专利名称：SecB介导的翻译后靶向途径的功能构建及其应用的制作方法细菌被广泛地用来大规模发酵生产具有各种应用价值的蛋白，如药用蛋白，工业用酶等。目前，按照发酵结束后目标蛋白是位于细胞质内还是培养基中，可以把生产技术分为两类a)以胞内蛋白的方式生产目标蛋白；b)以胞外蛋白(即分泌蛋白)的方式生产目标蛋白。与前者相比，后者由于目标蛋白位于培养基中，发酵结束后无须回收细胞，无须采取物理，化学或生物的方法将细胞裂解以便目标蛋白的释放，因此大大简化了发酵后目标蛋白的分离纯化工作，有效控制了生产成本[1]。此外，以胞外蛋白的方式生产目标蛋白还具有其他的优势，例如能够有效减少细胞质内目标蛋白的积累，从而避免包含体的形成；允许含有二硫键的蛋白能够在氧化性环境下进行正确的折叠等。因此，在工业上以分泌蛋白的方式大规模发酵生产目标蛋白是首选方案。细菌能够将含有信号肽的蛋白(即分泌蛋白)从其翻译地点即细胞质中运输到细胞外培养基中，这一过程称为蛋白质分泌。在细菌中，这一功能的执行主要依赖Sec转位酶 (Sec translocase)来实现，其核心由跨膜蛋白通道kcYEG与分子马达kcA (ATP酶)构成，如图5所示。携带信号肽的新生肽链需要从细胞质中被转移到Sec转位酶的关键组分 kcA上，这一过程称为靶向；随后，在水解ATP提供能量的情况下，^cA将待分泌的新生肽链经蛋白通道挤压出细胞质，从而进入细胞膜外空间W]。到目前为止，如图5所示，在细菌中已经鉴定的介导靶向过程的途径有1)信号肽识别颗粒(SRP)及其受体(SR) 介导的共翻译靶向途径，负责新生信号肽疏水性强的分泌蛋白的靶向，即SRP识别暴露于核糖体表面的信号肽，在翻译的同时通过SRP与其受体SR的相互作用，将翻译中的肽链转移到％(转位酶上[5] ；2) kcA介导的共翻译/翻译后靶向途径，负责信号肽疏水性一般的分泌蛋白的靶向，即^cA不需要借助其他因子直接识别新生信号肽W] ；3)kcB介导的翻译后靶向途径，协助^cA识别那些信号肽效率(即新生分泌肽链被分泌系统识别，结合并运输到细胞膜外侧的效率，影响因素包括信号肽特性以及信号肽下游肽段特性)低下的分泌蛋白的靶向，即新生分泌肽链在翻译末期或结束后与SecB结合从而维持非折叠构像，此二元复合物进而依赖SecB与Sec转位酶关键组分SecA的高亲和性(由SecB四聚体表面的“带负电荷的区域”与SecA 二聚体羧基末端“带正电荷的锌结构域”即“锌结合基序”之间的相互作用介导)，从而将肽链转移给％(^，完成靶向过程[7，8]。对于特定的分泌蛋白来说，依赖何种靶向途径取决于其信号肽的特性，例如信号肽疏水性[9，10]。枯草芽胞杆菌及其亲缘的芽胞杆菌以其强大的蛋白分泌能力而著称，能够将蛋白直接分泌到培养基中使之达到克每升的水平[11，12]。这一特性对于工业用酶生产非常有利，因此这类细菌被广泛用于在工业上生产相关产品[13，14]，例如在现有的商品化酶中，大约有60%是由属于革兰氏阳性细菌的芽胞杆菌发酵生产的，其中绝大部分是天然分泌的自身蛋白，如淀粉酶和蛋白酶[2]。虽然用枯草芽胞杆菌生产外源分泌蛋白不乏成功实例，然而与内源分泌蛋白相比，多数情况下枯草芽胞杆菌分泌外源蛋白的效率仍然低下，尤其是那些真核生物来源的蛋白，从这层意义上来说，这限制了其在工业中的广泛应用 [15，16]。研究表明，限制外源蛋白分泌效率的因素主要是靶向效率和蛋白酶降解，鉴于此， 研究人员发展了各种策略以增强枯草芽胞杆菌对外源蛋白的分泌能力，例如优化信号肽， 过表达靶向因子(SRP)，过表达Sec转位酶组分，过表达伴侣分子以及使用蛋白酶缺陷的菌株等，并且这些策略也被申请了相应的专利[1]。随着细菌蛋白质分泌机理在分子水平上的研究不断深入，人们对其理解也在不断深化。细菌为了更好地适应特定的生存环境，基于Sec转位酶的蛋白质分泌系统(简称％( 系统)在进化的过程中在不同的物种间呈现出一定的差异，例如信号肽特性的差异[17] 和Sec系统的差异[18]等。正是这些差异的存在导致了外源分泌蛋白无法像内源分泌蛋白一样在异源宿主中得到高效分泌。如果能够克服这些差异，有望从根本上解决外源蛋白在异源宿主中分泌效率低下的问题。已发表的结果表明，与大肠杆菌相比，枯草芽胞杆菌缺失了 SecB介导的翻译后靶向途径[18]。然而，由于其信号肽比大肠杆菌信号肽疏水性更强和N端带有更多的正电荷[17]，因此内源分泌蛋白可以被SRP有效识别[19]。考虑到革兰氏阴性细菌和真核生物的信号肽与革兰氏阳性细菌的信号肽差异显著[17]，我们推测这些外源分泌蛋白在枯草芽胞杆菌中无法被SRP或kcA有效识别，致使分泌蛋白前体在细胞质中积累和/或引发蛋白质质量控制系统将其降解，导致这些外源蛋白的靶向效率低下， 最终导致分泌效率低下[20，21]。为了促使枯草芽胞杆菌在工业上广泛用于分泌生产外源蛋白，必须解决靶向效率低下的问题。一个办法是改造信号肽或筛选最优信号肽[22-M]， 从而得到适合目的蛋白的信号肽。由于特定的目的蛋白需要特定的信号肽才能达到理想的靶向效率，该策略的一个缺点就是针对不同的目的蛋白，需要做特定的信号肽改造或筛选。 基于在分子水平上对蛋白质分泌的认识，考虑到IWecB介导的翻译后靶向途径能够协助 kcA识别信号肽效率低下的分泌蛋白；幻外源分泌蛋白的信号肽(如来源于革兰氏阴性细菌和真核生物)在枯草芽胞杆菌中的效率低下，故本发明试图在枯草芽胞杆菌中重构SecB 介导的翻译后靶向途径，以期增强该菌对外源分泌蛋白的分泌能力，即以大肠杆菌来源的麦芽糖结合蛋白突变体(MalEll)，碱性磷酸酶(PhoA)和野生型麦芽糖结合蛋白与碱性磷酸酶的融合蛋白(MalE-PhoA)作为外源分泌蛋白，研究了 bekcA和edecB能否在枯草芽胞杆菌中重构SecB介导的翻译后靶向途径以及该靶向途径的存在能否增强宿主对外源分泌蛋白的分泌能力，由此完成了本发明。发明内容本发明提供一种增加细菌分泌蛋白效率的方法，该方法包括在该细菌中共表达嵌合kcA蛋白和kcB蛋白，从而在该宿主中构建SecB介导的翻译后靶向途径，由此增加该细菌分泌蛋白的效率；其中，所述嵌合kcA蛋白的“锌结合基序”与该蛋白的其它部分的序列异源，且所述嵌合SecA蛋白能结合所述SecB蛋白。本发明提供一种在细菌中构建SecB介导的翻译后靶向途径的方法，该方法包括在该细菌中共表达嵌合kcA蛋白和kcB蛋白，从而在该宿主中构建kcB介导的翻译后靶向途径；其中，所述嵌合kcA蛋白的“锌结合基序”与该蛋白的其它部分的序列异源，且所述嵌合SecA蛋白能结合所述SecB蛋白。本发明提供一种提高细菌蛋白质分泌能力的方法，该方法包括在该细菌中共表达嵌合kcA蛋白和kcB蛋白，从而在该宿主中构建SecB介导的翻译后靶向途径，由此提高该细菌的蛋白质分泌能力；其中，所述嵌合％(^蛋白的“锌结合基序”与该蛋白的其它部分的序列异源，且所述嵌合SecA蛋白能结合所述SecB蛋白。在一具体实施例中，所述蛋白选自天然分泌蛋白或人工分泌蛋白，其中天然分泌蛋白优选为外源的天然分泌蛋白。在一具体实施例中，所述蛋白选自外源的天然分泌蛋白，包括水解酶(例如蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶)、抗体、干扰素和生长因子。在一具体实施例中，所述蛋白为融合蛋白，优选为与麦芽糖结合蛋白融合而形成的融合蛋白。在一具体实施例中，所述细菌为天然缺失secB基因的细菌，且所述细菌天然存在 seek基因。在一具体实施例中，所述细菌为选自芽胞杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属 (Corynebacterium)、分支杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus) >^LIfliiM (Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)或梭菌属 (Clostridium)的细菌。在一具体实施例中，所述细菌选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、短芽胞杆菌(Bacillus brevis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)或苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)。在一具体实施例中，所述在该细菌中共表达嵌合SecA蛋白和SecB蛋白包括构建含嵌合secA基因的表达载体和含secB基因的表达载体，其中，所述嵌合secA 基因为人工改造所述细菌secA基因而得，即所述细菌secA基因“锌结合基序”的编码序列被外源secA基因“锌结合基序”的编码序列所替换，从而具备结合所述SecB蛋白的能力；用所述含嵌合secA基因的表达载体和含secB基因的表达载体转化该细菌，从而在该细菌中共表达嵌合kcA蛋白和kcB蛋白。在一具体实施例中，所述secB基因来自于与所述细菌不同种属的细菌。在一具体实施例中，所述secB基因与所述secA基因的“锌结合基序”的编码序列来源于相同种属的细菌。在一具体实施例中，所述的外源secA基因所编码kcA蛋白的“锌结合基序”为外源kcA蛋白羧基末端最后18 60个氨基酸。在一具体实施例中，所述外源secA基因为大肠杆菌secA基因或流感嗜血杆菌 seek基因。在一具体实施例中，所述外源secB基因为大肠杆菌secB基因或流感嗜血杆菌 secB基因。6
本发明提供一种氨基酸序列，该氨基酸序列含有SEQ ID NO : 或SEQ ID NO 31 所述的氨基酸序列。
本发明提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码权本发明所述的氨基酸序列。
本发明提供一种构建物，所述构建物含本发明所述的核苷酸序列。
本发明提供一种系统，所述系统含有
(a)嵌合secA基因或含该嵌合secA基因的构建物，或所述嵌合secA基因所编码的嵌合^cA蛋白，其中，所述嵌合secA基因的“锌结合基序”的编码序列与该嵌合secA基因的其它部分异源，嵌合^cA蛋白具备结合所述SecB蛋白的能力；和
(b) secB基因或含该嵌合secB基因的构建物，或所述secB基因所编码的SecB蛋白，具备被所述嵌合SecA蛋白结合的特性。


图 1 :pSJ3-ecSecA 质粒示意图。
图 2 :pMA5-ecMalEll 质粒示意图。
图 3 :pAX01-ecSecB 质粒示意图。
图 4 :pOE-beSecA 质粒示意图。
图5 枯草芽胞杆菌蛋白质靶向途径示意图。半圆型阴影部分是本发明涉及到的基于嵌合SecA，由SecB介导的翻译后靶向途径。
图6 =SecA蛋白羧基末端决定kcA-SecB特异性相互作用。
图7 共表达嵌合SecA蛋白(beSecA)与SecB蛋白(ecSecB)能够增强枯草芽胞杆菌分泌外源蛋白MalEll的能力。
图8 =MalEll的高效分泌依赖kcB介导的翻译后靶向途径。
图9 JecB介导的翻译后靶向途径能够增强枯草芽胞杆菌分泌外源蛋白W10A以及 MalE-PhoA融合蛋白的能力。
图10 JecA蛋白羧基末端的“锌结合基序”决SkcA-SecB特异性相互作用。

在本申请中，所述“宿主”或“蛋白质生产菌”或“细菌”包括各种蛋白质生产菌，包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。优选的是，本发明的“宿主”或“蛋白质生产菌”或“细菌”主要指其野生型含有^cA蛋白但缺失kcB蛋白的细菌。更优选地，本发明的“宿主”或“蛋白质生产菌”或“细菌”主要是革兰氏阳性细菌，包括那些来自于芽胞杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分支杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus) > If lif M (Lactobacillus)、 链球菌属(Str印tococcus)、梭菌属(Clostridium)或其它属的细菌，具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licbeniformis)、巨大芽胞杆菌 (Bacillus megaterium)、短芽胞杆菌(Bacillus brevis)、角军淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)或其他种属的细菌。
本申请中，“外源”，是相对于内源而言，指某组分来源于非本申请所述宿主或蛋白质生产菌的细菌，主要指来自不同种属的细菌。采用本申请的方法，可改造上述细菌，使生产分泌蛋白尤其是外源分泌蛋白的能力和效率得到提高。可采用本申请的方法生产的蛋白包括但不限于天然分泌蛋白(天然含有信号肽)，即宿主菌或蛋白质生产菌自身天然分泌的蛋白(即内源分泌蛋白)，和该宿主菌或蛋白质生产菌之外物种来源的天然的分泌蛋白(即外源分泌蛋白)，这些蛋白携带的信号肽可以是野生型，也可以是人工置换或突变野生型信号肽后所获得的信号肽。除这些天然分泌蛋白之外，可采用本申请的方法生产的蛋白也可以是人工构建的分泌蛋白，即天然的非分泌蛋白(天然无信号肽)在利用基因工程技术人工添加信号肽后获得的“人工分泌蛋白”。非分泌蛋白既可以是宿主菌自身天然生产的蛋白，也可是宿主菌之外的物种生产的蛋白。此外，可采用本申请的方法生产的蛋白可以是融合蛋白。例如，所述内源分泌蛋白、外源分泌蛋白和人工分泌蛋白可以以各种融合蛋白的形式在本发明的宿主菌或蛋白质生产菌中表达和分泌。可通过构建含有该内源分泌蛋白、外源分泌蛋白或人工分泌蛋白与其它蛋白形成的融合蛋白的编码序列的表达载体、然后将该载体转入宿主菌或蛋白质生产菌中进行表达和分泌。在优选的实施例中，优选上述内源或外源分泌蛋白、天然或人工分泌蛋白与麦芽糖结合蛋白形成的融合蛋白。构建和转化的方法都是本领域常规的。在优选的实施例中，可采用本发明的方法或细菌分泌的蛋白包括各种工业用酶 (例如蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶等)和各种医药用蛋白(例如抗体，干扰素，生长因子等) [见文献2，25，26]。这些工业用酶或医药用蛋白可以融合蛋白的形式(例如，与麦芽糖结合蛋白融合)由本发明的方法或细菌分泌。本发明改造细菌的方法包括但不限于构建含嵌合secA基因的表达载体和含 SecB基因的表达载体，然后用所述含嵌合secA基因的表达载体和含secB基因的表达载体转化该细菌，从而在该细菌中共表达嵌合^cA蛋白和SecB蛋白。本发明中，嵌合secA基因为人工改造宿主菌secA基因而得，即所述细菌secA基因“锌结合基序”的编码序列被外源secA基因“锌结合基序”的编码序列所替换，从而具备结合所述^cB蛋白的能力。本文中，SecA蛋白“锌结合基序”指SecA蛋白羧基(C)末端的CXCX8C(C/X)及其临近的保守氨基酸残基，负责介导与SecB蛋白的相互作用，该“锌结合基序”一般位于kcA 蛋白羧基末端最后约40个氨基酸残基序列中。可使用来自含SecB介导的靶向途径的细菌的^cA蛋白的“锌结合基序”替换宿主或蛋白质生产菌^cA蛋白的“锌结合基序”。被替换的区域只要包括“锌结合基序”即可，替换的区域可以只是“锌结合基序”，也可以是更长的区域，如^cA蛋白C末端最后约60、55、50、45个氨基酸或更短。因此，在某些实施例中，用外源^cA蛋白C末端最后18 60个氨基酸(例如，最后18 40、20 35、22 35,22 32个氨基酸)替换宿主或蛋白质生产菌SecA蛋白C末端的相应部分。在其它实施例中，用于替换的序列不一定从该外源^^^蛋白C末端的最后一个氨基酸起算。例如， 用于替换的序列可以是该外源^cA蛋白C末端第2 40位氨基酸、第2 35位氨基酸、 第2 32位氨基酸、第3 40位氨基酸、第3 35位氨基酸等以及这些范围内的任意氨基酸片段，只要所替换的序列或氨基酸片段仍然保留“锌结合基序”的生物学功能即可。该方法构建的嵌合Seek具备结合与其“锌结合基序”同源的kcB蛋白的能力。例如，可使用例如图6A所示的来自大肠杆菌、流感嗜血杆菌、A. Tumefaciens, P. fluorescens、R. etli、 A. Pleuropneumoniae等细菌kcA蛋白的“锌结合基序”替换宿主或蛋白质生产菌kcA蛋白的“锌结合基序”。在一个具体实施例中，可使用图6A具体列出的来自大肠杆菌、流感嗜Tumefaciens、P. fluorescens、R. etli、A. Pleuropneumoniae ^Sg^W^lJ 宿主菌中kcA蛋白的“锌结合基序”。
可采用本领域常规的方法如融合PCR进行上述替换。例如，本申请实施例部分所述构建携带外源“锌结合基序”编码序列的嵌合secA基因，然后再在宿主或蛋白质生产菌中表达该嵌合的％(^蛋白。
可采用本领域周知的材料(枯草芽胞杆菌表达载体)和技术(PCR和分子克隆) 构建本发明含嵌合secA基因的表达载体和含外源secB基因的表达载体。随后采用本领域熟知的诸如化学转化方法将所属表达载体引入到枯草芽胞杆菌细胞中。适用于本发明的表达载体可以是整合型表达载体和复制型表达载体，前者如pAX01，pA-spac或pDG1661等；后者如pUBllO系列衍生质粒(pMA5或pWB980)或pBS72系列衍生质粒(pHCMC05或pOE)等。 此外，大量可以使用的表达载体可见参考文献[14]。
可采用本领域常规方法检测被转化的细菌是否已稳定表达所述嵌合kcA蛋白和外源SecB蛋白。这些方法包括SDS-PAGE以及随后的免疫印记，如实施例所述。
本文中，secB基因或其编码蛋白与构建嵌合secA基因所用到的“锌结合基序”的编码序列最好来源于但不限于同一物种或近源物种，选择的标准是所选用的SecB必须能够与嵌合^cA在体内进行功能性相互作用。
在一个优选实施方式中，较佳的是用来构建嵌合^cA蛋白的外源“锌结合基序” 与该外源SecB同源，即来自相同的细菌，如都来自大肠杆菌或流感嗜血杆菌。当然，来自不同细菌的“锌结合基序”和SecB只要能够保证嵌合kcA与SecB能够在体内进行功能性相互作用，同样也能够在同一宿主或蛋白质生产菌中起作用，提高蛋白分泌效率。
本文中，SEQ ID NO J8显示了嵌合secA基因的核酸序列，其中第对观 25 位为大肠杆菌secA基因的相应部分。SEQ ID NO : 显示了嵌合kcA的氨基酸序列。SEQ ID NO 30显示了本发明另一嵌合secA基因的核酸序列，其中嵌合了大肠杆菌secA基因的相应部分，SEQ ID NO 31显示其氨基酸序列。
因此，本申请也包括一种氨基酸序列，该序列含有SEQ ID NO : 或SEQID NO 31 所示的氨基酸序列。本申请还包括一种核苷酸序列，该序列编码本申请含SEQ ID NO : 或 SEQ ID NO :31所示的序列的氨基酸序列。本申请还包括含有本申请所述核苷酸序列的构建物。在一优选实施例中，所述构建物可以是一种载体。在更优选的实施方式中，所述构建物可以是一种表达载体，用于在宿主或蛋白质生产菌中表达本申请的嵌合^^六蛋白。可采用本领域常规的技术手段构建含有所述核苷酸的表达载体。
本申请也包括上述氨基酸序列、核苷酸序列和构建物的用途，例如，用于增加蛋白质生产菌分泌外源蛋白的效率、用于改善外源分泌蛋白的生产、以及用于构建与其野生型对照相比其外源蛋白生产能力得到提高的蛋白质生产菌等。
本申请还包括一种系统，该系统含有本文所述的嵌合secA基因和secB基因，和/ 或嵌合kcA蛋白和kcB蛋白。在一个具体实施例中，所述系统是一种细胞或细菌，所述嵌合secA基因中的嵌合部分(例如“锌结合基序”的编码序列)，与所述secB基因相对于该细胞或细菌而言都是外源的，和所述嵌合McA蛋白中的嵌合部分和McB蛋白相对于该细胞或细菌而言也都是外源的。在一个具体实施例中，所述系统含有SEQ ID NO 或30所述的核苷酸序列和 GenBank :M24489. 1所述大肠杆菌secB基因的核苷酸序列，或者SEQ ID NO 29或31所示的氨基酸序列和GenBank :MM489. 1所编码的氨基酸序列。在一个具体实施例中，所述系统为枯草芽胞杆菌。在其它实施例中，所述系统为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis), 巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、短芽胞杆菌(Bacillus brevis)、解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)或苏云金芽胞杆菌 (Bacillus thuringiensis)等。以下将以具体实施例的方式对本发明进行详细的描述。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的。此夕卜，本文中，“含有”、“包含”等术语在本文中也包括了“由……组成”、“由…… 构成”等含义。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规操作进行，例如参考冷泉港实验室出版社出版的《分子克隆实验室手册》第三版或按照所用物品生产商所建议的条件。一 .材料与方法1)菌株与质粒质粒pSJ2，pSJ3和pSJ4(见参考文献[27])，均为pET21a (Novagen)衍生质粒，用于在大肠杆菌中重组表达SecA和SecB蛋白。质粒pMA5，由Dartois提供[观]，卡那霉素抗性，用于在枯草芽胞杆菌中表达外源分泌蛋白。质粒pAXOl，由枯草杆菌菌种保藏中心(BGSC)提供，红霉素抗性，用于在枯草芽胞杆菌中表达大肠杆菌义沙蛋白。质粒pOE，以pMD18 (TaKaRa)为基本骨架，引入来自于pHCMC05 [29]上的枯草芽胞杆菌复制元和氯霉素抗性标记；同时再引入PMA5上的HpaII启动子以及大肠杆菌的trpA 终止序列组成的基因表达盒。该质粒用于在枯草芽胞杆菌中表达^cA蛋白。克隆宿主大肠杆菌DH5 α和蛋白表达宿主大肠杆菌BL21 (DE3)由Novagen提供。枯草芽胞杆菌168 (Bacillus subtilis 168)由枯草杆菌菌种保藏中心(BGSC)提 {共。2)质粒构建a) pSJ3-ecSecA, pSJ3_bsSecA，pSJ3-bhSecA 和 pSJ3_beSecA质粒pSJ3-eCSeCA编码大肠杆菌kcA蛋白，以大肠杆菌基因组为模板，引物对 Pl (SEQ ID NO 1)与 P2 (SEQ ID NO 2)扩增 secA 基因，NdeI 与 BamHI 双酶切后装入 pSJ3， 得到pSJ3-ecSecA，其质粒示意图如图1所示。质粒pSJ3-bsSeCA编码枯草芽胞杆菌SecA 蛋白，以枯草芽胞杆菌基因组为模板，引物对P3 (SEQ ID NOd)与P4(SEQ ID NO 4)扩增 secA基因，BamHI与XhoI双酶切后装入pSJ3，得到pSJ3_bsSecA。质粒pSJ3-bhSecA编码(枯草芽胞杆菌-流感嗜血杆菌)嵌合SecA蛋白即 W^ecA，该蛋白由枯草芽胞杆菌kcA蛋白第1位至第809位氨基酸和流感嗜血杆菌SecA 蛋白第867位至第901位氨基酸融合而得。该质粒采用大引物PCR技术构建，过程如下以流感嗜血杆菌基因组为模板，引物对P5 (SEQ ID NO 5)与P6 (SEQ ID NO 6)扩增流感嗜血杆菌kcA蛋白第867位至第901位氨基酸的编码序列。回收该片断做为大引物，与P3搭配，以质粒pSJ3-bsSeCA为模板扩增得到W^ecA蛋白的编码序列，BamHI与HindIII双酶切后装入PSJ3，得到pSJ3-bhSecA。同理，质粒pSJ3-beSeCA编码(枯草芽胞杆菌-大肠杆菌)嵌合kcA即bekcA蛋白，该蛋白由枯草芽胞杆菌kcA蛋白第1位至第809位氨基酸和大肠杆菌^cA蛋白第870位至第901位氨基酸融合而得。以大肠杆菌基因组为模板，引物对P7(SEQ ID NO 7)与P2扩增大肠杆菌kcA蛋白第870位至第901位氨基酸的编码序列。回收该片断做为大引物，与P3搭配，以质粒pSJ3-bsSeCA为模板扩增得到bekcA蛋白的编码序列，BamHI酶切后装入pSJ3，得到pSJ3_beSecA。
b)pSJ4-hiSecB 和 pSJ2_ecSecB
质粒pSJ4-hiSecB的构建见文献[30]，该质粒编码流感嗜血杆菌kcB蛋白。质粒 pSJ2-ecSecB编码大肠杆菌kcB蛋白，以大肠杆菌基因组为模板，引物对P8(SEQ ID NO 8) 与P9(SEQ ID NO 9)扩增 secB基因，BamHI 与HindIII双切后装入pSJ2，得到pSJ2_ecSecB。
以上a)和b)中构建的质粒用于在大肠杆菌中纯化相应的蛋白，这些纯化的蛋白随后用于体外结合实验和等温滴定实验中。
c) pMA5-ecMalEll，pMA5_ecPhoA 禾口 pMA5_ (ecMalE-PhoA)
质粒pMA5-eCMalEll编码大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE)的突变体，即MalEll 蛋白，该突变体的氨基末端携带3个氨基酸的替换(如图7A所示)。突变由重叠延伸PCR 技术引入，质粒构建过程如下以大肠杆菌基因组为模板，引物对P10(SEQ ID N0:10)与 Pll (SEQ ID NO :11)扩增malE基因信号肽编码区域，引物对P12 (SEQ ID NO :12)与P13 (SEQ ID N0:13)扩增malE基因成熟肽段编码区域。以上述两个经纯化的PCR产物的混合物为模板，引物对PlO与P13扩增得到全长MalEll蛋白的编码序列(突变分别由PlO和P12引入)，NdeI和HindIII双酶切后装入pMA5，得到pMA5_ecMalEll，其质粒示意图如图2所示。
质粒pMA5-eCWioA编码大肠杆菌碱性磷酸酶(PhoA)，其构建过程如下以大肠杆菌基因组为模板，引物对P14(SEQ ID NO 14)与P15(SEQ ID NO :15)扩增phoA基因，NdeI 和HindIII双酶切后装入pMA5，得到pMA5_ecPhoA。
质粒pMA5-(eCMalE-Ph0A)编码大肠杆菌来源的麦芽糖结合蛋白与碱性磷酸酶的融合蛋白(MalE-PhoA)，该融合蛋白的编码序列采用重叠延伸PCR技术构建。质粒构建过程如下以大肠杆菌基因组为模板，引物对P16 (SEQ ID N0:16)与P17(SEQ ID NO :17) 扩增不含终止密码子的malE基因；引物对P18(SEQ ID NO :18)与P15扩增编码WioA成熟肽段区域的编码序列。以上述两个经纯化的PCR产物的混合物为模板，引物对P16与 P15扩增得到全长MalE-PhoA蛋白的编码序列，NdeI和HindIII双酶切后装入pMA5，得到 pMA5-(ecMalE-PhoA)。
d) pAXO 1-ecSecB，ρ AX 0 1 - e c S e c B L 7 5 Q，ρ A X 0 1 - e c S e c B E 7 7 K 禾口 pAX01-ecSecBL75Q&E77K
质粒pAXOl-ecSecB编码大肠杆菌kcB蛋白，以大肠杆菌基因组为模板，引物对 P19(SEQ ID NO :19)与 P20 (SEQ ID NO :20)扩增 secB 基因，BamHI 酶切后装入 pAXOl，得到 pAXOl-ecSecB，其质粒示意图如图3所示。
质粒pAX01_ecSecBL75Q编码大肠杆菌SecB蛋白的突变体kcBL75Q，突变由重叠延伸PCR技术引入，质粒构建过程如下以大肠杆菌基因组为模板，引物对P19与P21 (SEQ11ID NO 21)扩增secB基因突变位点上游的片断，引物对P22 (SEQ ID NO 22)与P20扩增 secB基因突变位点下游的片断，突变由P22引入。以上述两个经纯化的PCR产物的混合物为模板，引物对P19与P20扩增得到全长kcBL75Q蛋白的编码序列，BamHI酶切后装入pAXO 1， 得到 pAX01-ec^ecBL75Q。以同样的方法，P23 (SEQ ID NO :23) % P24(SEQ ID NO :24)分别用于pAX01-ec^ecBE77K和pAX01-ec^ecBL75Q&E77K的构建，这两个质粒分别编码大肠杆菌 SecB 蛋白的突变体 kcBE77K 和 kcBL75Q/E77K。e)pOE-beSecA 禾口 pOE-bsSecA。质粒pOE-beSecA编码(枯草芽胞杆菌-大肠杆菌)嵌合kcA即bekcA蛋白， 以质粒pSJ3-beSecA为模板，引物对P25(SEQ ID NO :25)与P26 (SEQ ID NO :26)扩增得到 bekcA蛋白的编码序列，KpnI和SacII双酶切后装入pOE，得到pOE-beSecA，其质粒示意图如图4所示。质粒pOE-bsSecA编码枯草芽胞杆菌kcA蛋白，以枯草芽胞杆菌基因组为模板， 引物对P25与P27 (SEQ ID NO 27)扩增secA基因，KpnI和SacII双酶切后装入pOE，得到 pOE—bsSecA。3)培养条件如无特殊说明，均采用LB培养基，添加适当的抗生素，37摄氏度振荡培养过夜。抗生素浓度为氨苄青霉素100ug/ml，卡那霉素100ug/ml，氯霉素5ug/ml，红霉素5ug/ml。4)转化方法大肠杆菌转化采用成熟的钙法转化，见《分子克隆》第三版。枯草芽胞杆菌采用广泛使用的无机盐自然感受态方法进行质粒的转化[31]。5) SDS-PAGE, Western Blotting等实验参考《分子克隆》第三版。6)碱性磷酸酶酶活力测定参考文献[32]。7) SecA蛋白和SecB蛋白的纯化以及体外结合实验等参考[27]二.结果与讨论实施例一kcA蛋白羧基末端决定^cA-SecB特异性相互作用。在缺失secB基因的细菌中， 随着SecA蛋白羧基末端“锌结合基序”在进化过程中“有害突变”的不断积累，逐渐丧失了结合SecB蛋白的能力。将这类kcA蛋白羧基末端“锌结合基序”替换为能够与SecB蛋白相互作用的^cA蛋白的相应部分，能够使原本不能结合SecB蛋白的kcA蛋白获得结合 SecB蛋白的能力，下面以枯草芽胞杆菌kcA为例予以说明。图6A显示不同生物来源的kcA蛋白“锌结合基序”的序列比较。由此可见，在进化过程中，虽然该基序呈现出高保守性，但突变也是显著的。对于那些缺失secB基因的细菌，如枯草芽孢杆菌，突变可能造成其^cA蛋白丧失结合SecB蛋白的能力。图 6B 显示了流感嗜血杆菌 SecA (HaemophiIus influenzae SecA，简写为 hiSecA),大肠杆菌 SecA(Escherichia coli SecA,简写为 ecSecA),枯草芽胞杆菌 SecA (Bacillus subtilis SecA，简写为bskcA)和两个嵌合kcA即枯草芽胞芽胞杆菌-流感嗜血杆菌嵌合简写为W^ecA)与枯草芽胞杆菌-大肠杆菌简写为beSecA) 的羧基末端氨基酸序列。箭头所指之处表示构建嵌合SecA时发生嵌合的位置。图6C显示不同的Seek与kcB体外结合情况，结果表明bdecA既不能结合流感嗜血杆菌kcB (hiSecB)，也不能结合大肠杆菌kcB (ecSecB)，见泳道1和2。这与枯草芽胞杆菌缺失secB基因的事实相一致，其^cA蛋白羧基末端“锌结合基序”在进化过程中“有害突变”的不断积累，逐渐丧失了结合义沙蛋白的能力。然而，将bdecA蛋白的“锌结合基序”替换为hikcA或edecA的相应部分获得的嵌合kcA即W^ecA和bekcA便获得了至少结合与其“锌结合基序”同源的SecB蛋白的能力，见泳道3，4和6。这一结果清楚地表明kcA蛋白羧基末端决定^cA-SecB特异性相互作用，可以通过置换kcA蛋白羧基末端 “锌结合基序”来改变其结合SecB的特性。为了进一步提供证据说明嵌合kcA能够有效结合^cB蛋白，我们测定了不同的 SecA与edecB之间的解离常数。图6D显示，beSecA/edecB之间的解离常数与正对照 ecSecA/ecSecB之间的解离常数相当，远低于bsSecA/edecB之间的解离常数。实施例二基于嵌合SecA能够与外源SecB相互作用，理论上在secB基因缺失的细菌中共表达嵌合kcA蛋白和外源kcB蛋白(两者能够进行相互作用)能够重构义沙介导的靶向途径，能够增强宿主分泌外源蛋白的效率。下面以在枯草芽胞杆菌中共表达bekcA和edecB 为例予以说明，选用的外源分泌蛋白是MalEll。MalEll是大肠杆菌来源MalE的突变体，该突变体的信号肽N区域只带有1个净正电荷(野生型为3个净正电荷)以及紧接信号肽的成熟肽段区域也带有1个净正电荷(野生型净电荷为0)，故命名为MalEll，如图7A所示，该突变体在枯草芽胞杆菌中的分泌效率与野生型相比有所降低，故本发明中采用该突变体以突出显示义沙介导的翻译后靶向途径的功能性，即增强宿主分泌外源蛋白的效率。将编码bskcA或bekcA或空载体pOE，编码edecB或空载体pAXOl和编码 MalEll的pMA5三个质粒同时转化到枯草芽胞杆菌中，得到6株分别表达不同的SecA， ecSecB以及MalEll组合的菌株。这些株菌在添加0. 5%木糖诱导edecB表达的LB培养基中培养15小时后，取样分析，结果如图7B所示，单独表达edecB，bsSecA或bekcA都无法增加宿主分泌MalEll的效率(第2，3和5组)。在共表达bdecA和edecB的情况下(第 4组)，MalEll的分泌效率有些许提高，但提高的幅度远远弱于共表达bekcA和edecB的情况(第6组)。在共表达bekcA和edecB的情况下，宿主分泌MalEll的效率大幅度增加，MalEll分泌量增加至少1倍以上。我们可以看到培养基中积累了大量的MalEll成熟蛋白，而细胞质中仅积累少量MalEll前体蛋白。这些结果清楚地表明bekcA和edecB的共表达能够在枯草芽胞杆菌中重构SecB介导的翻译后靶向途径，该途径的存在能够增加宿主分泌外源蛋白的效率。实施例三本发明提供了两个“反面”证据，进一步支持本发明的结论，即bekcA和edecB的共表达能够在枯草芽胞杆菌中重构SecB介导的翻译后靶向途径，该途径的存在能够增加宿主分泌外源蛋白的效率。ecSecB的表达受控于木糖诱导的启动子I^xyl，在本组实验中我们通过调整诱导物木糖的浓度来调控edecB的表达水平，即木糖浓度依次为0. 5%，0. 1%，0. 05%和0% (图8A从第3组到第6组)，进而考察edecB的表达水平对MalEll分泌效率的影响。与预期一致，图8A清楚地表明随着edecB表达水平逐渐下降，宿主分泌MalEll的效率也逐渐递减，呈现出线性关系。
更具有说服力的证据来自于edecB突变体的实验。SecB的点突变L75Q和E77K 能够破坏^cA-SecB之间特异性相互作用，但不影响SecB结合新生分泌肽链的活性。采用这些突变体，可以考察MalEll的高效分泌是否依赖^cA-SecB之间特异性相互作用。将编码 ec^ecB，ecSecB L75Q,ecSecB E77K 或 eckcB L75Q&E77K 的 pAXOl 载体分别转化到表达 bekcA和MalEll的枯草芽胞杆菌中，在适当的条件下过夜培养，取样分析，结果如图8B所示。与野生SkcB(第3组)相比，kcB突变体(第4，5和6组)不能支持MalEll的高效分泌，说明MalEll的高效分泌依赖^cA-SecB之间特异性相互作用，这一结果与预期完全一致。
实施例四
kcB介导的翻译后靶向途径能够增加宿主分泌外源蛋白的效率具有一定的通用性，下面以外源分泌蛋白即大肠杆菌来源碱性磷酸酶(PhoA)和麦芽糖结合蛋白-碱性磷酸酶融合蛋白(MalE-PhoA)为例予以说明。
类似于MalEl 1，图9A详细研究了不同kcA与edecB组合背景下WioA的分泌量， 培养基中WioA分泌量可以由WioA酶活力高低反映。在单独表达edecB的情况下，PhoA的分泌量没有增加O号与1号相比)。值得注意的是，无论是单独表达bdecA，还是bekcA (3 号和5号与1号相比)，W10A分泌量均增加30%左右，这与文献报道一致，即kcA单独也能够介导靶向途径识别新生分泌肽链。更值得关注的是，在bekcA和edecB共表达的情况下，PhoA分泌量在增加30% (由bekcA的表达引起)的基础上又进一步增加了 WioA的分泌量，最终WioA分泌量累积增加了 60%以上。作为“反面”证据，ecSecB的L75Q突变由于破坏了 SecA-kcB之间特异性相互作用，所以bekcA和e(^eCBL75Q的共表达不能够使 WioA分泌量累积增加达到60%以上，增加的30%源自bekcA的单独表达(7号)。简而言之，上述这些结果再次证明bekcA和edecB的共表达能够在枯草芽胞杆菌中重构SecB介导的翻译后靶向途径，该途径的存在能够增加宿主分泌外源蛋白的效率。
免疫印迹如图9B所示，证实bekcA和edecB的共表达增加了 WioA的分泌量。尽管其“表观分泌效率”已经很高，即细胞组分中未检测到大量的WioA前体(泳道幻。发明人推测在共表达bekcA和edecB的情况下，PhoA的靶向效率大大增加，避免了部分WioA 前体在细胞质中遭受降解，因而在SecB介导的靶向途径存在的情况下，PhoA的分泌量大幅增加。
图9C显示bekcA和eckcB的共表达对MalE-PhoA分泌效率的影响。免疫印迹证实在bekcA和edecB共表达的情况下，MalE-PhoA的分泌效率也得到大幅度提高，培养基中MalE-PhoA分泌量大幅增加，相应地其前体在细胞质中的积累大幅减少(泳道3与4 对比1与2)。此外，培养基中酶活力测定证实了免疫印记的结果，即MalE-PhoA分泌量提高 70%以上。
实施例五
实施例一至实施例四中用到的嵌合bekcA蛋白的嵌合部分(最末端32个氨基酸)除了包括“锌结合基序”(其精确边界目前已经发表的文献还没有报道，但已知最后22 个氨基酸含有该“锌结合基序”，见文献[33])之外，还包括其上游若干个氨基酸。理论上嵌合部分(长度可以小于22个氨基酸或大于32个氨基酸)只要包括介导与kcB相互作用的“锌结合基序”，嵌合^cA就至少能够结合与其“锌结合基序”同源的kcB蛋白的能力， 该嵌合^cA与该SecB的共表达能够在secB缺失的细菌中重构SecB介导的翻译后靶向途径，增强宿主分泌外源蛋白的效率，下面以bsSecA-R3为例予以说明。图IOA显示bskcA-R3与bekcA相比，仅把bskcA蛋白羧基末端最后22个氨基酸替换为edecA的相应部分。替换所得序列如SEQ ID NO :31所示。在共表达bskCA-R3与edecB的情况下，MalEll的分泌效率要明显高于共表达 bsSecA与edecB的情况(第4组相对于第1组)，这说明bsSecA_R3与edecB能够在宿主中重构SecB介导的翻译后靶向途径从而增强宿主分泌外源蛋白的效率。三·总结本发明涉及到义沙介导的翻译后靶向途径的构建及其应用。考虑到1)枯草芽胞杆菌在工业上广泛用于生产(内源)分泌蛋白；2)由于信号肽特性在不同生物类群间呈现出显著差异，外源分泌蛋白(如来源于革兰氏阴性细菌和真核生物的分泌蛋白)的信号肽在枯草芽胞杆菌中效率低下JWecB介导的翻译后靶向途径能够有效协助kcA识别信号肽效率低下的新生分泌肽链；4)枯草芽胞杆菌缺失义沙蛋白，故本发明试图在枯草芽胞杆菌中重构SecB介导的翻译后靶向途径，以期增加该菌分泌外源分泌蛋白的效率，进一步拓展该菌在工业上生产分泌蛋白中的应用。由于枯草芽胞杆菌^^六蛋白(bsSecA， UniProtKB :P28366)不能够与大肠杆菌 kcB 蛋白(ecSecB，UniProtKB :P0AG86)进行有效相互作用，基于^cA-SecB相互作用的结构基础，本发明构建了 bekcA，即bdecA蛋白羧基末端最后32个氨基酸残基被置换为edecA蛋白的相应部分，该部分包含介导kcA-SecB 相互作用的“锌结合基序”，从而获得有效结合edecB的能力。免疫印迹和/或酶活测定表明，在枯草芽胞杆菌中共表达bekcA和edecB蛋白，能够重构原本不存在的kcB介导的翻译后靶向途径，该途径的存在能够有效增加枯草芽胞杆菌分泌外源蛋白即芽糖结合蛋白突变体(MalEll)，碱性磷酸酶(PhoA)和麦芽糖结合蛋白与碱性磷酸酶的融合蛋白 (MalE-PhoA)的效率，培养基中这些蛋白的分泌量分别增加100%，60%和70%以上。此外，平行设置的对照实验进一步验证了 ^cB介导的翻译后靶向途径的功能性。这些结果清楚表明，基于嵌合SecA,即bekcA蛋白，我们在枯草芽胞杆菌中成功重构了 SecB介导的翻译后靶向途径，该途径能够增加宿主分泌外源蛋白的效率。另外，本发明提供的技术方法也可以用于其它缺失义沙介导的翻译后靶向途径的细菌，如芽胞杆菌属细菌地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis),巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium),短芽胞杆菌 (Bacillus brevis)和苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)等等，这些细菌在工业生产蛋白领域也被广泛应用[25]。此外，细胞质蛋白在人工添加信号肽后(即人工分泌蛋白)也可以被细菌分泌系统识别，进而将其分泌到培养基中[26，34]。由于构建的人工分泌蛋白往往没有经过信号肽优化，因而此类蛋白在枯草芽胞杆菌中信号肽效率往往也较低。 理论上，本发明涉及到的SecB介导的翻译后靶向途径也能够增加宿主分泌人工分泌蛋白的效率。因此，本发明显示出广阔的应用前景。参考文献1. Nijland, R. and 0. P. Kuipers, Optimization of protein secretion by Bacillus subtil is. Recent Pat Biotechnol,2008. 2(2) :p.79-87.2. Westers, L. , H. Westers, and W. J. Quax, Bacillus subtilis as cell factoryfor pharmaceutical proteins :a biotechnological approach to optimize the host organism. Biochim Biophys Acta，2004. 1694(1—3) :p. 299—310.
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本发明涉及SecB介导的翻译后靶向途径的功能构建及其应用。具体而言，本申请涉及构建嵌合SecA蛋白、在细菌中共表达该嵌合SecA蛋白和SecB蛋白而增加secB基因缺失细菌分泌蛋白效率的方法、在secB基因缺失细菌中构建SecB介导的翻译后靶向途径的方法以及提高secB基因缺失细菌蛋白质分泌能力的方法。此外，本申请还涉及相关的氨基酸序列和核苷酸序列，表达载体，以及含有所述氨基酸序列、核苷酸序列和/或表达载体的系统。