恒温40°C的溶液O)中，用旋转蒸发仪IOOrpm 减压旋转蒸发除去乙醇，得到乳白色混悬液，依次过0. 45 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜后，冷冻干燥即得抗菌肽前体脂质体。实施例2 包裹活性抗菌肽的脂质体组方为组分用量磷脂酰胆碱4.68g胆固醇1. 053g维生素E0. 0878g尼泊金乙酯0. 0293g乙醇IOOmL含保护剂、活性抗菌肽水溶液组方为组分用量抗菌肽固体发酵产物烘干粉16. 8g甘露醇6. Og蔗糖3. Og注射用水补至IOOmL该抗菌肽脂质体的配制方法(1)定量称取4. 68g磷脂酰胆碱、1. 053g胆固醇、0. 0878g维生素E及0. 0293g尼泊金乙酯溶于IOOmL乙醇中，超声处理使溶液进行均勻分散溶解；(2)定量称取16. Sg抗菌肽固体发酵产物烘干粉、6. Og甘露醇和3. Og蔗糖溶于 IOOmL注射水中并将其加热到40°C，使其完全溶解并保温；(3)将溶液⑴缓慢均勻的注入到恒温40°C的溶液O)中，用旋转蒸发仪IOOrpm 减压旋转蒸发除去乙醇，得到乳白色混悬液，依次过0. 45 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜后，冷冻干燥即得抗菌肽前体脂质体。实施例3 包裹活性抗菌肽的脂质体为组分用量脑磷脂4. 53g十八胺1. 0193g维生素E0. 0849g尼泊金乙酯0. 0142g山梨酸0. 0142g乙醇IOOmL含保护剂、活性抗菌肽水溶液组方为组分用量抗菌肽固体发酵产物烘干粉 15. 2g明胶4. Og海藻糖2. Og注射用水补至IOOmL该抗菌肽脂质体的配制方法(1)定量称取4. 53g脑磷脂、1. 0193g十八胺、0. 0849g维生素E、0. 0142g尼泊金乙酯和0. 0142g山梨酸溶于IOOmL乙醇中，超声处理使溶液进行均勻分散溶解；(2)定量称取15. 2g抗菌肽固体发酵产物烘干粉、4. Og明胶和2. Og海藻糖溶于 IOOmL注射水中并将其加热到40°C，使其完全溶解并保温；(3)将溶液⑴缓慢均勻的注入到恒温40°C的溶液O)中，用旋转蒸发仪IOOrpm 减压旋转蒸发除去乙醇，得到乳白色混悬液，依次过0. 45 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜后，冷冻干燥即得抗菌肽前体脂质体。实施例4 包裹活性抗菌肽的脂质体组方为组分用量磷脂酰胆碱6. 53g磷脂酰乙醇胺0. 7346g胆固醇0. 7346g维生素E0. 1224g尼泊金乙酯0. 0204g肉桂酸0. 0204g乙醇IOOmL含保护剂、活性抗菌肽水溶液组方为组分用量抗菌肽固体发酵产物烘干粉 20. Og甘露醇5. Og右旋糖酐402. 5g注射用水补至IOOmL该抗菌肽脂质体的配制方法(1)定量称取6. 53g磷脂酰胆碱、0. 7346g磷脂酰乙醇胺、0. 7346g胆固醇、0. 1224g 维生素E、0. 0204g尼泊金乙酯和0. 0204g肉桂酸溶于IOOmL乙醇中，超声处理使溶液进行均勻分散溶解；(2)定量称取20. Og抗菌肽固体发酵产物烘干粉、5. Og甘露醇和2. 5g右旋糖酐40 溶于IOOmL注射水中并将其加热到40°C，使其完全溶解并保温；6
(3)将溶液(1)缓慢均勻的注入到恒温40°C的溶液O)中，用旋转蒸发仪IOOrpm 减压旋转蒸发除去乙醇，得到乳白色混悬液，依次过0. 45 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜后，冷冻干燥即得抗菌肽前体脂质体。实施例5:包裹活性抗菌肽的脂质体组方为组分用量磷脂酰胆碱5.68g胆固醇1.278g维生素E0. 1065g尼泊金乙酯0. 0178g尼泊金丙酯0. 0178g乙醇IOOmL含保护剂、活性抗菌肽水溶液组方为组分用量抗菌肽固体发酵产物烘干粉 17. 9g甘露醇5g麦芽糖2.5g注射用水补至IOOmL该抗菌肽脂质体的配制方法(1)定量称取5.68g磷脂酰胆碱、1.278g胆固醇、0. 1065g维生素E、0. 0178g尼泊金乙酯和0. 0178g尼泊金丙酯溶于IOOmL乙醇中，超声处理使溶液均勻分散；(2)定量称取17. 9g抗菌肽固体发酵产物烘干粉、5g甘露醇和2. 5g麦芽糖溶于 IOOmL注射水中并将其加热到40°C，使其完全溶解并保温；(3)将溶液⑴缓慢均勻的注入到恒温40°C的溶液O)中，用旋转蒸发仪IOOrpm 减压旋转蒸发除去乙醇，得到乳白色混悬液，依次过0. 45 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜后，冷冻干燥即得抗菌肽前体脂质体。实施例6:包封率测定以实施例1为例，将抗菌肽抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中依次加入相同浓度的抗菌肽水溶液和抗菌肽脂质体混悬液，其中的抗菌肽与连接于固相载体上的相应抗体结合，洗板之后加入生物素化的相应抗菌肽抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入底物(TMB)显色。 底物(TMB)在辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。 颜色的深浅和样品中的抗菌肽呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，由回归方程计算其含量。分别测得脂质体中药物总质量浓度(Ptotal)及离心液中游离药物质量浓度(P free)，根据公式包封率(Ee，% ) = (1-P free/ P total) X100%,测定3批样品的包封率(见表1)，结果药物平均包封率为80. 30%。表1.三批样品的包封率


本发明提供了一种抗菌肽脂质体的制备方法，药用活性成分包括抗菌肽、脂质体膜材附加剂、防腐剂等。它具有包埋率高，制剂工艺稳定，药效稳定，泄露率低等优点。将抗菌肽制备成活性抗菌肽脂质体可以提高抗菌肽的包埋率，提高抗菌肽的活性周期。