专利名称：筛选具有维生素d受体亲和性的化合物的方法 活性维生素D3衍生物，如1α，25-二羟基维生素D3或1α-羟基维生素D3，已作为治疗代谢性骨病如骨质疏松症的药物广泛应用于临床。这些活性维生素D3衍生物已知通过维生素D受体展现生理作用。维生素D受体不仅存在于组织如小肠、骨骼、肾和甲状旁腺中，而且存在于多种细胞中，包括免疫系统细胞和恶性肿瘤细胞。因此，已知活性维生素D3衍生物具有多种生理活性，如(1)调节钙和骨代谢的作用；(2)恶性肿瘤细胞、表皮细胞和上皮细胞增殖的抑制；和(3)免疫系统细胞的调节。然而，已知由活性维生素D3衍生物治疗引起的不利反应是高钙血症，这在临床应用中仍有问题。如果能抑制或从活性维生素D3衍生物所具有的生理作用中选择性去除血钙增多作用，则能生产用于治疗代谢性骨病的出色药物。这些药物是根据不同生理活性产生的新型治疗剂，并不引起不利的反应。迄今已证明活性维生素D3衍生物的血钙增多作用是由下列机制引起的活性维生素D3衍生物与维生素D受体结合形成复合物。该复合物与参与小肠钙吸收的蛋白质(例如，负责肠上皮细胞中钙运输的钙结合蛋白D，或具有将吸收的钙转移至血管的功能的Ca-ATPase)的基因启动区中存在的VDRE结合，诱导基因的表达。因此，这些蛋白质的表达引起肠道的钙吸收。也认为当活性维生素D3衍生物与维生素D受体的复合物与VDRE结合时，出现活性维生素D3衍生物的有用的生理活性。因此，筛选一种具有有限的或没有血钙增多作用而保留其有用的生理活性的化合物被认为是极其困难的。最近，维生素D受体基于抑制其他转录因子转录调节功能的活性的基因表达调节机制已证实存在于转录因子如AP-1复合物或NF-κB家族中(参见Xiao-Peng Yu等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，10990-10994，1995；Hanna Harant等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)250，63-71(1997)；Daniele D’Ambrosio等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)101，1(1998)，252-262；Yasuo Kuroki等人，细胞生理学杂志(Journal of Cellular Physiology)164459-464(1995)；Terri L.Towers等人，生物化学杂志(The Journal of BiologicalChemistry)273，17，10338-10348(1998)；Atsuko Takeuchi等人，免疫学杂志(The Journal of Immunology)1998，160209-218；和Iris Alroy等人，分子与细胞生物学(Molecular and Cellular Biology)15，10，5789-5799(1995))。已提出维生素D受体基于抑制转录因子活性的作用的这种基因表达调节机制完全不同于通常所知的基于维生素D受体与VDRE结合的基因表达调节机制；并且是一种不由结合VDRE介导的作用模式。然而，迄今还没有关于试图在维生素D衍生物中分离维生素D受体相关的、VDRE介导的促进转录活性与对转录因子活性的维生素D受体相关的抑制作用的报道；已证实在转录因子如AP-1复合物或NF-κB家族中具有这种抑制作用。
本发明的一个目的在于提供一种方法，用于筛选具有有限的或没有血钙增多作用而保留其有用的生理活性的维生素D衍生物。
本发明的另一目的在于利用上述筛选方法选择性提供一种具有有限的或没有血钙增多作用而保留其有用的生理活性的维生素D衍生物。
本发明的另一目的在于提供一种治疗与转录因子作用有关的疾病的药物，其活性能被维生素D受体抑制，该药物含有上述维生素D衍生物。
本发明的另一目的在于提供一种施行根据本发明的筛选方法的试剂盒。
本发明的发明者最初证实了维生素D衍生物可不经VDRE介导抑制报道基因的表达。这种作用已通过使用在启动区含有AP-1复合物结合位点且不含VDRE的报道基因载体的报道基因测定，和使用在启动区中含有NF-κB家族结合位点且不含VDRE的报道基因载体的报道基因测定证实。
基于这一发现，发明者推测维生素D衍生物的血钙增多作用可以被降低或者消除，而保留其对疾病的治疗作用，这些疾病的发作或进展与转录因子如AP-1复合物或NF-κB家族的激活有关。这种作用的实现方法是，限制或消除维生素D衍生物的维生素D受体相关的、VDRE介导的转录促进活性，而同时保留或增强维生素D衍生物对其他转录因子的维生素D受体相关的转录抑制作用，这种作用的特征在于对AP-1复合物或NF-κB家族活性的非VDRE介导的抑制作用。换句话说，通过相对于VDRE介导的转录促进活性而言选择性提高抑制转录因子活性的作用，能限制或消除维生素D衍生物的不利的血钙增多作用，而保留其对疾病的治疗作用。
例如，对于骨质疏松症，公认破骨细胞的过量形成是其发病原因。已知在作为转录因子的AP-1复合物或NF-κB家族功能缺陷的小鼠中，破骨细胞的形成受到抑制。因此，预期这些转录因子活性的抑制对骨质疏松症具有治疗作用。假定活性维生素D衍生物对骨质疏松症的治疗作用可能归因于维生素D受体与VDRE结合以促进基因转录的作用模式。然而，现在认为这种治疗作用是通过维生素D受体相关的作用引起的，这种作用可抑制转录因子如AP-1复合物或NF-κB家族的活性。
这不仅适用于维生素D衍生物，还适用于具有维生素D受体亲和性的物质。
基于这些新概念，发明者进行了研究来试图发展一种筛选系统，用于寻找没有不利的作用但保留其有用的生理活性的维生素D衍生物。于是，发明者利用使用含有VDRE的报道基因载体的报道基因测定法，测定了维生素D衍生物的VDRE介导的转录促进活性(导致血钙增多作用的机制)。发明者也通过使用在启动区中含有AP-1复合物结合位点且不含VDRE的报道基因载体的报道基因测定法，并通过使用在启动区中含有NF-κB家族结合位点且不含VDRE的报道基因载体的报道基因测定法，测定了维生素D衍生物对转录因子活性的抑制作用(生理活性)，其特征在于对AP-1复合物或NF-κB家族的抑制活性。通过这些研究，发明者研发了一种实验筛选系统，其中发现了一种在抑制转录因子作用方面比1α，25-二羟基维生素D3有更高选择性的衍生物。
实际上，利用本发明的筛选系统发现了一种与1α，25-二羟基维生素D3相比在抑制转录因子作用方面有极高选择性的维生素D衍生物。用骨质疏松模型评估了该衍生物作为药物的效用。证实该衍生物具有药物活性，可用于治疗骨质疏松症，而不影响尿钙排泄水平，也不提高血钙水平。本发明即是根据这些发现完成的。
根据本发明，提供了一种筛选具有维生素D受体亲和性的化合物的方法，其包括测定测试化合物的维生素D受体相关的、VDRE介导的转录促进活性，和测试化合物对转录因子活性的维生素D受体相关的抑制作用，和筛选相对于VDRE介导的转录活性的促进而言，更强烈地抑制转录因子活性的化合物。
在本发明中，具有维生素D受体亲和性的化合物优选地是一种维生素D衍生物。
在本发明中，转录因子的一个优选的例子是AP-1复合物或NF-κB家族。
在本发明的模型中，利用报道基因测定系统测定VDRE介导的转录促进活性。
在本发明的模型中，利用报道基因测定系统测定抑制转录因子活性的作用。
在本发明的模型中，测定测试化合物和标准化合物的VDRE介导的转录促进活性和转录因子活性的抑制作用。测试化合物应满足下列公式(测试化合物对转录因子活性的抑制作用相比于标准化合物的抑制作用的相对值)/(测试化合物的VDRE介导的转录促进活性相比于标准化合物的转录促进活性的相对值)＞1；特别优选地，选择满足下列公式的测试化合物(测试化合物对转录因子活性的抑制作用相比于标准化合物的抑制作用的相对值)/(测试化合物的VDRE介导的转录促进活性相比于标准化合物的转录促进活性的相对值)≥10，作为对转录因子活性的抑制作用比VDRE介导的转录促进活性更强的化合物。
在本发明的一种优选模型中，标准化合物是1α，25-二羟基维生素D3。
根据本发明的另一方面，提供了一种具有维生素D受体亲和性的化合物，其特征在于利用上述筛选方法选择该化合物，该化合物对转录因子活性的抑制作用比该化合物的VDRE介导的转录促进活性更强。
筛选的具有维生素D受体亲和性的化合物优选地是一种维生素D衍生物。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于转录因子相关疾病的治疗药物。转录因子的活性被维生素D受体抑制，该治疗药物含有一种用本发明的筛选方法筛选且具有维生素D受体亲和性的化合物。
转录因子相关疾病的一个非限制性例子是代谢性骨病，特别是骨质疏松症。
与本发明的治疗药物靶定的参与转录因子相关疾病的转录因子的一个优选例子是AP-1复合物或NF-κB家族。
本发明的治疗药物能用作AP-1复合物活性的维生素D受体介导的抑制剂，或用作NF-κB家族活性的维生素D受体介导的抑制剂。
根据本发明的另一方面，提供了一种治疗骨质疏松症的药物，其含有满足下列公式的化合物作为活性成分当用本发明的筛选方法测定VDRE介导的转录促进活性和对转录因子活性的抑制作用时，(测试化合物对转录因子活性的抑制作用相比于标准化合物的抑制作用的相对值)/(测试化合物的VDRE介导的转录促进活性相比于标准化合物的转录促进活性的相对值)＞1，更优选地≥10。该化合物优选地是一种用下列通式(1)表示的维生素D衍生物 其中X代表氧原子或硫原子，R1代表任选地由羟基或保护的羟基或-COR12基团取代的(其中R12是烷基、芳基或烷氧基)的饱和或不饱和脂肪族烃基，R2代表-OR9或氢原子，R9和R10相同或不同，且各自代表氢原子或保护基。进一步优选地，R2是-OR9。
优选地，R1是任选地由羟基取代的C1-15饱和脂肪烃基，或任选地由羟基取代的C2-15不饱和脂肪烃基。进一步优选地，R1是基团(2) 其中R3和R4相同或不同，且各自代表氢原子或羟基，或同时含氧原子以表示为＝O，前提是R3和R4不同时是羟基，R5和R6各自代表氢原子或羟基，前提是R6与R3或R4不同时是羟基，m代表1-4的整数，n代表0-2的整数，或R1是基团(3) 其中R5和R6相同或不同，且各自代表氢原子或羟基，R7和R8各自代表氢原子或一起代表共价键，p代表1-3的整数，q代表0-2的整数。甚至更优选地，R1是3-羟基-3-甲基丁基。
在通式(1)代表的维生素D衍生物中，20位可以是S构型或R构型。
通式(1)代表的维生素D衍生物的例子有1，3-二羟基-20-(3-羟基-3-甲基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(S)-(3-羟基-3-甲基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-(3-羟基-3-甲基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-((E)-4-羟基-4-甲基-2-戊烯基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-((E)-4-乙基-4-羟基-2-己烯基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(S)-(2-羟基-2-甲基丙基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-(2-羟基-2-甲基丙基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(S)-{2(S)-羟基-3-甲基丁氧基}-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(S)-{2(R)-羟基-3-甲基丁氧基}-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(S)-(2-乙基-2-羟基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-(2-乙基-2-羟基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-(4-乙基-4-羟基-2-己炔氧基)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯和1α，3β-二羟基-20(R)-{3-乙基-2(S)-羟基戊基硫代}-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于施行本发明的筛选方法的试剂盒，其包括(a)一种用于评价对转录因子活性的抑制作用的载体，该载体含有转录因子的结合序列和一种报道基因；(b)一种用于评价VDRE-介导的转录促进活性的载体，该载体含有VDRE序列和报道基因；(c)希望时，一种维生素D受体表达载体，和
(d)一种用于检测该报道基因产物的试剂。
附图简述

图1显示VDRE-介导的转录促进活性和对AP-1复合物的抑制活性的筛选结果。
图2显示VDRE-介导的转录促进活性和对NF-κB家族的抑制活性的筛选结果。
图3(a)-3(f)是显示维生素D衍生物(皮下施用)对尿钙排泄、血钙浓度和骨矿物质密度作用的图。
图4(a)-4(c)是显示维生素D衍生物(口服)对尿钙排泄、血钙浓度和骨矿物质密度作用的图。
图5(a)-5(d)是显示维生素D衍生物(口服)对血钙值、尿脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline)(Dpyr)排泄、骨矿物质密度和骨强度作用的图。
实施本发明的最佳模式在下文中将描述本发明的更具体模式和实施本发明的方法，但本发明不受下列描述所限制。
用本发明的方法筛选的物质没有限制，可以是具有维生素D受体亲和性的任何化合物。这些物质通常是维生素D衍生物，特别是维生素D3衍生物，特别优选地是活性维生素D3衍生物。维生素D衍生物的非限制性例子是上述通式(1)所表示的维生素D衍生物。
除非另外说明，否则本发明使用的术语具有下列含义饱和脂肪族烃基通常是指含有1-15个碳原子的直链或支链烷基。例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。优选的例子是3-甲基丁基、3-乙基戊基、4-甲基戊基、3-(正丙基)己基、4-乙基己基、5-甲基己基、6-甲基庚基、5-乙基庚基和4-(正丙基)庚基。更优选的例子是3-甲基丁基、3-乙基戊基和4-甲基戊基。
不饱和脂肪族烃基通常是指含有2-15个碳原子的直链或支链链烯基或炔基。例子包括2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、2-丙炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、2-庚炔基、3-庚炔基、4-庚炔基、5-庚炔基和6-庚炔基。其任一氢原子均可被一个或多个上述烷基取代，双键可存在顺式或反式结构。优选的例子是4-甲基-2-戊炔基、4-乙基-2-己炔基、4-甲基-2-戊烯基和4-乙基-2-己烯基。
任选地可被羟基取代的饱和或不饱和脂肪族烃基是指上述饱和或不饱和烃基，其任一氢原子均可被一个或多个羟基取代。取代羟基的数量的例子是0、1、2和3，优选地是1或2，更优选地是1。具体例子不仅有上述脂肪族烃基，也包括饱和脂肪族烃基，如2-羟基-2-甲基丙基、3-羟基-2-甲基丙基、2，3-二羟基-2-甲基丙基、2-乙基-2-羟基丁基、2-乙基-3-羟基丁基、2-乙基-2，3-二羟基丁基、2-羟基-2-(正丙基)戊基、3-羟基-2-(正丙基)戊基、2，3-二羟基-2-(正丙基)戊基、2-羟基-3-甲基丁基、3-羟基-3-甲基丁基、4-羟基-3-甲基丁基、2，3-二羟基-3-甲基丁基、2，4-二羟基-3-甲基丁基、3，4-二羟基-3-甲基丁基、3-乙基-2-羟基戊基、3-乙基-3-羟基戊基、3-乙基-4-羟基戊基、3-乙基-2，3-二羟基戊基、3-乙基-2，4-二羟基戊基、3-乙基-3，4-二羟基戊基、2-羟基-3-(正丙基)己基、3-羟基-3-(正丙基)己基、4-羟基-3-(正丙基)己基、2，3-二羟基-3-(正丙基)己基、2，4-二羟基-3-(正丙基)己基、3，4-二羟基-3-(正丙基)己基、3-羟基-4-甲基戊基、4-羟基-4-甲基戊基、5-羟基-4-甲基戊基、3，4-二羟基-4-甲基戊基、3，5-二羟基-4-甲基戊基、4，5-二羟基-4-甲基戊基、4-乙基-3-羟基己基、4-乙基-4-羟基己基、4-乙基-5-羟基己基、4-乙基-3，4-二羟基己基、4-乙基-3，5-二羟基己基、4-乙基-4，5-二羟基己基、3-羟基-4-(正丙基)庚基、4-羟基-4-(正丙基)庚基、5-羟基-4-(正丙基)庚基、3，4-二羟基-4-(正丙基)庚基、3，5-二羟基-4-(正丙基)庚基、4，5-二羟基-4-(正丙基)庚基、4-羟基-5-甲基己基、5-羟基-5-甲基己基、6-羟基-5-甲基己基、4，5-二羟基-5-甲基己基、4，6-二羟基-5-甲基己基、5，6-二羟基-5-甲基己基、5-乙基-4-羟基庚基、5-乙基-5-羟基庚基、5-乙基-6-羟基庚基、5-乙基-4，5-二羟基庚基、5-乙基-4，6-二羟基庚基、5-乙基-5，6-二羟基庚基、4-羟基-5-(正丙基)辛基、5-羟基-5-(正丙基)辛基、6-羟基-5-(正丙基)辛基、4，5-二羟基-5-(正丙基)辛基、4，6-二羟基-5-(正丙基)辛基、5，6-二羟基-5-(正丙基)辛基、5-羟基-6-甲基庚基、6-羟基-6-甲基庚基、7-羟基-6-甲基庚基、5，6-二羟基-6-甲基庚基、5，7-二羟基-6-甲基庚基、6，7-二羟基-6-甲基庚基、6-乙基-5-羟基辛基、6-乙基-6-羟基辛基、6-乙基-7-羟基辛基、6-乙基-5，6-羟基辛基、6-乙基-5，7-羟基辛基、6-乙基-6，7-羟基辛基、5-羟基-6-(正丙基)壬基、6-羟基-6-(正丙基)壬基、7-羟基-6-(正丙基)壬基、5，6-二羟基-6-(正丙基)壬基、5，7-二羟基-6-(正丙基)壬基和6，7-二羟基-6-(正丙基)壬基；4-羟基-4-甲基-2-戊烯基、5-羟基-4-甲基-2-戊烯基、4，5-二羟基-4-甲基-2-戊烯基、4-乙基-4-羟基-2-己烯基、4-乙基-5-羟基-2-己烯基、4-乙基-4，5-二羟基-2-己烯基、4-羟基-4-(正丙基)-2-庚烯基、5-羟基4-(正丙基)-2-庚烯基、4，5-二羟基-4-(正丙基)-2-庚烯基、5-羟基-5-甲基-3-己烯基、6-羟基-5-甲基-3-己烯基、5，6-二羟基-5-甲基-3-己烯基、5-乙基-5-羟基-3-庚烯基、5-乙基-6-羟基-3-庚烯基、5-乙基-5，6-二羟基-3-庚烯基、5-羟基-5-(正丙基)-3-辛烯基、6-羟基-5-(正丙基)-3-辛烯基、5，6-二羟基-5-(正丙基)-3-辛烯基、4-羟基-5-甲基-2-己烯基、5-羟基-5-甲基-2-己烯基、6-羟基-5-甲基-2-己烯基、4，5-二羟基-5-甲基-2-己烯基、4，6-二羟基-5-甲基-2-己烯基、5，6-二羟基-5-甲基-2-己烯基、5-乙基-4-羟基-2-庚烯基、5-乙基-5-羟基-2-庚烯基、5-乙基-6-羟基-2-庚烯基、5-乙基-4，5-二羟基-2-庚烯基、5-乙基-4，6-二羟基-2-庚烯基、5-乙基-5，6-二羟基-2-庚烯基、4-羟基-5-(正丙基)-2-辛烯基、5-羟基-5-(正丙基)-2-辛烯基、6-羟基-5-(正丙基)-2-辛烯基、4，5-二羟基-5-(正丙基)-2-辛烯基、4，6-二羟基-5-(正丙基)-2-辛烯基、5，6-二羟基-5-(正丙基)-2-辛烯基、6-羟基-6-甲基-4-庚烯基、7-羟基-6-甲基-4-庚烯基、6，7-二羟基-6-甲基-4-庚烯基、6-乙基-6-羟基-4-辛烯基、6-乙基-7-羟基-4-辛烯基、6-乙基-6，7-二羟基-4-辛烯基、6-羟基-6-(正丙基)-4-壬烯基、7-羟基-6-(正丙基)-4-壬烯基、6，7-二羟基-6-(正丙基)-4-壬烯基、5-羟基-6-甲基-3-庚烯基、6-羟基-6-甲基-3-庚烯基、7-羟基-6-甲基-3-庚烯基、5，6-二羟基-6-甲基-3-庚烯基、5，7-二羟基-6-甲基-3-庚烯基、6，7-二羟基-6-甲基-3-庚烯基、6-乙基-5-羟基-3-辛烯基、6-乙基-6-羟基-3-辛烯基、6-乙基-7-羟基-3-辛烯基、6-乙基-5，6-二羟基-3-辛烯基、6-乙基-5，7-二羟基-3-辛烯基、6-乙基-6，7-二羟基-3-辛烯基、5-羟基-6-(正丙基)-3-壬烯基、6-羟基-6-(正丙基)-3-壬烯基、7-羟基-6-(正丙基-3-壬烯基、5，6-二羟基-6-(正丙基)-3-壬烯基、5，7-二羟基-6-(正丙基)-3-壬烯基、6，7-二羟基-6-(正丙基)-3-壬烯基、5-羟基-6-甲基-2-庚烯基、6-羟基-6-甲基-2-庚烯基、7-羟基-6-甲基-2-庚烯基、5，6-二羟基-6-甲基-2-庚烯基、5，7-二羟基-6-甲基-2-庚烯基、6，7-二羟基-6-甲基-2-庚烯基、6-乙基-5-羟基-2-辛烯基、6-乙基-6-羟基-2-辛烯基、6-乙基-7-羟基-2-辛烯基、6-乙基-5，6-二羟基-2-辛烯基、6-乙基-5，7-二羟基-2-辛烯基、6-乙基-6，7-二羟基-2-辛烯基、5-羟基-6-(正丙基)-2-壬烯基、6-羟基-6-(正丙基)-2-壬烯基、7-羟基-6-(正丙基)-2-壬烯基、5，6-二羟基-6-(正丙基)-2-壬烯基、5，7-二羟基-6-(正丙基)-2-壬烯基、6，7-二羟基-6-(正丙基)-2-壬烯基、4-羟基-4-甲基-2-戊炔基、5-羟基-4-甲基-2-戊炔基、4，5-二羟基-4-甲基-2-戊炔基、4-乙基-4-羟基-2-己炔基、4-乙基-5-羟基-2-己炔基、4-乙基-4，5-二羟基-2-己炔基、4-羟基-4-(正丙基)-2-庚炔基、4-羟基-4-(正丙基)-2-庚炔基、5-羟基-4-(正丙基)-2-庚炔基、4，5-二羟基-4-(正丙基)-2-庚炔基、5-羟基-5-甲基-3-己炔基、6-羟基-5-甲基-3-己炔基、5，6-二羟基-5-甲基-3-己炔基、5-乙基-5-羟基-3-庚炔基、5-乙基-6-羟基-3-庚炔基、5-乙基-5，6-二羟基-3-庚炔基、5-羟基-5-(正丙基)-3-辛炔基、6-羟基-5-(正丙基)-3-辛炔基、5，6-二羟基-5-(正丙基)-3-辛炔基、4-羟基-5-甲基-2-己炔基、5-羟基-5-甲基-2-己炔基、6-羟基-5-甲基-2-己炔基、4，5-二羟基-5-甲基-2-己炔基、4，6-二羟基-5-甲基-2-己炔基、5，6-二羟基-5-甲基-2-己炔基、5-乙基-4-羟基-2-庚炔基、5-乙基-5-羟基-2-庚炔基、5-乙基-6-羟基-2-庚炔基、5-乙基-4，5-二羟基-2-庚炔基、5-乙基-4，6-二羟基-2-庚炔基、5-乙基-5，6-二羟基-2-庚炔基、4-羟基-5-(正丙基)-2-辛炔基、5-羟基-5-(正丙基)-2-辛炔基、6-羟基-5-(正丙基)-2-辛炔基、4，5-二羟基-5-(正丙基)-2-辛炔基、4，6-二羟基-5-(正丙基)-2-辛炔基、5，6-二羟基-5-(正丙基)-2-辛炔基、6-羟基-6-甲基-4-庚炔基、7-羟基-6-甲基-4-庚炔基、6，7-二羟基-6-甲基-4-庚炔基、6-乙基-6-羟基-4-辛炔基、6-乙基-7-羟基-4-辛炔基，6-乙基-6，7-二羟基-4-辛炔基、6-羟基-6-(正丙基)-4-壬炔基、7-羟基-6-(正丙基)-4-壬炔基、6，7-二羟基-6-(正丙基)-4-壬炔基、5-羟基-6-甲基-3-庚炔基、6-羟基-6-甲基-3-庚炔基、7-羟基-6-甲基-3-庚炔基、5，6-二羟基-6-甲基-3-庚炔基、5，7-二羟基-6-甲基-3-庚炔基、6，7-二羟基-6-甲基-3-庚炔基、6-乙基-5-羟基-3-辛炔基、6-乙基-6-羟基-3-辛炔基、6-乙基-7-羟基-3-辛炔基、6-乙基-5，6-二羟基-3-辛炔基、6-乙基-5，7-二羟基-3-辛炔基、6-乙基-6，7-二羟基-3-辛炔基、5-羟基-6-(正丙基)-3-壬炔基、6-羟基-6-(正丙基)-3-壬炔基、7-羟基-6-(正丙基)-3-壬炔基、5，6-二羟基-6-(正丙基)-3-壬炔基、5，7-二羟基-6-(正丙基)-3-壬炔基、6，7-二羟基-6-(正丙基)-3-壬炔基、5-羟基-6-甲基-2-庚炔基、6-羟基-6-甲基-2-庚炔基、7-羟基-6-甲基-2-庚炔基、5，6-二羟基-6-甲基-2-庚炔基、5，7-二羟基-6-甲基-2-庚炔基、6，7-二羟基-6-甲基-2-庚炔基、6-乙基-5-羟基-2-辛炔基、6-乙基-6-羟基-2-辛炔基、6-乙基-7-羟基-2-辛炔基、6-乙基-5，6-二羟基-2-辛炔基、6-乙基-5，7-二羟基-2-辛炔基、6-乙基-6，7-二羟基-2-辛炔基、5-羟基-6-(正丙基)-2-壬炔基、6-羟基-6-(正丙基)-2-壬炔基、7-羟基-6-(正丙基)-2-壬炔基、5，6-二羟基-6-(正丙基)-2-壬炔基、5，7-二羟基-6-(正丙基)-2-壬炔基和6，7-二羟基-6-(正丙基)-2-壬炔基。优选的例子是3-羟基-3-甲基丁基、4-羟基-3-甲基丁基、3，4-二羟基-3-甲基丁基、3-乙基-3-羟基戊基、3-乙基-4-羟基戊基、3-乙基-3，4-二羟基戊基、4-羟基-4-甲基戊基、5-羟基-4-甲基戊基、4，5-二羟基-4-甲基戊基、4-乙基-4-羟基己基、4-乙基-5-羟基己基、4-乙基-4，5-二羟基己基、4-羟基-4-甲基-2-戊烯基、5-羟基-4-甲基-2-戊烯基、4，5-二羟基-4-甲基-2-戊烯基、4-乙基-4-羟基-2-己烯基、4-乙基-5-羟基-2-己烯基、4-乙基-4，5-二羟基-2-己烯基、4-羟基-4-甲基-2-戊炔基、5-羟基-4-甲基-2-戊炔基、4，5-二羟基-4-甲基-2-戊炔基、4-乙基-4-羟基-2-己炔基、4-乙基-5-羟基-2-己炔基和4-乙基-4，5-二羟基-2-己炔基。
在此，烷基通常是指含有1-15个碳原子、优选地1-8个碳原子的直链或支链烷基。芳基通常是指含有6-20个碳原子、优选地6-14个碳原子的芳基。烷氧基通常是指含有1-15个碳原子、优选地1-8个碳原子的直链或支链烷氧基。
保护基包括，例如酰基、取代的甲硅烷基和取代的烷基，优选地是酰基或取代的甲硅烷基。
酰基是指取代的羰基，其中羰基的取代基是指的是氢原子，任选取代的低级烷基、任选取代的芳基、任选取代的低级烷氧基、任选取代的芳氧基或任选取代的芳烷氧基。酰基优选地是指甲酰基、低级烷基羰基、任选地含有取代基的苯基羰基、低级烷氧基羰基或任选取代的苯基烷氧基羰基，更优选地是甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、新戊酰基、苯甲酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基或苄氧基羰基。
取代的甲硅烷基是指被任选地含一个或多个取代基的低级烷基或被任选的取代芳基取代的甲硅烷基。优选地，取代的甲硅烷基是指三取代的甲硅烷基。取代的甲硅烷基的优选的例子是三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基。
取代的烷基是指被一个或多个取代基取代的烷基。在此，取代基的优选的例子是任选取代的烷氧基和任选取代的芳基，特别是任选取代的烷氧基。被任选取代的烷氧基如烷氧基取代的取代烷基的例子是甲氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基和四氢吡喃-2-基。取代基的例子包括卤素原子、氰基、硝基、氨基、羟基、烷基、烷氧基、酰氧基和磺酰基。
在本发明的通式(1)所表示的化合物中，含有硫原子作为X的化合物可通过如日本未审专利公开号1998-231284所述的方法制备。
为使这些化合物成为根据本发明的治疗骨质疏松症的药物的活性成分，优选地可使用1，3-二羟基-20-(3-羟基-3-甲基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(S)-(3-羟基-3-甲基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-(3-羟基-3-甲基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-((E)-4-羟基-4-甲基-2-戊烯基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-((E)-4-乙基-4-羟基-2-己烯基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(S)-(2-羟基-2-甲基丙基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-(2-羟基-2-甲基丙基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(S)-{2(S)-羟基-3-甲基丁氧基}-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(S)-{2(R)-羟基-3-甲基丁氧基}-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(S)-(2-乙基-2-羟基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-(2-乙基-2-羟基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯、1α，3β-二羟基-20(R)-(4-乙基-4-羟基-2-己炔氧基)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯和1α，3β-二羟基-20(R)-{3-乙基-2(S)-羟基戊基硫代}-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯。
在本发明的筛选方法中，测定测试化合物促进转录的VDRE介导的活性。VDRE是DNA上的一种调节序列。当与配体(例如维生素D衍生物)结合的维生素D受体与VDRE结合并作用时，激活位于VDRE下游的基因的表达。例如，高钙血症——维生素的一种有害反应，被认为是通过VDRE引起的。VDRE的DNA碱基序列可因生物种而不同，甚至在相同生物种中因所调节的靶基因的类型而不同。任何VDRE序列都可在本发明中使用。在后面提供的实施例中，利用使用小鼠骨桥蛋白基因的VDRE序列的报道基因测定系统进行筛选，但这只是VDRE序列的一个例子。VDRE序列的其他例子有大鼠骨钙蛋白基因、人骨钙蛋白基因、大鼠钙结合蛋白-D9k基因、人钙结合蛋白-D9k基因、小鼠钙结合蛋白-D28k基因、大鼠24-羟化酶基因、人24-羟化酶基因和鸡整联蛋白β3基因。它们也能在本发明的方法中使用。
在本发明的筛选方法中，测定测试化合物对转录因子活性的抑制作用。转录因子通常是指核中由DNA向RNA的转录反应所必需的蛋白质因子。在本发明中，转录因子特别是指可识别特定基因下游存在的特定碱基序列，并与该序列结合，从而控制该基因表达的因子。本发明的筛选方法中使用的转录因子没有类型限制，只要其活性可被维生素D受体抑制即可。转录因子的例子有AP-1复合物、NF-κB家族、Sp1家族、Oct家族、ATF/CREB家族、NF-AT家族、STAT家族和Egr家族。优选的例子是在本说明书实施例(将在后面提供)中使用的AP-1复合物和NF-κB家族。
AP-1(激活蛋白-1)复合物是由Jun家族的同型二聚体或Fos家族和Jun家族的杂二聚体组成的转录因子。AP-1复合物可与TRE序列结合，后者是一种AP-1结合位点。对于Jun家族，已鉴定了c-Jun、JunB和JunD。对于Fos家族，已鉴定了c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2。
至于含有AP-1结合位点的基因，已知细胞因子，如白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-5、GM-CSF和TNF-α，粘附分子，如ICAM-1，和酶，如胶原酶。使用这些基因任一种的AP-1结合位点的报道基因测定法也是可用的。AP-1结合位点的DNA碱基序列可因生物种而不同，甚至在相同生物种中因所调节的靶基因的类型而不同。AP-1结合位点的任何序列都可在本发明中使用。
NF-κB(核因子-κB)家族是一种由Rel家族的二聚体组成，并可与κB序列(NF-κB结合位点)结合的转录因子。对于Rel家族，已鉴定了NF-κBp50、NF-κBp52、NF-κBp65(RelA)、c-Rel和RelB。
至于含有NF-κB结合位点的基因，已知细胞因子，如白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8和TNF-α，和粘附分子，如ICAM-1和VCAM-1。使用这些基因任一种的NF-κB结合位点的报道基因测定法也是可用的。NF-κB结合位点的DNA碱基序列可因生物种而不同，甚至在相同生物种中因所调节的靶基因的类型而不同。NF-κB结合位点的任何序列都可在本发明中使用。
本发明的筛选方法的一个特征在于其测定维生素D受体是否显示对转录因子活性的抑制作用的能力。然而，根据所使用的转录因子，维生素D受体可显示激活作用(活性促进作用)，而不是对活性的抑制作用。因此当使用这种转录因子时，将测定活性促进作用而不是活性抑制作用。这种测定也在本发明的范围之内。
在上述转录因子中，例如已知AP-1复合物可与AP-1结合位点结合，而激活位于其下游的基因的表达，从而引起骨破坏。因此，如果AP-1复合物的激活能被与维生素D衍生物结合的维生素D受体抑制，则预期可抑制能引起骨破坏的上述基因的表达。如果已鉴定了可能与某些疾病(如骨破坏或炎症)的发作或进展有关的基因表达的激活因子，并发现该激活因子的作用可被维生素D受体抑制，则通过用本发明的筛选方法筛选对激活因子的抑制活性的选择性比VDRE介导的转录促进活性更高的化合物(即，相对于VDRE介导的转录促进活性，对转录因子活性的抑制作用更强的化合物)，能发展具有较低有害作用的有益的药物。因此，本发明的转录因子优选地是与疾病如骨破坏或炎症的发作或进展有关的因子。
测定VDER介导的转录促进活性和对转录因子活性的抑制作用可通过本领域所知的方法进行，该方法不是限制性的。优选地，指定报道基因测定法。报道基因测定法是指这样一种方法，包括，例如构建由按顺序连接在一起的VDRE序列、启动子序列和优选的报道基因组成的每一种载体，和维生素D受体的表达载体；用这些载体同时转染合适的宿主；加入测试物质，培养转染细胞；测定细胞中表达的报道基因的量，来估计所测物质的VDRE介导的转录促进活性。
用含报道基因的载体转染的宿主的类型无限制，本领域的任何技术人员都能在常规用途中随意选择任何优选的宿主。宿主细胞的非限制性例子有人源细胞，如Jurkat细胞、HeLa细胞、HepG2、CaCO-2、SaOS和K562；猴源细胞，如CV-1、COS-1和COS-7；小鼠来源的细胞，如NIH3T3、L929、F9和MC-3T3-E1；大鼠来源的细胞，如PC-12和ROS17/2.8；和仓鼠来源的细胞，如CHO-K1和BHK-21。
向宿主中转染载体的方法没有限制，本领域技术人员能在常用的方法中随意选择。转染方法的非限制性例子有磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖转染、电穿孔和脂转染。
报道基因是整合到DNA中用来研究启动子或增强子转录活性的标记基因。其没有限制，可以是能测定其表达量的任何基因。通常优选易于检测且可定量测定的基因。例如，优选催化显色或发光反应的酶的基因。在这种情况下，表达的酶量，即转录促进活性，能通过向细胞裂解液中加入显色反应底物并测量显色程度来测定。此外，也能用抗体通过ELISA等通过定量测定蛋白质来测定报道基因的表达量。
报道基因的例子有CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因、Luc(萤光素酶)基因、β-Gal(β-半乳糖苷酶)基因、hGH(分泌型人生长因子)基因、SEAP(人分泌型碱性磷酸酶)基因、GFP(绿色荧光蛋白)基因和GUS(β-葡糖醛酸酶)基因。
在使用CAT基因作为报道基因的CAT测定中，通过转染等方法向细胞中导入报道基因载体引起瞬时表达，在该载体中，测定其转录活性的调节区的碱基序列与CAT基因上游区连接。一般在12-72小时后制备细胞提取物，并向其中加入乙酰辅酶A和氯霉素进行反应。用薄层层析等方法分离并鉴定乙酰化氯霉素。即，根据CAT测定，基因的转录活性测定为乙酰化氯霉素的酶活性。
萤光素酶是可催化下列通式表示的发光反应的发光酶的总称萤光素＋O2→氧化荧光素＋光萤光素酶作为报道基因的应用能引起已加入底物和氧的细胞提取物的发光反应，并能通过测定光发射程度估计萤光素酶的表达量。
上述报道基因测定能用本领域技术人员所知的常规方法进行，如S.K.Nordeen，生物技术(Biotechniques)6，454-456(1988)所述。此外，也可利用从Boehringer Mannheim Biochemicals、Clontech LaboratoriesInc.或Promega公司购得的报道基因测定试剂，按照所附的说明书容易且方便地进行报道基因测定法。
评价转录促进活性或对转录因子活性的抑制作用的备择方法包括，例如，凝胶移位试验、连缀(run-on)分析和失控(run-off)分析。
凝胶移位试验是一种研究DNA结合因子的简易、方便、有效的方法。其原理如下DNA与DNA结合因子反应后，用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。蛋白质结合DNA的迁移率低于蛋白质未结合DNA的迁移率。因此，用标记DNA检测该结合因子。
连缀分析也是一种研究特定基因转录活性的方法。使用从细胞中分离的核，在体外进行转录。在此分析中，不发生从转录起点的新的合成，而只观察到涉及RNA延伸的合成反应，为RNA链的延长，其中已在细胞状态中起始转录。因此，用分离的核，以系统中的放射性同位素标记转录产物，并利用探针从标记RNA中选择性检测所研究的基因。根据该方法，测定分离特定基因核时的转录活性。这样，经过一定时间的转录活性的改变和转录的相对量可进行比较研究。
失控分析也是一种体外转录法，其线性化模板DNA以合成固定长度的转录物。模板DNA是可被限制酶在转录起点几百个碱基下游处酶切的DNA。当线性模板DNA用于体外转录时，从模板DNA的切割位点处分离下RNA聚合酶，终止转录反应。于是形成固定长度的RNA。这时，在反应中掺入标记的核糖核苷酸以标记RNA。电泳后，制备放射自显影图，并测定RNA的量。
在本发明的筛选方法中，选择对转录因子活性的抑制作用比VDRE介导的转录促进活性更强的化合物。这是基于以下的预测有用的生理活性，如骨量增加作用，在没有或有最小血钙增加作用，即维生素D衍生物的不利反应的情况下发生。这是因为对转录因子活性的抑制作用似乎比VDRE介导的转录促进活性更强。因此，根据将要选择的化合物的用途，能随意选择为筛选设定的对转录因子活性的抑制作用的选择性程度，并且不应限于特定的值。
在该筛选方法的一种优选模式中，能用标准物质作为评估抑制转录因子活性的选择性的参照。标准物质的种类没有限制，必要时可使用任何物质。例如，1α，25-二羟基维生素D3可用作标准物质，并能选择对转录因子活性的抑制作用的选择性比标准物质更高的化合物。这样，能找到没有不利反应的有益化合物。
特别是当用本发明的筛选方法测定VDRE介导的转录促进活性或对转录因子活性的抑制作用时，通常测定每种测试物质的EC50值或IC50值，由此能估计每种测试物质的VDRE介导的转录促进活性或对转录因子活性的抑制作用。根据下列公式表示的值估计对转录因子活性的抑制作用的选择性[测试化合物对转录因子活性的抑制作用相比于标准物质(如1α，25-二羟基维生素D3)的抑制作用的相对值]/[测试化合物的VDRE介导的转录促进活性相比于标准物质(如1α，25-二羟基维生素D3)的转录促进活性的相对值]以上的值一般高于1、更优选地10或10以上的所测化合物，可评价为对转录因子活性的抑制作用的选择性高于标准物质(如1α，25-二羟基维生素D3)的化合物。
根据本发明，提供了一种用本发明的筛选方法筛选的，具有维生素D受体亲和性的新型化合物。这种化合物可用作药物来治疗转录因子的激活对其发作或进展起作用的疾病。
其发病或进展与转录因子的激活有关的疾病的例子包括代谢性骨病(如骨质疏松症、肾性骨营养不良)、多种炎症(如类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘、动脉硬化、器官移植)、多种肿瘤(如结肠癌、乳癌、ATL)、糖尿病和心肌梗死。
当用通过本发明的筛选方法筛选的化合物作为这些疾病的治疗药物时，其剂型没有限制。希望时，化合物能采用任何合适的剂型，如片剂、胶囊、分散剂、溶液、悬液或乳剂。
至于施用途径，化合物可口服或肠胃外施用。对于肠胃外施用，能使用任何施用途径，如静脉内、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或外用。
剂量没有限制，可根据患者的体重、性别、疾病严重程度等随意确定。剂量通常为约0.001μg/kg/日-1000μg/kg/日，优选地约0.01μg/kg/日-100μg/kg/日，更优选地约0.1μg/kg/日-10μg/kg/日。
施用频率也没有限制。上述剂量可每天施用一次，或可分为几次剂量。治疗持续时间可以是几天到几周或几周到几个月。
此外，根据本发明，提供了一种实施本发明的筛选方法的试剂盒，其包括一种用于评估对转录因子活性的抑制作用的载体，该载体含有一种报道基因；一种用于评估VDRE介导的转录促进活性的载体，该载体含有一种报道基因；希望时，一种用于维生素D受体表达的载体；和一种用于检测报道基因产物的试剂。
使用这种试剂盒，用评估对转录因子抑制活性的载体或评估VDRE介导的转录促进活性的载体转染在适当条件下培养的宿主细胞，同时用维生素D受体表达载体转染。然后，向系统中加入测试化合物，并随意培养细胞。然后，回收细胞裂解液，利用检测报道基因产物的试剂评估报道基因的表达量。这样，能容易地进行测试物质的筛选。当用高表达维生素D受体的细胞作为宿主细胞时，用维生素D受体表达载体转染不是必需的。
日本专利申请号1999-040090的完整描述在此引用作为参考，本申请的优先权是基于该申请。
将通过下列实施例更详细地描述本发明，但本发明不受这些实施例限制。实施例1筛选系统(A)利用报道基因测定系统对AP-1复合物和NF-κB家族的抑制活性的评价(1)具有AP-1结合序列或NF-κB结合序列的报道基因载体通过向萤光素酶的盒载体(pXP2；S.K.Nordeen，生物技术，6，454-456(1988)所述)中插入人IL-2基因的启动区(-72/+47)构建基础载体。对于含有AP-1结合序列的报道基因载体，向该基础载体中串联插入人胶原酶(MMP-1)基因的5种AP-1结合序列(ATGAGTCAG)。对于含有NF-κB结合序列的报道基因载体，向该基础载体中串联插入人免疫球蛋白轻链κ基因的 4种 NF-κB结合序列(CAGAGGGGACTTTTCCGAGA)。得到的产物用作各自的报道基因载体。(2)大鼠维生素D受体表达载体使用的大鼠维生素D受体表达载体是通过向pSG5(STRATAGENE)中插入大鼠维生素D受体的cDNA(James K.Burmester等人，美国国家科学院院报，85，9499-9502(1998)描述)获得的产物。(3)使用含有AP-1结合序列或NF-κB结合序列的报道基因载体的报道基因测定在含10％FBS和抗生素的RPMI-1640(GIBCO BRL)中培养Jurkat细胞。在5×104细胞/mL密度时开始培养，以3天或4天的间隔传代培养细胞，至5×104细胞/mL的密度。培养条件为37℃和5％CO2。对于报道基因载体的转染，制备用于3-5×106个Jurkat细胞的溶液A(5μLLIPOFECT胺(GIBCO BRL)，0.5mL OPTI-MEMI(GIBCO BRL))和溶液B(含有1μg每种报道基因载体和大鼠维生素D受体表达载体的0.5mL OPTI-MEMI)。混合这两种溶液，然后在室温下保持30分钟。在此期间，用无血清培养基洗涤细胞两次。30分钟后，将细胞悬浮于混合溶液中，并在37℃和5％CO2下处理5-6小时。然后加入含有10％FBS和抗生素的RPMI-1640，使细胞密度为1×106细胞/mL，之后该系统培养过夜。第二天，将细胞以2×105细胞/200μL/孔的密度接种于96孔black板(Nunc.)中。分别以10ng/mL和1μg/mL的量加入PMA(佛波醇12-肉豆蔻酯13-乙酸酯)和离子霉素(SIGMA)作为刺激物(加入10μL每种稀释(1/20)溶液)。而后，以10μL的量加入制备的1/12浓度的维生素D衍生物(维生素D衍生物均用载体(含有2％乙醇、10％FBS和抗生素的RPMI-1640)稀释为1/12浓度；至于对照组，以10μL/孔的量加入载体)。
所测的维生素D衍生物是具有下列结构的28种化合物(即1号化合物到28号化合物)。用1α，25-二羟基维生素D3作为标准物质。

培养8-10小时后，离心培养板(1500转每分，15分钟)，除去培养上清液。细胞用20μL/孔报道裂解缓冲液(Promega)裂解，在萤光素酶测定中使用裂解液的总量。在萤光素酶测定中，向细胞裂解液中加入100μL萤光素酶测定试剂(Promega)，并用Luminoscan RS(Labsystems)测定5秒钟后的荧光强度。(4)对AP-1复合物和NF-κB家族的抑制活性的评估(IC37.5值的计算)根据萤光素酶测定的测定值，计算每种维生素D衍生物的IC37.5值，评估对AP-1复合物和NF-κB家族的抑制活性。不加衍生物获得的对照的测定值作为100％的AP-1复合物或NF-κB家族转录活性，计算引起37.5％抑制的每种衍生物的量作为IC37.5值。
获得的IC37.5值表示为1α，25-二羟基维生素D3的值的百分数，结果显示在表1中。在表1中，“-”表示未进行检测。表1


(B)利用报道基因测定系统对VDRE介导的转录促进活性的评估(1)含有VDRE的报道基因载体所用的含有VDRE的报道基因载体是向含有兔β-珠蛋白和CAT(氯霉素乙酰转移酶)的启动区(-109/+10)的盒载体(pGCAT；Kato S.等人，细胞(1992)68，731-742)中整合小鼠骨桥蛋白基因的VDRE(GGTTCACGAGGTTCA)产生的产物。用pCH110(Pharmacia)作为用于校正转染率的β-半乳糖苷酶的表达载体。用BSM(BluscribeM13+STRATAGENE)作为载体。(2)大鼠维生素D受体表达载体所用的大鼠维生素D受体表达载体是通过向pSG5(STRATAGENE)中整合大鼠维生素D受体的cDNA获得的产物。(3)利用含VDRE的报道基因载体的报道基因测定在含有5％FBS和10nM胰岛素的DMEM培养基中培养COS-1细胞，培养物以3天或4天的间隔以1500-3000细胞/cm2的密度传代培养。培养条件为37℃和5％CO2。对于报道基因测定中COS-1细胞的培养，使用含有5％DCC-FBS(活性炭处理的FBS)和10nM胰岛素的无酚红DMEM培养基。将COS-1细胞以5-8×104细胞/1.75mL/孔的密度接种于6孔培养板中。过夜培养后，通过磷酸钙法用报道基因载体等转染细胞。
具体而言，用下列方法进行转染对每孔制备3.33μgDNA/35μL TE溶液(含有0.33μg报道基因载体、0.08μg大鼠维生素D受体表达载体、0.5μgpCH110和2.42μgBSM的TE；含有10mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA的TE)。向TE溶液中加入5μL 2M CaCl2。进而，轻轻混合地加入40μL HBS(280mM NaCl、50mM HEPES、1.5mM Na2HPO4)，混合液在室温下保持1小时。然后向每孔中加入80μL得到的溶液。也加入17.5μL以1/100浓度制备的每种维生素D衍生物(维生素D衍生物用载体(含有10％乙醇的DMEM)稀释为1/100浓度；至于对照组，加入载体)。
过夜培养后，每孔用1mL/孔无酚红DMEM培养基洗涤。然后再次加入维生素D衍生物及1.75mL/孔含有5％DCC-FBS和10nM胰岛素的无酚红DMEM培养基，该混合液进而培养过夜。然后每孔用2mL PBS洗涤，用细胞刮刀刮下细胞到1mL PBS中，回收到试管中。离心后，将细胞悬浮于150μL 0.25M Tris-HCl(pH7.8)中，通过冻融法制备细胞裂解液。用该细胞裂解液进行β-半乳糖苷酶测定，以校正转染率。然后用CATELISA试剂盒(Boehringer Mannheim)测定表达的CAT的量。(4)β-半乳糖苷酶测定细胞裂解液(10μL)、175μL缓冲液Z(60mM Na2HPO4，40mMNaH2PO4，10mM KCL，1mM MgSO4)和35μL 4mg/mL ONPG(邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷；SIGMA)在96孔板(Nunc-Immuno plate Maxi SorpSurface)中混合，该系统在37℃下温育1小时。然后，加入100μL 1MNa2CO3终止反应，用读板机测量A415。根据测得的值，由下列公式计算细胞裂解液的单位数，并在CAT ELISA测定中使用对应于15单位的量的细胞裂解液。
单位/μL＝(A415×100)/(细胞裂解液的量×2×反应时间)＝A415×5(5)EC50值的计算根据CAT ELISA的测定值，计算每种衍生物的EC50值，评估VDRE介导的作用。1α，25-二羟基维生素D3诱导表达的CAT的最大量作为100％的参照值，计算诱导50％CAT表达的每种衍生物的量为EC50值。
结果显示在表2中，为相对值，1α，25-二羟基维生素D3的EC50值作为100％。表2


(C)筛选结果VDRE介导的转录促进活性和对AP-1复合物或NF-κB家族的抑制活性测定上述多种维生素D衍生物的VDRE介导的转录促进活性和对AP-1复合物或NF-κB家族的抑制活性，并评估各维生素D衍生物的两种活性之间的差异。与1α，25-二羟基维生素D3相比，发现许多衍生物在两种活性之间显示极大差异。
获得的结果显示在图1和图2中。在图1中，垂直轴显示VDRE介导的转录促进活性，为相对值，1α，25-二羟基维生素D3的EC50值为100％，而水平轴显示对AP-1复合物的抑制活性，为相对值，1α，25-二羟基维生素D3的IC37.5值为100％。
在图2中，垂直轴显示VDRE介导的转录促进活性，为相对值，1α，25-二羟基维生素D3的EC50值为100％，而水平轴显示对NF-κB家族的抑制活性，为相对值，1α，25-二羟基维生素D3的IC37.5值为100％。
图1和图2中的数字表示化合物编号(Nos.)。
就两种活性之间的差异而言，最佳的衍生物是称为22号化合物的衍生物(即，1α，3β-二羟基-20(R)-(2-乙基-2-羟基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯)。其对AP-1复合物或NF-κB家族的抑制活性比1α，25-二羟基维生素D3强约25-35倍，其VDRE介导的转录促进活性约为1α，25-二羟基维生素D3的1/10。
上述结果证实了分离维生素D衍生物的VDRE介导的转录促进活性与其对AP-1复合物或NF-κB家族的抑制活性的可能性。实施例2在骨质疏松模型大鼠中22号化合物和1α，25-二羟基维生素D3对骨量降低的影响(皮下处理)(A)实验方法对7-9周龄W-I雌性大鼠(Imamichi动物繁殖研究所)施行卵巢切除术。从第二天开始，以0.01-0.04μg/kg的1α，25-二羟基维生素D3剂量，或0.01-0.1μg/kg的22号化合物剂量，每周5次皮下施用1α，25-二羟基维生素D3或22号化合物，共6周。最后一次施用后，取样24小时尿，并在乙醚麻醉下采血。使动物安乐死后，取出腰椎。
用双X线骨矿物质含量测定装置(DCS-600，ALOKA)测定第三腰椎处的腰骨矿物质密度。用自动分析仪(7170型，Hitachi)测定血及尿钙浓度和尿肌酐浓度。
用统计分析系统(SAS)软件进行统计处理。用不配对t检验进行假饲处理(假饲)组与卵巢切除术(OVX)组的对比。用Dunnett多因素检验进行OVX组与药物处理组的对比，或假饲组与药物处理组的对比。低于5％的P值被认为是显著性差异。(B)实验结果实验结果显示在图3(a)-3(f)中。图3(a)-3(c)分别显示在1α，25-二羟基维生素D3(1，25(OH)2D3)处理实验中的尿钙排泄、血钙浓度和骨矿物质密度。以假饲组的平均骨矿物质密度作为100％，各动物的骨矿物质密度计算为百分数(％)。
在OVX组中，腰骨矿物质密度降低约12％。另一方面，对于0.04μg/kg的1α，25-二羟基维生素D3剂量，骨矿物质密度的降低受到显著抑制。然而，与假饲组和OVX组相比，0.04μg/kg的1α，25-二羟基维生素D3剂量显著提高了血钙水平和尿钙排泄。因此，用1α，25-二羟基维生素D3同时观察到对骨矿物质密度的作用和提高血钙浓度和尿钙排泄的作用。
另一方面，图3(d)-3(f)分别显示在22号化合物处理实验中的尿钙排泄、血钙浓度和骨矿物质密度。以假饲组的平均骨矿物质密度作为100％，各动物的骨矿物质密度计算为百分数(％)。
在OVX组中，腰骨矿物质密度降低约11％。另一方面，在22号化合物处理组中，在0.01-0.1μg/kg剂量时观察到抑制骨矿物质密度降低的剂量依赖的作用，在0.1μg/kg剂量时观察到明显的抑制作用。不同于1α，25-二羟基维生素D3，22号化合物不显示血钙浓度和尿钙排泄的提高，并在对骨矿物质密度的作用和对钙作用之间显示差异。
22号化合物对维生素D受体的亲和力为1α，25-二羟基维生素D3的0.8倍。实施例3在骨质疏松模型大鼠中22号化合物和1α-羟基维生素D3对骨量降低的影响(口服处理)(A)实验方法对8周龄W-I雌性大鼠(Imamichi动物繁殖研究所)施行卵巢切除术。从第二天开始，每周5次以单剂量或分为两次剂量，以0.1μg/kg的每日剂量口服施用1α-羟基维生素D3剂量，或以3μg/kg的每日剂量每日口服施用22号化合物，共5周。最后一次施用后，取样24小时尿，并在乙醚麻醉下采血样。使动物安乐死后，取出腰椎。用双X线骨矿物质含量测定装置(DCS-600EX，ALOKA)测定第三腰椎处的腰骨矿物质密度。用自动分析仪(7170型，Hitachi)测定血及尿钙浓度和尿肌酐浓度。
用统计分析基础软件(SAS)进行统计处理。用不配对t检验进行假饲组与OVX组的对比，OVX组与1α-羟基维生素D3处理组的对比，或假饲组与1α-羟基维生素D3处理组的对比，低于5％的P值表示显著性差异。用Dunnett多因素检验进行OVX组与22号化合物组的对比，或假饲组与22号化合物组的对比，低于5％的P值表示显著性差异。(B)实验结果实验结果显示在图4(a)-4(c)中。图4(a)-4(c)分别显示尿钙排泄、血钙浓度和骨矿物质密度。
在OVX组中，腰骨矿物质密度显著降低。在口服0.1μg/kg的1α-羟基维生素D3(1α(OH)D3)组中，OVX对骨矿物质密度的降低受到显著抑制，但与假饲组和OVX组相比，血钙水平和尿钙排泄均显著提高。
在以3μg/kg剂量每日一次或以1.5μg/kg每日两次口服22号化合物组中，抑制骨矿物质密度降低的作用相当于或高于1α-羟基维生素D3。然而不同于1α-羟基维生素D3，未观察到血钙浓度和尿钙排泄的提高，及对骨矿物质密度的作用与对钙作用之间的差异。实施例4在骨质疏松模型大鼠中22号化合物对骨强度降低和骨吸收的影响(口服处理)(A)实验方法对13月龄W-I雌性大鼠(Imamichi动物繁殖研究所)施行卵巢切除术。从第二天开始，以1.5-6μg/kg的每日剂量分为两次p.o.施用22号化合物3个月。最后一次施用后，取样24小时尿，并在乙醚麻醉下采血样。使动物安乐死后，取出腰椎。
用双X线骨矿物质含量测定装置(DCS-600EX，ALOKA)测定第二到第四腰椎处的腰骨矿物质密度。用自动绘图仪AG-2000E(ShimadzuCorp.)测定第五腰椎的骨强度。用自动分析仪(7170型，Hitachi)测定血钙浓度和尿肌酐浓度。用Osteolinks DPD测定尿脱氧吡啶啉。
用统计分析系统(SAS)软件进行统计分析。用不配对t检验进行假饲组与OVX组的对比。用Dunnett多因素检验进行OVX组与22号化合物处理组的对比，或假饲组与22号化合物处理组的对比，低于5％的P值表明显著性差异。(B)实验结果实验结果显示在图5(a)-5(d)中。图5(a)-5(d)分别显示血钙浓度、尿脱氧吡啶啉(Dpyr)排泄、骨矿物质密度和骨强度。
在3个月中每日两次口服0.75、1.5或3μg/kg剂量的22号化合物组中，OVX对骨矿物质密度的降低受到显著抑制，OVX对骨强度的降低也受到显著抑制，而血清钙浓度不提高。
此外，用22号化合物处理可显著降低OVX提高的尿Dpyr排泄。因此，证实22号化合物对骨骼的作用受骨吸收抑制作用介导。
工业适用性本发明的筛选方法能寻找针对转录因子(特别是其激活通过维生素D受体抑制的转录因子)并能显示对骨骼的作用而不诱导高钙血症的维生素D衍生物。尤其可预期，用本发明的筛选方法发现的维生素D衍生物通过抑制转录因子的激活对其发作或进展与靶转录因子的激活有关的疾病显示治疗作用。

1.一种筛选具有维生素D受体亲和性的化合物的方法，其包括测定测试化合物的维生素D受体相关的、维生素D反应性元件(VDRE)介导的转录促进活性，和测试化合物对转录因子活性的维生素D受体相关的抑制作用；和筛选相对于VDRE介导的转录促进活性，对转录因子活性的抑制作用更强的化合物。
2.根据权利要求1的方法，其中具有维生素D受体亲和性的化合物是一种维生素D衍生物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中转录因子是AP-1复合物或NF-κB家族。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中用报道基因测定系统测定VDRE介导的转录促进活性。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中用报道基因测定系统测定对转录因子活性的抑制作用。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中测定测试化合物和标准化合物的VDRE介导的转录促进活性和对转录因子活性的抑制作用，选择满足下列公式的测试化合物(测试化合物对转录因子活性的抑制作用相比于标准化合物的抑制作用的相对值)/(测试化合物的VDRE介导的转录促进活性相比于标准化合物的转录促进活性的相对值)＞1作为对转录因子活性的抑制作用比VDRE介导的转录促进活性相对更强的化合物。
7.根据权利要求6的方法，其中选择满足下列公式的测试化合物(测试化合物对转录因子活性的抑制作用相比于标准化合物的抑制作用的相对值)/(测试化合物的VDRE介导的转录促进活性相比于标准化合物的转录促进活性的相对值)≥10作为对转录因子活性的抑制作用比VDRE介导的转录促进活性更强的化合物。
8.根据权利要求6或7的方法，其中标准化合物是1α，25-二羟基维生素D3。
9.一种具有维生素D受体亲和性的化合物，其特征在于用根据权利要求1-8任一项的方法筛选该化合物，而该化合物对转录因子活性的抑制作用强于该化合物的VDRE介导的转录促进活性。
10.根据权利要求9的化合物，它是一种维生素D衍生物。
11.一种转录因子相关疾病的治疗药物，该治疗药物含有根据权利要求9或10的化合物，转录因子的活性被维生素D受体抑制。
12.根据权利要求11的治疗药物，其中转录因子相关疾病是一种代谢性骨病。
13.根据权利要求12的治疗药物，其中代谢性骨病是骨质疏松症。
14.根据权利要求11-13任一项的治疗药物，其中转录因子是AP-1复合物或NF-κB家族。
15.根据权利要求11-14任一项的治疗药物，它是AP-1复合物活性的维生素D受体介导的抑制剂或NF-κB家族活性的维生素D受体介导的抑制剂。
16.一种用于根据权利要求1-8任一项的方法的试剂盒，其包括(a)一种用于评价对转录因子活性的抑制作用的载体，该载体含有转录因子的结合序列和报道基因；(b)一种用于评价VDRE-介导的转录促进活性的载体，该载体含有VDRE序列和报道基因；(c)希望时，一种维生素D受体载体，和(d)一种用于检测该报道基因产物的试剂。
17.一种治疗骨质疏松症的药物，其含有当用根据权利要求1的方法测定VDRE介导的转录促进活性和对转录因子活性的抑制作用时，用下列公式表示的值大于1的化合物作为活性成分(测试化合物对转录因子活性的抑制作用相比于标准化合物的抑制作用的相对值)/(测试化合物的VDRE介导的转录促进活性相比于标准化合物的转录促进活性的相对值)。
18.根据权利要求17的治疗骨质疏松症的药物，其含有用下列公式表示的值为10或大于10的化合物作为活性成分(测试化合物对转录因子活性的抑制作用相比于标准化合物的抑制作用的相对值)/(测试化合物的VDRE介导的转录促进活性相比于标准化合物的转录促进活性的相对值)。
19.根据权利要求17或18的治疗骨质疏松症的药物，其中该化合物是下列通式(1)代表的维生素D衍生物 其中X代表氧原子或硫原子，R1代表任选地由羟基或保护的羟基或-COR12基团取代的饱和或不饱和脂肪族烃基，其中R12是烷基、芳基或烷氧基，R2代表-OR9或氢原子，R9和R10相同或不同，且各自代表氢原子或保护基。
20.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中R2是-OR9。
21.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中R1是任选地由羟基取代的C1-15饱和脂肪烃基。
22.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中R1是任选地由羟基取代的C2-15不饱和脂肪烃基。
23.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中R1是基团(2) 其中R3和R4相同或不同，且各自代表氢原子或羟基，或一起具有氧原子表示为＝O，前提是R3和R4不同时是羟基；R5和R6各自代表氢原子或羟基，前提是当R3或R4是羟基时R6不是羟基；m是1-4的整数，n是0-2的整数，或R1是基团(3) 其中R5和R6相同或不同，且各自代表氢原子或羟基；R7和R8各自代表氢原子或一起代表共价键，p是1-3的整数；q是0-2的整数。
24.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中R1是3-羟基-3-甲基丁基。
25.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物的20位是S构型。
26.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物的20位是R构型。
27.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物是1，3-二羟基-20-(3-羟基-3-甲基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯。
28.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物是1α，3β-二羟基-20(S)-(3-羟基-3-甲基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯。
29.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物是1α，3β-二羟基-20(R)-(3-羟基-3-甲基丁基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯。
30.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物是1α，3β-二羟基-20(R)-((E)-4-羟基-4-甲基-2-戊烯基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯。
31.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物是1α，3β-二羟基-20(R)-((E)-4-乙基-4-羟基-2-己烯基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯。
32.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物是1α，3β-二羟基-20(S)-(2-羟基-2-甲基丙基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯。
33.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物是1α，3β-二羟基-20(R)-(2-羟基-2-甲基丙基硫)-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯。
34.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物是1α，3β-二羟基-20(S)-{2(S)-羟基-3-甲基丁氧基}-9，10-裂孕甾-5，7，10(19)，16-四烯。
35.根据权利要求19的治疗骨质疏松症的药物，其中通式(1)代表的维生素D衍生物是1α，3β-二羟基-20(S)-{2(R)-羟基-3-甲基丁氧基}-9，