专利名称：一种低产尿素黄酒酵母工程菌及其构建方法氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,以下简称EC)是被国际癌症研究机构(IARC)确认的人类可能致癌物质0々类)；美国国家毒理计划早已将其列入“有理由预料引起癌症的物质”名单。EC广泛存在于发酵食品(酱油、乳酪、酸牛奶等)与酒精饮料(各种蒸馏酒与酿造酒)中，对消费者是造成极大威胁。目前，世界各国非常重视EC的研究与控制。1985 年加拿大政府的卫生与福利组织规定了各类酒中EC的限量标准佐餐葡萄酒30μ g/L，强化葡萄酒100μ g/L，蒸馏酒15(^8/1，水果白兰地40(^8/1，日本清酒100 μ g/L。1987年美国FDA也规定了 EC的限量标准佐餐葡萄酒15μ g/L，强化葡萄酒60 μ g/L。2002年联合国粮农组织规定葡萄酒中EC含量不得超过20 μ g/L。黄酒是我国的特产，国外对黄酒的限量标准参照日本清酒，即100 μ g/L。受多方面因素影响，目前我国仍没有制定有关EC的限量标准，黄酒、葡萄酒等发酵酒中EC含量问题非常突出。黄酒中的EC主要来源于尿素与乙醇的自发反应而形成，其生成量受尿素的浓度、 乙醇含量、反应温度、反应时间和PH值等因素影响。黄酒中的尿素主要是在发酵过程中由酵母菌代谢所产生。酵母菌细胞内精氨酸经精氨酸酶(CARl)催化，水解生成EC的前体物质——尿素和鸟氨酸。酵母菌在生长繁殖和进行酒精发酵时，合成的大量尿素除了满足自身菌体需要外，多余的尿素被分泌到体外，进入发酵醪液与乙醇自发反应形成EC。目前，控制与降低黄酒中EC含量的措施有⑴适当调整工艺参数，比如降低煎酒温度以及缩短煎酒时间等。傅建伟等申请的发明专利(专利号CN102161956A)通过改变黄酒酿造工艺在一定程度上降低了黄酒中尿素的含量。( 添加酸性脲酶至压榨后的酒中以去除尿素，进而减少EC的形成量。周建弟等研究了利用酸性脲酶降低黄酒中尿素含量的条件，在一定条件下可以降低黄酒中约80%的尿素。( 进行酵母菌株改良育种以筛选得到低产甚至不产生尿素的酵母菌株，进而大幅度减少EC的形成量。王德良等申请的发明专利(专利号CN101550401)采用化学诱变的方法进行了低产尿素黄酒酵母的筛选，产尿素量降低了 50%左右。对黄酒而言，前两项措施虽然有一定效果，但都不显著。而且，改变煎酒温度和时间会给黄酒带来生物稳定性风险，并影响成品酒的风味；酸性脲酶依赖从日本进口，价格昂贵，而且会增加染菌风险；采用诱变的方法进行菌株选育，工作量大，筛选结果不可预见，而且诱变后菌株自身的安全性不可控制。应用基因工程手段构建出具有生物安全性的食品级低产或不产尿素黄酒酵母工程菌进行黄酒生产，可以从根本上解决黄酒中的 EC问题。通过自身克隆技术构建酵母工程菌，目的基因来源于出发菌株自身，不引入任何外源DNA片段，因此不属于转基因范畴，这种酵母工程菌更容易被企业和消费者接受，有实际应用前景。“自克隆”技术由于具有生物安全的优点，目前已成为对工业微生物，尤其食品微生物进行遗传改良的首选技术，该技术在选育优良性能啤酒酵母和葡萄酒酵母方面已经取得了明显的成效。2006年1月，美国食品药品管理局(FDAUSA)和加拿大健康署(Health Canada)已批准1株利用“自克隆”手段构建的低产尿素工业葡萄酒酵母(商品名wine yeast ECMoO 1)应用于工业化葡萄酒生产。使用该工程酵母生产的霞多丽葡萄酒中的EC含量较出发菌株下降了 89. 1%。
本发明所要解决的技术问题是采用“自克隆”技术构建低产尿素的黄酒酵母工程菌，以期为工业上解决黄酒中氨基甲酸乙酯含量偏高问题提供有效的参考方法。酿酒酵母 CUPl基因编码铜金属硫蛋白，在酵母细胞中参与过量铜的解毒作用。每个野生型二倍体酵母基因组中含有2个CUPl基因，酵母只能在Cu2+小于3mM的培养基中生长；而重组转化子增加了 CUPl基因的拷贝数，能在Cu2+为3-7mM的培养基中生长。本发明利用CUPl基因，通过“自克隆”技术破坏黄酒酵母精氨酸酶基因(CARl)，构建低产甚至不产尿素的黄酒酵母， 以达到显著降低黄酒中EC形成的目的。本发明构建低产尿素黄酒酵母工程菌的方法由以下步骤组成(1)黄酒酵母CARl基因及CUPl基因的获取在化1611^{公开的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)标准菌株基因组序列数据库(http //www. yeastgenome. org/)中，查找 CARl 基因和 CUPl 基因序列，设计合适的引物 (CARl-a TACCGATGATTCTGAGAAGAAAGAAG ；CARl-b GAATTTATTGGGGATTGTATCTGCTG ； CUPl-a TCAGGAAGATCTATACGTGCATATGTTCATGTATG ；CUPl-b ACTGAGAGATCTTGATCTGTTGTACTATCCGCTTC)，以黄酒酵母基因组 DNA 为模板，分另U PCR扩增出CARl基因和CUPl基因。进一步通过亚克隆入T载体(Takara，日本)及DNA测序实验验证了所获基因的正确性。所述黄酒酵母来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 30395。(2)CAR1-CUP1-CAR1同源重组基因盒的构建利用DNA限制性内切酶BglII以及DNA1M连接酶，以CUPl和CARl基因为分子操作对象，首先将CARl基因T克隆入pMD18-T simple载体，构建出pMD18_T simple-CARl质粒，然后通过BglII酶切及连接酶连接，将CUPl基因亚克隆入pMD18-T simple-CARl质粒， 构建出PMD18-T Simple-CARl-CUPl-CARl质粒。在CUPl基因上下游的CARl基因同源臂内分别设计引物，获得含有CUPl基因并带有CARl侧翼序列的基因盒。构建的基因盒经PCR 和测序验证，CUPl两侧同源臂的长度分别为557bp和569bp。(3)低产尿素黄酒酵母工程菌的构建及筛选用步骤⑵获得的线形CAR1-CUP1-CAR1基因盒转化出发菌株，以含5mM硫酸铜的选择培养基平板筛选转化子并通过PCR及测序进行验证。具体操作是利用PCR及乙醇沉淀法制备CAR1-CUP1-CAR1线形基因盒，利用酵母感受态制备试剂盒制备感受态细胞，采用醋酸锂转化法将线形基因盒转化入出发菌株感受态细胞内，使其在酵母基因组中CARl位点发生同源重组，以含5mM硫酸铜的选择性培养基平板筛选重组转化子。在CARl基因位点上游和下游设计引物，对转化子进行PCR鉴定。野生型CARl基因位点基因序列长度为^14bp， CARl基因被破坏后基因序列长度为3182bp。为验证本发明构建的黄酒酵母工程菌，以筛选获得的CARl基因敲除的工程菌为研究对象，以出发菌株为对照，分别考察其胞内精氨酸酶活力、产尿素水平、综合发酵性能及遗传稳定性。图1为PCR扩增CUPl和CARl基因的琼脂糖凝胶电泳结果，A为CUPl基因 (1008bp)，B为CARl基因(2578bp) ；M为DNA分子量标准，1和2均为平行样品。图2为黄酒酵母转化子PCR鉴定结果。M为DNA分子量标准，K1-K6为酵母转化子的PCR鉴定结果。具体实施方法实施例1酵母基因组DNA提取取1份经过培养的干样品(0. Olg)，用真菌DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，详细步骤参照说明书。得到的粗DNA用核酸蛋白定量仪检测后存于-20°C备用。实施例2CUP1基因及CARl基因的获得分别合成扩增CUPl基因和CARl基因的引物，见下表引物名称引物序列(5’-3’)CARl-aTACCGATGATTCTGAGAAGAAAGAAGCARl-bGAATTTATTGGGGATTGTATCTGCTG
CUP1 -aTCAGGAAGATCTATACGTGCATATGTTCATGTATG
CUP 1 -bACTGAGAGATCTTGATCTGTTGTACTATCCGCTTC25 μ L 反应体系包括模板 DNA 0. 5 μ L，引物各 0. 4 μ M，dNIPs 0. 2mM，rTaq 酶 2. 5U, Tris-HCl (pH 8. 3) IOmM, KCl 50mM, MgCl2L 5mM, ddH20 补足 25 μ L。反应程序分别为CARl 基因94°C 5min ；94°C 30s, 52 °C 30s, 72 °C 2min30s，30 个循环；72°C 5min。 CUPl 基因94°C 4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；72°C 5min。PCR 扩增结果如图1所示，图中A =CUPl基因；B =CARl基因。实施例3CAR1-CUP1-CAR1基因盒的构建同源重组基因盒的构建包括以下步骤(l)pMD8-T simple-CARl 质粒的构建a扩增出CARl基因，方法同实施案例2，电泳检测并回收纯化，得到的基因用核酸蛋白定量仪检测后用于T克隆。b制备大肠杆菌ToplO感受态细胞将过夜培养的大肠杆菌按1 100接入液体 LB培养基再次活化2. 5h ；加ImL活化好的菌液于1. 5mL离心管，4°C IOOOOrpm离心Imin ； 加入 900 μ LO. ImoVLCaCl2 充分混勻，4°C IOOOOrpm 离心 Imin ；加入 100 μ LO. lmol/LCaCl2 充分混勻，冰浴，备用。
c在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为10 μ L。
pMD 18-T simple vector1 [iLCARl 基因4μ
Solution I5μι16°C反应4h ；反应结束后全量加入100 μ LToplO感受态细胞中，冰浴放置30min ； 42°C热击90s后，再冰浴3-5min ；加入ImL预热的LB液体培养基，37°C振荡60min ；在含有 Amp的平板上培养，形成单菌落；挑取单菌落，使用PCR方法确认插入片段的长度大小；将鉴定正确的转化子送上海生工生物工程有限公司测序。(2)pMD18-T simple-CARl-CUPl-CARl 质粒的构建a扩增CUPl基因方法同实施案例2，提取pMD18_T simpIe-CARl质粒，使用上海生工生物工程有限公司的质粒小量抽提试剂盒进行提取。b获得的CUPl基因和质粒纯化后使用BglII酶进行酶切，酶切体系如下CUPl基因酶切体系
CUPl 基因5μ
IOxHbufFer2μLBglll
dH20Up to 20+载体酶切体系
pMD18-T simple-CARl5(Z
IOxHbufFer2μLBglWΙμ
dH20Up to 20μL37°C反应4h，将酶切产物纯化。c载体酶切纯化后，进行去磷酸化处理，使用割胶回收试剂盒切胶回收。d 连接反应体CUPl 基因 14μ L ；载体 2μ L ;10XT4DNALigase buffer 2. 5 μ L ； T4DNA Iigasel μ L ；up to 25 μ L。16°C反应过夜。e转化制备好的感受态细胞，在含有Amp的平板上培养，PCR鉴定单菌落。将PCR 鉴定正确的转化子送上海生工生物工程有限公司进行测序。实施例4菌株转化实验设计引物扩增出待转化的基因盒，转化黄酒酵母。转化方法采用LiAC/ss-Carrier DNA/PEG化学方法，包括以下步骤(1)将酵母接入YPD培养基中，过夜摇床培养至细胞达到l-2X108/mL。
(2)用新鲜预热的培养基稀释细胞至2-5 X 106/mL，再次培养细胞进行两次分裂约 4h，此时细胞浓度达到2 X 107mL。(3)离心收集酵母细胞，用无菌水洗涤两次。(4)将细胞悬浮于TE/LiAC溶液中，30°C静置培养15min。(5)取IOOyL上述步骤制备好的感受态，加入线性DNA(IOOngz^yL)、鲑鱼精 DNA (50 μ g/5 μ L)、PEG/TE/LiAC (300 μ L)并充分混勻。(6)将混合物于30°C下静置培养30min。(7) 42°C热击20min，结束后离心15s，去除PEG混合液。(8)将细胞悬浮在无菌水中，涂布含有5mM硫酸铜的选择性培养基。(9)30°C培养3-4天至长出单菌落，挑取单菌落进行PCR鉴定。获得的基因盒，转化酵母后得到的黄酒酵母工程菌的鉴定结果如图2所示。实施例5工程菌株与出发菌株的小型发酵试验比较两者尿素含量利用大米醪培养液(浓度14° Bx)以工程菌株和出发菌株分别进行小试规模黄酒发酵，利用尿素检测试剂盒检测两者发酵液中尿素的含量，发现工程菌株相较出发菌株尿素含量不超过出发菌株的三分之一(为8.26mg/L)；利用固相微萃取和气质联用(SPME-GC-MQ法检测两者酒液中EC含量，发现工程菌株相较出发菌株有大幅下降 (64. 2μ g/L)。实验结果表明构建的工程菌株具有明显的低产尿素效果，利用其发酵生产的黄酒EC含量低，而且对黄酒的风味基本无影响，具有实际工业应用潜力。虽然本发明已以较佳实例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。


本发明公开了一种通过“自克隆”手段构建低产尿素黄酒酵母工程菌及其构建方法。本发明的工程菌中精氨酸酶基因(CAR1)被破坏，从而降低黄酒酵母对精氨酸的代谢，减少黄酒醪液中尿素的含量，进而降低黄酒中氨基甲酸乙酯(EC)的含量。采用本基因工程菌发酵后，尿素含量可降低73％，氨基甲酸乙酯含量也会大幅降低。