专利名称：流感病毒基质2蛋白的胞外域、其表达系统和应用的制作方法流感病毒基质2蛋白的胞外域、其表达系统和应用流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族的负义RNA成员，引起人和动物疾病。流感病毒感染常见且可为流行性或季节性。尽管流感病毒感染不常引起感染个体的死亡，但发病率严重。因此，流感病毒流行可导致重大经济损失。此外，流感病毒感染对某些个体群可能更危险，如心脏病患者、C.A.R.A.患者或年长者。流感病毒以复发方式引起疾病，这是由于许多复杂的因素，包括:1)水鸟和水禽中存在不同亚型流感A病毒的已建立储器；2)禽流感病毒与其他动物如猪的流感病毒重组的能力，该过程称为‘抗原转移’ ；3)由于缺乏病毒RNA聚合酶的校对活性而在病毒基因产物中积累的突变，该过程称为‘抗原漂移’(Tollis，M.和L.Di Trani, Vet.J.164:202-215(2002))。抗原转移、抗原漂移和禽流感病毒感染其他宿主如猪和人的能力产生导致人严重疾病的新病毒。这些重配和突变事件组合引起病毒两种表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)中良好表征的抗原可变性，其为所述病毒提供逃逸先前感染或接种疫苗诱导所产生的免疫响应(尤其是中和抗体)的机制。(Palese，P.和J.F.Young, Science 215:1468-1474; Gorman, 0.T.,等，Curr.Top.Microbiol.1mmunol176:75-97;和 Yewdel 1，J.W.，等，Nature 279:246-248)。为了预测可能对人类健康具有全球影响的特定流感亚型，必须依赖监督程序生产流感疫苗。生产亚型匹配疫苗(由灭活的或‘裂解的’病毒颗粒组成)的时间一般最少需要6-8个月。面对病毒亚型引起的严重流感病毒流行时，这种时间延迟可能导致全国或全球传播，发病率和死亡率极高。因此，非常需要对不同亚型流感病毒有效的流感疫苗。流感病毒包含单链RNA的8个区段-形成该病毒的遗传指令。其表面覆盖有一层两种不同糖蛋白:一种由血凝素(HA)分子构成，另一种由神经氨酸酶(NA)构成。病毒衣壳由病毒核糖核酸和若干所谓的“内部”蛋白(聚合酶(PB1、PB2和PA)、基质蛋白(Ml)和核蛋白(NP))构成。由于传统上已证实针对HA和NA的抗体在对抗感染方面最有效，很多研究都集中在这些分子的结构、功能和遗传变异方面。不同于HA和NA，跨膜病毒M2蛋白(M2e)的外部结构域高度保守且针对该表位的抗体在小鼠中具有保护性(Treanor, J.J.，等，J.Virol.64:1375-1377 (1990) ; Frace, A.M.,等，Vaccine 17:2237-2244(1999) ;ffanli, L.,等，Immunol.Lett.93:131-136 (2004);和Fan，J.，等，Vaccine 22:2293-3003(2004))。所述M2蛋白是A型流感病毒的整合膜蛋白，在病毒感染细胞的质膜上表达。由于病毒中该蛋白丰度低，所以针对该表位的抗体应答的保护机制不是通过病毒中和介导，而是通过抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性。(Jegerlehner, A.,等，J.1mmunol.172:5598-5605 (2004))。开发诱导免疫响应疫苗的主要障碍是选择合适的递送形式。单独使用或一起使用的DNA质粒疫苗和病毒载体， 以及重组蛋白或肽是合理的疫苗递送形式，但是，各种形式有其优点和缺点。例如，DNA疫苗容易生产且给予安全，但效力不足，尤其是临床试验中，需要给予大(毫克)剂量。Liu, M.A.J.1ntern.Med.253:402-410 (2003)。使用病毒载体递送疫苗已引发关注，通常涉及安全性和对载体的预存免疫性。因此，非常需要开发安全有效的新流感疫苗。
本发明提供一种含编码多肽的编码区域的分离多核苷酸，其中所述多肽包含至少5种流感病毒基质2蛋白(M2)胞外域肽。在一个实施方式中，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的下述氨基酸序列的任何5种或更多:⑴SEQ ID NO:1 (M2e#l_C) ; (ii).SEQ ID N0:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQID N0:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii) SEQ ID NO:7(M2e#l_S);(viii)SEQID N0:8(M2e#2_S) ; (ix)SEQ ID NO: 9 (M2e#3_S) ; (x) SEQ ID NO: 10 (M2e#4_S) ; (xi)SEQ IDN0:ll(M2e#5_S);和(xii)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。还提供含编码多肽的编码区域的分离多核苷酸，其中所述多肽包含相对彼此以任何顺序排列的下述M2胞外域肽的任何3种或更多:(i)SEQ ID N0:l(M2e#l_C) ; (ii)SEQ ID N0:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQ ID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQID N0:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii)SEQID NO:7(M2e#l_S);(viii)SEQID N0:8(M2e#2_S) ; (ix)SEQ ID NO: 9 (M2e#3_S) ; (x) SEQ ID NO: 10 (M2e#4_S) ; (xi)SEQ IDN0:ll(M2e#5_S);和(xii) SEQ ID NO: 12 (M2e#6_S).在一个实施方式中，所述多核苷酸包含编码多肽的编码区域，所述多肽含相对彼此以任何顺序排列的下述6种M2胞外域肽:(i)SEQ ID N0:l(M2e#l_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQID N0:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);和(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C)或(i)SEQ ID N0:7(M2e#l-S);(ii)SEQ ID NO:8 (M2e#2_S);(iii)SEQID NO:9(M2e#3_S);(iv)SEQID N0:10(M2e#4_S) ; (v) SEQ ID NO: 11 (M2e#5_S);和(vi)SEQ ID NO: 12 (M2e#6_S)的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明多核苷酸编码多肽，所述多肽含相对彼此以任何顺序排列的6种M2胞外域肽，在至少两种M2胞外域肽之间插有至少一种接头肽，且任选地在至少两种M2胞外域肽之间插有表位。所述表位可为T细胞表位或B细胞表位。 在一些实施方式中，本发明针对含编码多肽的多核苷酸的载体,所述多肽含多拷贝的M2胞外域肽。所述载体可为病毒载体，如痘苗病毒载体，如改良的痘苗病毒安卡拉株(MVA)。本发明载体还可表达其他多肽，如流感病毒蛋白或其片段。所述其他多肽可选自下组:血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质I蛋白(Ml)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亚基(PA)、RNA聚合酶PBl亚基(PBl)、RNA聚合酶PB2亚基(PB2)、或其两种或更多组合。在其他实施方式中，本发明是含所述载体和所述多核苷酸所编码分离多肽的宿主细胞。还包括含所述多核苷酸、所述载体如MVA、所述宿主细胞或所述多核苷酸以及药学上可接受运载体的组合物。在一个实施方式中，本发明的疫苗组合物还包括其他流感疫苗组合物。其他流感疫苗可包括表达流感病毒或其片段的MVA。在其他实施方式中，本发明包括诱导需要的对象中针对流感病毒的免疫响应的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述多肽或所述组合物，或其任何组合。还提供治疗、预防、或减少需要的对象中流感病毒感染的症状或有关流感病毒感染的病症的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述多肽或所述组合物，或其任何组合。本发明还涉及减弱或改善需要的对象中流感病毒感染引起的症状或有关流感病毒感染的病症的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述多肽或所述组合物，或其任何组合。在其他实施方式中，本发明包括为需要的对象针对流感病毒感染进行疫苗接种的方法，所述方法包括同时或以任何顺序给予所述对象有效量的所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述多肽或所述组合物，或其任何组合。本文所用的鉴定序列如下:SEQ ID NO:1:具有半胱氨酸的M2胞外域#1的氨基酸序列(M2e#l_C)SEQ ID NO: 2:具有半胱氨酸的M2胞外域#2的氨基酸序列(M2e#2_C)SEQ ID NO: 3:具有半胱氨酸的M2胞外域#3的氨基酸序列(M2e#3_C)SEQ ID NO:4:具有半胱氨酸的M2胞外域#4的氨基酸序列(M2e#4_C)SEQ ID NO: 5:具有半胱氨酸的M2胞外域#5的氨基酸序列(M2e#5_C)SEQ ID N0:6:具有半胱氨酸的M2胞外域#6的氨基酸序列(M2e#6_C)SEQ ID N0:7:具有丝氨酸取代的M2胞外域#1的氨基酸序列(M2e#l_S)SEQ ID N0:8:具有丝氨酸取代的M2胞外域#2的氨基酸序列(M2e#2_S)SEQ ID N0:9:具有丝氨酸取代的M2胞外域#3的氨基酸序列(M2e#3_S)SEQ ID NO: 10 :具有丝氨酸取代的M2胞外域#4的氨基酸序列(M2e#4_S)SEQ ID NO: 11:具有丝氨酸取代的M2胞外域#5的氨基酸序列(M2e#5_S)SEQ ID NO: 12:具有丝氨酸取代的M2胞外域#6的氨基酸序列(M2e#6_S)SEQ ID NO: 13:编码流感病毒 A/Puerto Rico/8/34(HlNl)的基质 2 (M2)蛋白的核酸序列SEQ ID NO: 14:流感病毒 A/Puerto Rico/8/34(HlNl)的基质 2 (M2)蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO: 15:编码METR_C多肽的核酸序列SEQ ID N0:16:METR_C多肽的氨基酸序列SEQ ID NO: 17:编码METR_S多肽的核酸序列SEQ ID NO: 18:METR_S多肽的氨基酸序列SEQ ID NO: 19:编码NP共有序列的核酸序列SEQ ID NO:20:NP共有序列的氨基酸序列SEQ ID NO:21-25:接头肽SEQ ID NO:26-27: T 细胞表位SEQ ID NO:28:人工序列SEQ ID NO:29-30:启动子SEQ ID NO:31:转录终止信号SEQ ID NO:32-50:引物SEQ ID N0:51:编码流感病毒A/Puerto Rico/8/34(HlNl)的HA蛋白的核酸序列SEQ ID NO: 52:编码流感病毒A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)的HA蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:53:编码流感病毒A/Puerto Rico/8/34(HlNl)的M2蛋白的跨膜结构域的核酸序列SEQ ID N0:54:流感病毒A/Puerto Rico/8/34(HlNl)的M2蛋白的跨膜结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:55:METR_C多肽的氨基酸序列SEQ ID N0:56:METR_S多肽的氨基酸序列附图简要说明
图1是重组载体vEMOll的示意载体图。缩写如下:术语“AmpR”代表用于在细菌中选择的氨苄青霉素抗性基因；术语“侧接(Flank) I/侧接2Del III”代表与MVA基因组中缺失位点III的侧接区域同源的序列；术语“Ps”表示强合成启动子；BsdR表示编码杀稻瘟菌素抗性的基因；术语“GFP”表示编码绿色荧光蛋白的基因；术语“FIDel 3rpt”代表侧接IDel III的后部重复；术语“LacZ”表示用于检测细菌的大肠杆菌(E.coli)Lac Z基因。图2显不含流感病毒A基因的重组载体的不意载体图:(A) vEM47编码NP共有序列；(B)vEM57编码M2胞外域串联重复(METR_C)肽；(C) vEM58编码M2胞外域串联重复-丝氨酸取代的(METR_S)肽；(D)vEM61编码流感病毒A/Puerto Rico/8/34的全长基质2结构域(Pr8M2) ; (E) vEM62编码源自流感病毒A/Puerto Rico/8/34的基质2结构域的跨膜结构域(Pr8M2e-TML);和(F) vEM65 编码流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 的血凝素蛋白(Pr8HA)。图3 显示各 种 MVAtor 的 PCR 产物:⑷ MVAtor-NP 共有(mEMIO);⑶ MVAtor_METR_C(mEM18);(C)MVAtor-METR_S(mEM19);以及(D)MVAtor_Pr8M2(mEM22)，MVAtor_Pr8M2e_TML(mEM23)和 MVAtor_Pr8HA(mEM17)。图4显示示例性PCR片段的示意图。缩写如下:术语“侧接lDel3”表示插入位点缺失3的侧接序列I ;术语“Ps”表示痘苗病毒强合成启动子；术语“flu基因”表示编码感兴趣基因的基因，即分别为HA、NP、M2e、M2e_TML和METR;和术语“侧接2Del3”代表缺失3的侧接序列2。图5代表以下各种MVAtor表达的流感病毒蛋白的Western印迹分析:MVAtor_NP共有(mEMIO)、MVAtor-METR_C(mEM18)和 MVAtor_METR_S (mEM19)。图6代表用MVAtor-Pr8HA (MVAtor_Pr8)感染的CEF细胞、模拟感染的CEF细胞和用MVAtor(MVAtor)感染的CEF细胞的血球吸附试验(HAD)。图7代表用于检测CEF细胞中Pr8M2的免疫试验:(A)用MVAtor_Pr8M2感染的细胞；和(B)用MVAtor-Pr8M2e_TML感染的细胞。图8代表用以下表达流感病毒蛋白的MVAtor免疫后的体重变化百分比:Pr8M2(灰色，大实心圆)、Pr8M2e-TML(黑色，星号)、METR_C(灰色，小空心圆)、METR_S (灰色，实心菱形)、NP共有(黑色，实心三角)、MVAtor (黑色，大空心圆)，和PBS (黑色，小实心圆)。图9表示免疫小鼠中的病毒负荷。获取每组四个小鼠中每个的肺重量以表示50%组织培养感染剂量(TCID50)/肺重量。图10表示来自用MVA疫苗免疫的小鼠的血清的ELISA，使用小鼠IgG抗_M2e抗体(14C2)。本实验中使用的M2e肽(M2e#l (第4行)、M2e#4 (第3行)、M2e#5 (第2行)和M2e#6 (第I行))不于表I。图11显示鼻内(IN)递送(图11A)和肌肉内(IM)递送(图11B)的MVA疫苗免疫小鼠的体重减少。图12代表鼻内递送(左柱)和肌肉内递送(右柱)的MVA疫苗免疫小鼠的病毒负荷。图13表示用表达流感病毒蛋白的MVAtor免疫后小鼠的体重变化百分比:HA(灰色，实心方块)、NP (灰色，实心三角)、M2 (灰色，实心菱形)，和M2+NP (灰色，星号)以及对照=MVAtor (黑色，实心菱形)和非致死的HlNl PR8 (黑色，实心圆)。图 14 的 ELISA 结果显示免疫有 ld21 MVA、2d21 MVA、ld21 MVA+NP、2d21 MVA+NP、ld21 MVA-M2eA+MVA-NP、2d21 MVA_M2eA+MVA_NP、ld21 非致死 HlNl PR8 和 2d21 非致死 HlNlPR8MVA的小鼠的抗-NP (IgG抗-NP)免疫响应，使用第42天血清(攻击前)。图15表示HlNl PR8病毒攻击后第2天(左柱)和第4天(右柱)，免疫有MVA、MVA-HA、MVA-NP、MVA-M2eA、MVA-M2e+NP和A/PR/8/34的小鼠的病毒负荷。获取各小鼠中每个的肺重量以表示50%组织培养感染剂量(TCID50)/肺重量。图16A表示用表达流感病毒蛋白的MVAtor免疫后的体重变化百分比:MVA-PR8HA (黑色，小实心菱形)，MVA-PR8-M2+NP (黑色，实心方形)，和MVA-PR8-C+NP (灰色，大实心菱形)以及对照:PBS (黑色，三角)。图16B代表用表达表9所示全部流感病毒蛋白以及阴性对照的MVAtor免疫后的体重变化百分比。图 17 的 ELISA 结果显示免疫有 ConsNP, PR9M2+ConsNP、PR8M2e_TML+ConsNP、METR-C+ConsNP和METR-S+ConsNP的小鼠抗-NP (IgG抗-NP)免疫响应，使用第42天血清(攻击前)。 图 18 的 ELISA 结果显示免疫有 M2、M2-TML、METR-C, METR-S, M2+NP、M2-TML+NP、METR-C+NP和METR-S+NP的小鼠抗-M2 (IgG抗_M2e肽)免疫响应，使用第42天血清(攻击前)。图19表示用HlNl PR8病毒攻击3天后鼻内(左柱)或肌肉内(右柱)免疫有PBS (IN)、MVAtor, NP、M2、M2e_TML、METR-C, METR-S, HA 和亚致死性 PR8 (IN)的小鼠肺中的病毒负荷。获取每只小鼠的肺重量以表示50%组织培养感染剂量(TCID50)/肺重量。图20A表示用表达流感病毒蛋白的MVAtor免疫后的体重变化百分比:M1+NP+METR-C (黑色，实心方块)、M1+NP+M2 (灰色，空心三角)、M2+NP (灰色，X)、Ml (黑色，星号)和M1+NP(灰色，实心圆)以及对照=Flulaval (黑色，实心菱形)、MVAtor (黑色，小实心方块)和PBS (黑色，实心三角)。图20B显示用表达流感病毒蛋白的MVAtor免疫的小鼠的存活数据百分比:M1+NP+METR-C (灰色，实心方块)、M1+NP+M2 (灰色，空心三角)、M2+NP (灰色，X)、Ml (黑色，星号)和M1+NP(灰色，实心圆)以及对照=Flulaval (黑色，空心菱形)、MVAtor (黑色，实心方块)和PBS (黑色，实心菱形)。图 21 的 ELISA 结果显示免疫有 PBS, MVAtor, Ml+NP+METRC, M1+NP+M2, M2+NP, Ml, Ml+NP和Flulaval的小鼠抗-NP (左半边)和抗M2 (右半边)免疫响应，使用第39天血清(攻击前)。水平线表示组平均值。未就Ml治疗组评估IgG抗-M2水平。图 22k 的 ELISA 结果显示免疫有 PBS、MVAtor、Ml+NP+METRC、Ml+M2+NP、M2+NP、Ml、M1+NP和Flulaval的小鼠抗-Ml免疫响应，使用第39天血清(攻击前)。水平线表示组平均值。图 22B 的 ELISA 结果显示免疫有 MVAtor、M1+M2+NP、M2+NP、Ml 和 M1+NP 的小鼠抗-MVA免疫响应,使用第21天(初免后)(左半边)和第39天(攻击前)(右半边)血清。水平线表示组平均值。图23表示用sHlNl A/Mx/4108/09病毒攻击后第2天(左柱)或第4天(右柱)，用PBS、MVAtor、Ml+NP+METRC、M1+NP+M2、M2+NP、Ml、M1+NP、和 Flulaval 免疫的小鼠肺的病毒负荷。图24表示用sHlNl A/Mx/4108/09病毒攻击后第2天(左柱)或第4天(右柱)，用PBS、MVAtor、Ml+NP+METRC、M1+NP+M2、M2+NP、Ml、M1+NP、和 Flulaval 免疫的小鼠鼻甲的病
毒负荷。发明详述本发明提供编码多拷贝流感病毒基质2蛋白胞外域的多核苷酸、含所述多核苷酸的载体(如MVA)、所述多核苷酸编码的多肽和相关组合物以及给予所述多核苷酸、载体(如MVA)、多肽或组合物以预防或治疗流感病毒感染的方法。制备和使用本发明的方法包括所有分子生物学、微生物学、免疫学和疫苗接种的常规技术。所述技术示于包括但不限于下述的文献:Sambrook MolecularCloning;ALaboratory Manual (《分子克隆:实验室手册》)，第二版(1989)和第三版(2001) ; GeneticEngineering:Principles and Methods,(遗传工程:原理和方法)1-25 卷(J.K.Setlow编，1988);DNA Cloning ( 《DNA 克隆》)1 和 II 卷(D.N Glover 编 1985) ; OligonucleotideSynthesis (《寡核苷酸合成》)(M.J.Gait 编，1984) ; Nucleic Acid Hybridization (《核酸杂交》)(B.D.Hames 和 S.J.Higgins 编.1984) ; Transcription and Translation (《转录和翻译》)(B.D.Hames 和 S.J.Higgins 编.1984) ;Animal Cell Culture (《动物细胞培养》)(R- 1.Freshney 编.1986) ; ImmobilizedCells and Enzymes (《免疫细胞和酶》)(IRL 出版公司(IRL Press) , 1986) ;B.Perbal, A Practical Guide to MolecularCloning (《分子克隆实用指南》)(1984) ; the Methodsin Enzymology series (《酶学方法》丛书)(学术出版社公司(Academic Press, Inc.)),具体为154和155卷；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells (《哺乳动物细胞的基因转移载体》)(J.H.Miller和 M.P.Calos 编.1987,冷泉港实验室(ColdSpring Harbor Laboratory) ) ;Mayer 和Walker,编.(1987), Immunochemical Methodsin Cell and Molecular Biology (细胞和分子生物学中的免疫化学方法)(伦敦的学术出版社)；Scopes, (1987)ProteinPurif icat ion !Principles and Practice, Second Edition (《蛋白纯化:原理和实践》)第二版(施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约)，和 Handbook of ExperimentalImmunology(《实验免疫学手册》)I_IV卷，(D.M.Weir 和 C.C.Blackwell 编 1986).(Sambrook等(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual 2nd ed.,(《分子克隆:实验室手册》)第二版，冷泉港实验室出版社和 Ausubel 等编 (1997) Current Protocols in MolecularBiology,(《新编分子生物学实验指南》)(约翰韦利森公司(John Wiley & Sons, Inc.) ) 0定义应注意，术语“一个”或“一种”物质指一种或多种该物质；例如，“一种多核苷酸”应理解为代表一种或多种多核苷酸。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。本文所用的术语“分离”表示多核苷酸、多肽或其片段、变体或衍生物以及改良的痘苗病毒安卡拉株(MVA)已从其天然结合的其他生物材料中移出。分离多核苷酸的示例是载体中含有的重组多核苷酸。分离的多核苷酸的其它例子包括保持于异源宿主细胞的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或基本上纯化)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的经分离多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。本文所用的术语“分离病毒”表示病毒、其衍生物或变体从其天然结合的其他生物材料中移出，或被重组操纵以包括非天然产生的物质。分离病毒的示例是含来自不同物种的多核苷酸的病毒，所述多核苷酸重组插入病毒基因组。分离病毒的其它例子包括含异源多核苷酸并保持于宿主细胞中的病毒或溶液中的纯化(部分或基本上纯化)病毒。本文所用的术语“纯化”表示多核苷酸、多肽、病毒或其片段、变体或衍生物基本不含其天然结合的其他生物材料，或不含源自例如重组宿主细胞的其他生物材料，所述重组宿主细胞被遗传改造以复制本发明病毒。例如，本发明的纯化病毒包括至少70-100%纯度的病毒，即组合物中存在的病毒构成总组合物重量的70-100%。在一些实施方式中，本发明所述的纯化病毒纯度为75%-99%重量、纯度为80%-99%重量、纯度为90-99%重量或纯度为95%-99%重量。本发明病毒的相对纯度可通过熟知方法容易确定。术语“核酸”、“核苷酸”或“核酸片段”指多核苷酸或构建体中存在的任何一种或多种核酸区段，如DNA或RNA片段。本发明的两个或多个核酸可存在于在单一多核苷酸构建物中，例如在单一质粒上，或者在单独(不相同)多核苷酸构建物中，例如在单独质粒上。此外，任何核酸或核酸片段可编码单一多肽，如单一抗原、细胞因子或调控多肽，或可编码多于一种多肽，如核酸可编码两种或更多多肽。此外，核酸可编码调节元件如启动子或转录终止子，或可编码多肽或蛋白的专门元件或基序如分泌信号肽或功能结构域。除非另有说明，具体核酸序列也隐含其保守修饰变体(如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体说，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代(Batzer等(1991)，Nucleic Acid Res.19:5081 ;0htsuka 等(1985)，J.Biol.Chem.260:2605-2608 ；Cassol 等(1992) ;Rossolini 等(1994) ,Mol.Cell.Probes 8:91-98)。术语核酸涵盖多核苷酸、基因、cDNA、信使 RNA(mRNA)、质粒 DNA(pDNA)或 pDNA 的衍生物(如(Darquet, A-M 等,GeneTherapy4:1341-1349(1997)中所述的小环)。核酸可以线性(如mRNA)、环形(如质粒)或分支形式以及双链或单链形式提供。核酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(如酰胺键，如肽核酸(PNA)中的酰胺键)。术语核酸、核苷酸、多核苷酸、DNA和基因在本文中可互换使用。术语〃多核苷酸〃旨在涵盖单数核酸或核酸片段以及复数核酸或核酸片段，且指分离的分子或构建体，如病毒基因组(如非感染性病毒基因组)、信使RNA (mRNA)、质粒DNA(pDNA)或 pDNA 衍生物(如(Darquet, A-M 等，Gene Therapy4:1341-1349 (1997)所述的含多核苷酸的小环)。多核苷酸可以线性(如mRNA)、环形(如质粒)或分支形式以及双链或单链形式提供。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(如酰胺键，如肽核酸(PM)中的酰胺键)。
本文所用的术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并包含两种或更多氨基酸的任一链或多条链。因此，本文所用的术语包括但不限于“肽”、“二肽”、“三肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或其它任何用于指两种或多种氨基酸的一条或多条链的术语，所述术语均包含于“多肽”的定义内，术语“多肽”可与任何这些术语替代或互换使用。所述术语还包括经过翻译后修饰的多肽，所述修饰例如已知保护/阻断基团的糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化作用，蛋白水解切割或非天然产生的氨基酸的修饰。“密码子优化”在本文中定义为通过用宿主基因中所用的更频繁或最频繁的密码子替换至少一种、多于一种或大量天然序列的密码子而修饰核酸序列以提高其在具体宿主细胞中的表达。各物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定偏好。本文所用的术语“其他”指不同于对象生物组分的任何生物组分。所述其他组分可为宿主细胞、病毒、多肽、多核苷酸、基因或调节区域如启动子。应理解所述对象组分可源自流感病毒、MVA、M2胞外域肽或适当编码所述M2胞外域肽的多核苷酸。例如，流感病毒的M2胞外域基因的“其他多核苷酸”或“其他核酸”或“其他基因”或“其他序列”或“外源DNA区段”可为来自不同病毒如细胞巨化病毒的启动子或相同流感病毒的血凝素。所述术语流感病毒的M2胞外域的“其他多肽”、“其他氨基酸序列”、“其他抗原”或“其他蛋白”可为His标签或任何流感病毒多肽、其片段、变体、衍生物或类似物。在某些实施方式中，其他多肽可为流感病毒多肽、其片段、变体、衍生物或类似物。在其他实施方式中，其他多肽可为M2胞外域多肽、其片段、变体、衍生物或类似物。本文所用的术语“流感病毒多肽”或"流感病毒抗原"涵盖流感病毒内存在的任何全长或成 熟多肽，和流感病毒内存在的全长或成熟多肽的其他变体，流感病毒内存在的全长或成熟多肽的片段，流感病毒内存在的全长或成熟多肽片段的血清型、等位基因和其他变体，流感病毒内存在的全长或成熟多肽的衍生物，流感病毒内存在的全长或成熟多肽片段的衍生物，流感病毒内存在的全长或成熟多肽的类似物，流感病毒内存在的全长或成熟多肽片段的类似物，和含流感病毒内存在的全长或成熟多肽或流感病毒内存在的一种或多种全长或成熟多肽片段的嵌合和融合多肽。流感病毒多肽的非限制性示例是血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质I蛋白(Ml)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、或一种或多种RNA聚合酶亚基即PA、PBl和PB2。在本发明所述的一个实施方式中，流感病毒多肽是流感HA蛋白、其片段、变体、衍生物或类似物，如含与已知HA序列如SEQ ID NO:52有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%,99%或100%相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽被特异结合HA序列的抗体识另IJ。所述HA序列可为全长HA蛋白，其主要由HA或胞外结构域(EOT) (HAl和HA2)、跨膜(TM)结构域和胞质(CYT)结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HAl结构域和HA2结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HAl、HA2和TM结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由CYT结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由TM结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HAl结构域组成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HA2结构域组成。所述HA序列还可包括HA1/HA2切割位点。所述HA1/HA2切割位点优选位于HAl和HA2序列之间，但也可相对于所述多核苷酸或多肽构建体的其他序列以任何顺序排列。流感病毒HA序列可来自致病性病毒株。在另一实施方式中，流感病毒多肽是流感病毒核蛋白(NP)序列、其片段、变体、衍生物或类似物，例如包含与已知NP多肽至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述NP多肽的抗体识别。在其他实施方式中，所述流感NP序列包括NP共有序列如SEQ ID NO: 20、主要由其组成或由其组成。流感病毒多肽可为神经氨酸酶(NA)蛋白、其片段、变体、衍生物或类似物。已知定位于流感病毒包膜上的NA蛋白催化末端唾液酸残基从病毒和细胞糖偶联物中移除。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(HlNl)的NA蛋白具有454氨基酸，Genbank登录号为AAM75160.1，其通过引用全文纳入本文。NA蛋白由胞质结构域(氨基酸1_6)、跨膜结构域(氨基酸7-35)和胞外结构域(氨基酸36-454)组成。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒神经氨酸酶(NA)序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成的，其中所述多肽由特异结合所述NA蛋白的抗体识别。所述NA序列可为全长NA蛋白，其主要由NA组成。所述NA序列可为包括NA序列的胞外结构域、跨膜(TM)结构域或胞质(CYT)结构域、主要由其组成、或由其组成的多肽。流感病毒NA序列可来自致病性病毒株。流感病毒多 肽可为基质I (Ml)蛋白、其片段、变体、衍生物或类似物。基质I蛋白在病毒复制中起关键作用。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934 (HlNl)的Ml具有252氨基酸，Genbank登录号为AAM75161.1，其通过引用全文纳入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒Ml序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述Ml蛋白的抗体识别。所述Ml序列可为包括NA序列片段、主要由其组成、或由其组成的多肽。在其他实施方式中，流感病毒多肽可为非结构(NS)蛋白、其片段、变体、衍生物或类似物。非结构蛋白(NS)抑制细胞前体mRNA的转录后加工，这是通过结合并抑制细胞前体mRNA 3’-末端加工所需的两种细胞蛋白:30kDa切割和多聚腺苷酸化特异性因子(CPSF4)和聚(A)-结合蛋白2 (PABPNl)0流感病毒A/PuertoRico/8/1934(HlNl)的NS蛋白具有230氨基酸，Genbank登录号为AAM75163.1，其通过引用全文纳入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒NS序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述NS蛋白的抗体识别。所述NS序列可为包括NS序列片段、主要由其组成、或由其组成的多肽。在一些实施方式中，流感病毒多肽是RNA聚合酶PA (聚合酶酸性蛋白)亚基、其片段、变体、衍生物或类似物。PA多肽在病毒RNA合成中显示伸长因子活性。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(HlNl)的 PA 蛋白具有 716 氨基酸，Genbank 登录号为 AAM75157.1，其通过引用全文纳入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒PA序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述PA蛋白的抗体识别。所述PA序列可为包括PA序列片段、主要由其组成、或由其组成的多肽。在某些实施方式中，本文所用流感病毒多肽是RNA聚合酶PBl(聚合酶碱性蛋白I)亚基、其片段、变体、衍生物或类似物。PBl蛋白负责病毒区段的复制和转录。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(HlNl)的 PBl 蛋白具有 757 氨基酸，Genbank 登录号为 AAM75156.1，其通过引用全文纳入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒PBl序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述PBl蛋白的抗体识别。所述PBl序列可为包括PBl序列片段、主要由其组成、或由其组成的多肽。在其他实施方式中，流感病毒多肽可为RNA聚合酶PB2 (聚合酶碱性蛋白2)亚基、其片段、变体、衍生物或类似物。PB2蛋白涉及转录起始和帽偷窃(cap-stealing)机制，其中细胞加帽的前体mRNA用于生成病毒转录的引物。流感病毒A/PuertoRico/8/1934 (HlNl)的PB2具有759氨基酸，Genbank登录号为AAM75155.1，其通过引用全文纳入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含与已知流感病毒PB2序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其组成、或由其组成，其中所述多肽由特异结合所述PB2蛋白的抗体识别。所述PB2序列可为包括PB2序列片段、主要由其组成、或由其组成的多肽。本文所用的术语“编码区”指由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但它可被认为是编码区的一部分，而任何侧接序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止子等均在编码区之外。术语“片段”、“类似物”、“衍生物”或“变体”指流感病毒多肽时，包括保留天然产生的流感病毒蛋白的至少一些免疫原性或抗原性的任何多肽。本发明的流感病毒多肽片段包括蛋白水解片段、缺失片段且尤其是在表达、纯化和或给予动物期间表现出溶解性增加的流感病毒多肽片段。流感病毒多肽的片段还包括递送给对象时表现出病原性下降的蛋白水解片段或缺失片段。多肽片段还包括任何包含天然多肽的抗原性或免疫原性表位的多肽部分，包括线性及三维表位。多肽抗原的“表位片段”是含表位的抗原部分。“表位片段”可包含但不需要包含一种或多种表位以外的氨基酸序列。本文所用术语“变体”指由于氨基酸取代、缺失、插入、和/或修饰而不同于所指多肽的多肽。变体可天然产生， 如亚型变体。术语〃亚型变体〃指不同流感病毒亚型中存在的多肽或多核苷酸，所述病毒亚型包括但不限于，人A/PuertoRico/8/34 (HlNl)、人A/VietNam/1203/2004(H5N1)、人 A/Hong Kong/156/97(H5N1)、人 A/Hong Kong/483/97(H5N1)、人 A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)、禽类 A/ 鸡 /HK/G9/97 (H9N2)、猪 A/ 猪 /HongKong/10/98 (H9N2)、禽类 A/FPV/Rostock/34 (H7N I)、禽类 A/ 火鸡 /Italy/4620/99 (H7NI)、禽类 A/FPV/Weybridge/34(H7N7)、人 A/New Caledonia/20/99 (HlNl)、人 A/Hong Kong/1/68(H3N2)、人 A/Shiga/25/97(H3N2)、人 A/Singapore/1/57(H2N2)、人 A/Leningrad/134/57 (H2N2)、人A/AnnArbor/6/60 (H2N2)、人A/Brevig Mission/1/18 (HlNl)、猪 A/ 猪 /Wisconsin/464/98(H IN I)、人 A/Netherlands/219/03(H7N7)和人 A/ffyoming/3/2003 (H3N2)。亚型变体是天然产生的变体，但其也可用本领域已知的诱变技术生产。可使用本领域已知的诱变技术生成非天然产生变体。在一个实施方式中，变体多肽通过取代、缺失或添加5个或更少氨基酸而不同于已鉴定的序列。所述变体通常可通过修饰多肽序列并用例如本文所述代表性过程评估修饰多肽的抗原特性来鉴定。多肽变体与已鉴定的多肽有至少约60-70%、例如75%、80%、85%、90%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%的序列相同性。变体多肽可包含保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。多肽衍生物是被改变从而表现出天然多肽上没有发现的其他特征的多肽。例子包括融合蛋白。类似物是本发明多肽的其他形式。一个示例是通过切割前蛋白产生活性成熟多肽而可激活的前蛋白。变体还可或另外包含其他修饰，例如多肽可偶联或耦合如融合其他多肽如蛋白N末端的信号(或前导)序列，所述序列共翻译或翻译后指导蛋白转移。所述多肽还可偶联或生成耦合于接头或其他序列以便于合成、纯化或鉴定所述多肽(如6-His)或增强多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可偶联或耦合免疫球蛋白Fe区域。所述多肽还可偶联或耦合某序列，所述序列赋予或调控对所述多肽(如T细胞表位、B细胞表位、细胞因子、趋化因子等)的免疫响应和/或通过抗原呈递细胞或其他免疫系统细胞提高所述多肽的摄入和/或加工。所述多肽还可偶联或耦合来自流感病毒和/或来自其他细菌和/或其他病毒的其他多肽/表位以生成杂交免疫原性蛋白，其单独或与各种佐剂组合能引发对其他病原生物体的保护免疫。本文所用的术语“序列相同性”指两种或更多种多核苷酸序列之间或两种或更多种多肽序列之间的关系。当一个序列中的位置被对比序列的相应位置中相同核酸碱基或氨基酸残基占据时，所述序列被称为在该位置“相同”。“序列相同性”百分比通过测定两个序列中出现的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目来计算，得到“相同”位置的数目。然后“相同”位置的数目除以对比窗中的位置总数并乘以100，得到“序列相同性”百分比。“序列相同性”百分比通过比较对比窗中两种最优比对序列来测定。为了最优化比对用于比较的序列，比较窗中多核苷酸或多肽序列的部分可包含称为缺口的添加或缺失，而参考序列保持不变。最优化的比对是即使有缺口仍在参考和比较序列之间产生最大可能数目的“相同”位置的比对。术语“序列相同性”和“相同”在本文中可互换使用。因此，共有“序列相同性”百分比的序列应理解为“相同”百分比一样。两种序列之间的“序列相同性”百分比可用程序“BLAST 2序列”版本测定，所述程序2004年9月I日起可获自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information),包括程序 BLASTN (用于核苷酸序列比较)和BLASTP (用于多肽序列比较)，基于Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90 (12): 5873-5877，1993)。使用“BLAST 2 序列”时，2004 年 9 月 I 日起的标准参数可用于字长(3)、缺口开放罚分(11)、延伸缺口罚分(I)、缺口降低(50)、期望值(10)和任何其他需要的参数，包括但不限于基质选择。本文所用的术语“表位”指动物中具有抗原或免疫原性活性的多肽部分，例如哺乳动物，例如人。本文所用的“免疫原性表位”定义为引发动物中免疫响应的蛋白部分，如本领域任何已知方法所测。本文所用的术语“抗原表位”定义为抗体或T细胞受体能免疫特异结合其抗原的蛋白部分，如本领域任何已知方法所测。免疫特异结合不包括非特异结合但不必然排除与其他抗原的交叉反应。虽然所有免疫原性表位为抗原性的，但抗原表位不需要为免疫原性。“有效量”是以单剂量或一系列剂量的一部分而给予个体能有效进行治疗或预防的量。例如，如感染性流感病毒攻击2周后所测，当给予量使流感病毒感染发生率相对未治疗个体降低时，所述量有效。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、所治疗个体的分类组(例如，人、非人灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统的响应能力、所需的保护程度、疫苗配方、医疗情况的专家评估和其它相关因素而变化。预计所述有效量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。通常单一剂量为约IOii g-10mg MVA/kg体重或修饰的运载生物体或宿主细胞的量，足以提供重组表达流感病毒多肽的可比数量。术语“对象”表示需要诊断、预后、免疫或治疗的任何对象，尤其是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括但不限于人，家养动物，农场动物，动物园动物如熊，运动类动物，宠物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊、奶牛；灵长类如猿、猴、猩猩和大猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮和虎；马科动物如马、驴和斑马；食用动物如奶牛、猪和羊；有蹄类如鹿和长颈鹿；啮齿类如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。在某些实施方式中，所述动物是人对象。术语“动物”旨在包含单数“动物”以及复数“动物”且包括哺乳动物和鸟，以及鱼、爬行类和两栖类。术语动物也涵盖模式动物如疾病模式动物。在一些实施方式中，术语动物包括有经济或其他价值的动物，如经济上重要的饲养动物、比赛动物、表演动物、祖传动物、稀有或漸危动物、或伴侣动物。具体地，所述哺乳动物可为人对象、食用动物或伴侣动物。如本文所用，“需要其的对象”指需要治疗即预防、治愈、阻止或降低流感病毒感染严重性，和/或在特定时间中使流感病毒感染症状不加重的个体。本文所用的术语“初次”或“首次”或“初免”和“加强”或“加强免疫”分别指第一次和后续免疫，即根据这些术语在免疫学中的常用定义。然而，在某些实施方式中，例如初免组分和加强免疫组分为单一制剂时，第一次和后续免疫可能并非必要，因为“初次”和“加强”组合物同时给予。术语“被动免疫”指宿主动物发展出对抗原的免疫，所述宿主动物被给予另一动物产生的抗体而不是生成针对该抗原的其自身抗体。术语“主动免疫”指宿主动物由于存在靶抗原而产生抗体。本文所用的“免疫响应”指受体对引入多核苷酸、多肽、减毒痘病毒如MVA、或本发明组合物的响应，通常表征为 但不限于产生抗体和/或T细胞。通常，免疫响应可为细胞响应如对流感病毒M2胞外域或M2胞外域串联重复(METR)特异的CD4+T细胞或CD8+T细胞或二者的诱导或活化、对流感病毒M2胞外域特异性或METR特异性抗体生产增加的体液响应，或细胞和体液响应二者。由含本发明MVA的疫苗建立的免疫响应包括但不限于MVA进入宿主细胞后对宿主细胞所表达蛋白的响应。本发明中,传染性病原(如A型流感病毒)后续攻击后，免疫响应阻止流感病毒颗粒的形成或发展。免疫响应还可包括粘膜响应，如粘膜抗体响应例如S-1gA生产，或粘膜细胞介导的响应例如T细胞响应。本文所用的“疫苗”是含免疫原性试剂和药学上可接受稀释剂并组合赋形剂、佐齐U、添加剂和/或保护剂的组合物。免疫原可由完整传染剂或所述传染剂的分子亚组(由所述传染剂合成或重组生产，包括但不限于多肽或多核苷酸)构成。例如，本文所用的“MVA疫苗”表示含分离MVA的组合物，所述MVA包含编码多重拷贝M2胞外域肽(如M2e串联重复)和药学上可接受稀释剂并组合赋形剂、佐剂、添加剂和/或保护剂的至少一种多核苷酸。疫苗给予对象时，免疫原刺激免疫响应，所述免疫响应在用传染剂后续攻击后会保护对象免于疾病或减轻该试剂引起的病理学、症状或临床表现。根据本发明所述疫苗可为治疗性或预防性。治疗性(治疗)疫苗在感染后给予，旨在降低或抑制疾病进展。预防性(预防)疫苗旨在阻止首次感染或降低感染负荷。针对流感相关疾病的疫苗中使用的试剂可为减毒流感病毒，或与流感病毒有关的纯化或人工加工的分子，如重组蛋白、合成肽、DNA质粒和表达流感病毒蛋白的重组病毒或细菌。本领域技术人员容易理解，疫苗还可包括其他组分如赋形齐IJ、稀释剂、运载剂、防腐剂、佐剂或其他免疫增强剂、或其组合。多价疫苗指从两种或更多种痘病毒中制备的任何疫苗，如MVA，其各表达不同抗原，如不同流感病毒抗原。或者，多价疫苗包括单一分离痘病毒如MVA包括编码两种或更多抗原(如不同的流感病毒抗原)的多核苷酸。所述两种或更多抗原如流感病毒抗原可源自相同多肽，但含有可诱导非交叉反应性免疫响应的不同表位。本文所用的术语“免疫原性运载体”指第一多肽或其片段、变体或衍生物，其增强第二多肽如抗原表位、其片段、变体或衍生物的免疫原性。术语“佐剂”指具有下述能力的任何材料:(I)改变或增加对具体抗原的免疫响应或⑵增加或辅助药物试剂的效果。如本文所用，可能增加本发明MVA的表达、抗原性或免疫原性的任何化合物是潜在的佐剂。在一些实施方式中，术语佐剂指TLR刺激佐剂，其中所述TLR佐剂包括刺激TLR受体(如TLR1-TLR13)从而使针对本发明疫苗组合物的免疫系统响应增强的化合物。TLR佐剂包括但不限于CpG和MPL。本文所用的术语“减毒”包括使传染剂例如痘病毒如MVA不能在至少一种宿主细胞例如任何哺乳动物细胞如任何人细胞中复制。减毒的MVA在某些哺乳动物细胞如BS-C-1和CV-1细胞中仍可具有有限的复制能力。虽然在某些哺乳动物细胞中不能复制，MVA仍可保留在其他哺乳动物细胞(如BHK-21细胞)以及禽类细胞中复制的完全能力，例如初级或永生鸡或鸭细胞，如AGElcr、AGElcr.pIX或丨:B66K...减毒MVA的细胞复制周期可在其生命周期的任何阶段阻断。例如，减毒MVA的细胞复制周期在后期被阻断，阻止新病毒生成和释放。本文所用的术语“复制”或“复制的”指在病毒生命周期某些部分进展的能力，如病毒基因产物的转录和翻译以及核酸复制，以及一些情况中生成或发展出成熟感染病毒颗粒的能力。多核苷酸

本发明提供含编码区域的分离多核苷酸，所述编码区域编码含多拷贝流感病毒基质2蛋白胞外域的多肽以诱导针对流感病毒的免疫响应。流感病毒基质2蛋白("M2")是质子选择性离子通道蛋白，其整合在流感A病毒的病毒包膜中。通道本身是同源四聚体，其中所述单元形成由两个二硫键稳定的螺旋。M2蛋白单元由三种蛋白结构域组成:N末端具有24个氨基酸的暴露于外部环境的胞外域、具有19个疏水氨基酸的跨膜区域、和C末端具有54个氨基酸的胞质结构域。M2蛋白在A型流感病毒生命周期中有重要作用。所述蛋白定位在病毒包膜中，使氢离子从内涵体进入病毒颗粒(病毒粒子)，从而降低病毒内的pH，这使病毒基质蛋白Ml从核蛋白RNP中分离。这是病毒去包被和将其内容物暴露于宿主细胞胞质中的关键步骤。本发明提供分离多核苷酸，其包含编码多肽的编码区，其中所述多肽含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个流感病毒基质2蛋白(M2)胞外域肽、其变体、片段、衍生物或类似物。其中M2胞外域肽可相对彼此以任何顺序排列或组合。在一个实施方式中，本发明多核苷酸包含编码多肽的编码区，其包含至少6个M2胞外域肽、其片段、变体、片段、衍生物或类似物，其中所述至少6个M2胞外域肽相对彼此以任何顺序排列或组合。术语“多拷贝的M2胞外域肽”在本文中也可与“M2e串联重复”、“M2胞外域串联重复”或“METR”互换使用。本发明所用基质2(M2)蛋白可获自A型流感肝病毒，所述病毒包括但不限于人 A/Puerto Rico/8/34(HlN I)、人 A/Viet Nam/1203/2004(H5N I)、人 A/VietNam/DT-036/2005(H5N1)、人 A/ 總鹧 /Novoslbirsk/29/2005 (H5N1)、禽类 A/ 斑头雁 /Mongolia/1/05 (H5N I)、A/ 猫 /Thailand/KU-02/04 (H5N I)、人 A/Hong Kong/213/03(H5N1)、禽类 A/ 鸡 /Guandong/174/04(H5N1)、人 A/Hong Kong/156/97(H5N1)、人 A/Hong Kong/483/97(H5N1)、禽类 A/ 鹌鹑 /Hong Kong/Gl/97 (H9N2)、禽类 A/ 鸭 /Hong Kong/Y260/97 (H9N2)、禽类 A/ 鸡 HK/FY23/03 (H9N2)、禽类 A/ 火鸡 /Germany/3/91 (HlNl)、人 A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)、禽类 A/ 鸡 /HK/G9/97 (H9N2)、猪 A/ 猪 /Hong Kong/10/98 (H9N2)、猪 A/ 猪 /Saskatchewan/18789/02 (HlNl)、禽类 A/ 野鸭 /Alberta/1302003 (HlNl)、禽类 A/ 野鸭 /NY/6750/78(H2N2)、禽类 A/ 野鸭 /Potsdam/177-4/83(H2N2)、禽类 /A/ 鸭 /Hokkaldo/95/2001(H2N2)、禽类 A/ 鸭 /Korea/S9/2003(H3N2)、猪 A/ 猪 /Shandong/2/03(H5N1)、禽类 A/ 鸡 /California/0139/2001(H6N2)、禽类 A/ 海雀 /Sweden/3/2000(H6N2)、禽类 A/ 鹅 /Hong Kong/ff 217/97(H6N9)、禽类 A/ 鸡 /British Columbia/04(H7N3)、禽类 A/ 水鸟 /Delaware/9/96(H9N2)、禽类 A/ 鸭 /Hong Kong/Y439/97 (H9N2)、禽类 A/ 短颈野鸭 /Hong Kong/W312/97 (H6N1)、猪 A/ 猪 /Korea/S452/2004(H9N2)、禽类 A/ 鸡 /Netherlands/1/2003(H7N7)、禽类 A/ 野鸭 /Alberta/2001 (HlNl)、禽类 A/ 鸭 /Hunan/114/05 (H5N1)、猪 A/ 猪 /Cotes d’Armor/1482/99 (HlNl)、猪 A/ 猪 Belzig/2/2001 (HlNl)、禽类 A/ 火鸡 /Italy/220158/2002 (H7N3)、禽类 A/HK/2108/2003 (H9N2)、禽类 A/FPV/Rostock/34 (H7N1)、禽类 A/ 火鸡 /Italy/4620/99 (H7N1)、禽类 A/FPV/ffeybridge/34 (H7N7)、禽类 A/FPV/Dobson/27(H7N7)、人 A/New Caledonia/20/99 (HlNl)、人 A/Hong Kong/1/68(H3N2)、人 A/Charlottesville/03/2004(H3N2)、人 A/Canterbury/129/2005(H3N2)、人 A/Shiga/25/97(H3N2)、人 A/Singapore/1/57(H2N2)、人 A/Leningrad/134/57(H2N2)、人 A/Ann Arbor/6/60(H2N2)、人 A/Brevig Mission/1/18 (HlNl)、人 A/Canada/720/05(H2N2)、猪 A/ 猪 /Wisconsin/464/98 (HlNl)、猪 A/ 猪 /Texas/4199-2/98 (H3N2)、禽类 A/ 火鸡 /0hio/313053/2004 (H3N2)、禽类 A/ 火鸡 /North Carolina/12344/03 (H3N2)、禽类 A/ 鹅 /Guangdong/1/98 (H5N1)、人A/Netherlands/219/03 (H7N7)、人A/Willson-Smith/33 (HlNl)、人 A/New Caledonia/20/99 (HlNl)、人 A/Japan/305/57 (H2N2)、禽类 A/ 鸡 /Iran/16/2000 (H9N2)、禽类 A/ 野鸭 /MN/1/2000 (H5N2)、A/Leiden/01272/2006 (H3N2)、A/Tilburg/45223/2005 (H3N2)、A/Pennsylvania/PIT25/2008 (H3N2)、A/NYMC X-171A (PuertoRico/8/1934-Brisbane/10/2007) (H3N2)、A/Managua/26/2007 (H3N2)、A/HongKong/l-l-MA-20D/1968 (H3N2)、A/Czech Repub Iic/I/1966 (H2N2)、A/ 鸡 /Shanghai/2/1999 (H9N2)) ]、A/Myanmar/M187/2007 (H3N2)、A/ 珠鸡 /NewYork/101276-1/2005 (H7N2)、禽类 A/ 美洲家鸭 /New York/87493-3/2005 (H7N2)、禽类A/ 火鸡 /New York/122501-2/2005 (H7N2)、禽类 A/ 野鸭 /Italy/4223-2/2006 (H5N2)和人A/Wyoming/3/2003(H3N2)。在一个实施方式中，本发明的基质2蛋白的胞外域源自流感病毒A/PuertoRico/8/34 (HlNl)。流 感病毒人 A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)的全长 M2 蛋白含 97 个氨基酸，如SEQ ID N0:14所示。编码所述M2蛋白(SEQ ID NO: 14)的核酸在本文中如SEQID NO: 13所示。流感病毒表面暴露的N末端序列是没有N末端甲硫氨酸的23个氨基酸或具有N末端甲硫氨酸的24个氨基酸(下述SEQ ID NO: 14的带下划线序列)且鉴定为胞外域("M2e")。流感病毒A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)的基质2蛋白序列(SEQ ID NO: 14)0 MSLLTEVETP IRNEffGCRCN GSSDPLTIAA NIIGILHLTL WILDRLFFKC50 IYRRFKYGLK GGPSTEGVPK SMREEYRKEQ QSAVDADDGH FVSIELE本文所用M2胞外域肽、其变体、衍生物、片段或类似物可包含位于M2胞外域肽中的抗体表位，其中所述M2胞外域肽包含约8-39个氨基酸、约9-38个氨基酸、约10-37个氨基酸、约11-36个氨基酸、约12-35个氨基酸、约13-34个氨基酸、约14-33个氨基酸、约15-32个氨基酸、约16-31个氨基酸、约17-30个氨基酸、约18-29个氨基酸、约19-28个氨基酸、约20-27个氨基酸、约21-26个氨基酸、约22-25个氨基酸、或约23-24个氨基酸，主要由其组成，或由其组成。在一个
中，M2胞外域肽主要由或由23个氨基酸组成。抗体表位的非限制性示例包括选自EVETPTRN(SEQ ID NO:1的氨基酸5_12)、SLLTEVETPT (SEQID NO:1 的氨基酸 1-10) ,ETPTRNEffECK (SEQ ID NO: 2 的氨基酸 7-17)、EVETPIRNEW(SEQ IDN0:3的氨基酸5-14)和LTEVETPIRNEWGCRCN(SEQID NO: 3的氨基酸3_19)的氨基酸序列，主要由其组成，或由其组成。或者，M2胞外域肽可为其变体、衍生物或类似物，其可被特异结合由SEQ IDNOiU
2、3、4、5或6所组成肽的抗体识别。例如，所述M2胞外域肽的变体、衍生物或类似物与SEQID N0:l、2、3、4、5*6(M2e#3_C)有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同性，其中所述变体、衍生物 或类似物被特异结合由SEQ ID N0:l、2、3、4、5或6所组成肽的抗体识别。特异结合由SEQ ID NO: 3所组成肽的抗体示例为单克隆抗体14C2，如美国专利号5，290，686所述，其通过引用全文纳入本文。M2胞外域肽的非限制性示例列于表I。表IMETR疫苗中使用的6种M2e肽(C)形式的列表
rm,n1 M2e肽的氨基酸序列舦名称 SEQ ID天然产生的流感毒株__II的流行_
SLLTEVETPTRNEWE M2e#l—C SEQ ID HS 人 1999-2008 CRCSDSSDNO:1 (70%)
SLLTEVETPTRNEWE^ ^M2e#2_C SEQ ID HS 人 1999-2008
CKCIDSSD— NO: 2 (30%)
SLLTEVETPIRNEWGM2e#3—C SEQ ID H3 人(—些 Hl)
「01311 CRCNGSSD___NO: 3__
SLLTEVETPIRNEWGM2e#4—C SEQ ID Hl 和 H3 人
CRCNDSSD___NO: 4__
SLLTEVETLTRNGWE M2e#5—C SEQ ID H9 和 H6 人,和禽类
CRCSDSSD___NO: 5__
SLLTEVETPTRNGWE M2e#6—C SEQ ID 禽类 H7,和 H35 H8, CKCSDSSD___NO: 6 H10, H2，H6, H9 中此外，本文所用的M2胞外域肽，其变体、片段、衍生物或类似物可包括但不限于M2胞外域肽变体，其中M2胞外域肽中的半胱氨酸(C)被丝氨酸(S)取代。该取代阻止了两个半胱氨酸之间形成二硫键，但不影响M2胞外域肽的免疫原性。丝氨酸取代的M2胞外域肽的非限制性示例示于表2。表2METR疫苗中使用的6种M2e肽(S)形式的列表

1.一种含编码多肽的编码区域的分离多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含至少5种流感病毒基质2蛋白(M2)胞外域肽。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意5种或更多下述氨基酸序列:EQ ID N0:l(M2e#l_C);ii SEQ ID N0:2(M2e#2_C);ii1.SEQ ID NO:3 (M2e#3_C);iv.SEQ ID N0:4(M2e#4_C);v.SEQ ID N0:5(M2e#5_C);v1.SEQ ID N0:6(M2e#6_C);vii SEQ ID N0:7(M2e#l_S);vii1.SEQ ID NO:8(M2e#2_S);ix.SEQ ID N0:9(M2e#3_S);x.SEQ ID N0:10(M2e#4_S);x1.SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和xi1.SEQ ID N0:12(M2e#6_S)。
3.一种含编码多肽的编码区域的分离多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含相对彼此以任何顺序排列的任意3种或更`多下述M2胞外域肽:EQ ID N0:l(M2e#l_C);i1.SEQID N0:2(M2e#2_C);ii1.SEQ ID NO:3 (M2e#3_C);iv.SEQ ID N0:4(M2e#4_C);v.SEQ ID N0:5(M2e#5_C);v1.SEQ ID N0:6(M2e#6_C);vii SEQ ID N0:7(M2e#l_S);vii1.SEQ ID NO:8(M2e#2_S);ix.SEQ ID N0:9(M2e#3_S);x.SEQ ID N0:10(M2e#4_S);x1.SEQ ID N0:ll(M2e#5_S);和xii SEQ ID N0:12(M2e#6_S)。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意3种或更多下述M2胞外域肽:EQ ID N0:l(M2e#l_C);ii SEQ ID N0:2(M2e#2_C);ii1.SEQ ID NO:3 (M2e#3_C);iv.SEQ ID N0:4(M2e#4_C);v.SEQ ID N0:5(M2e#5_C);和v1.SEQ ID N0:6(M2e#6_C)。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意3种或更多下述M2胞外域肽: i.SEQ ID N0:l(M2e#l_S);ii.SEQID N0:2(M2e#2_S);iii.SEQ ID NO:3 (M2e#3_S);iv.SEQ ID N0:4(M2e#4_S);v.SEQ ID N0:5(M2e#5_S);和 vi.SEQ ID N0:6(M2e#6_S)。
6.如权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意4种或更多所述M2胞外域肽。
7.如权利要求3-6中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意5种或更多所述M2胞外域肽。
8.如权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的任意6种或更多所述M2胞外域肽。
9.如权利要求1_5、7和8中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的下述M2胞外域肽:SEQ ID N0:l(M2e#l_C), SEQ ID NO: 2M2e#2_C), SEQID N0:3(M2e#3_C), SEQ ID NO:4(M2e#4_C), SEQID NO:5(M2e#5_C),和 SEQ ID N0:6(M2e#6_C)。
10.如权利要求1_4、5、7和8中任一项所述的多核苷酸,其特征在于,所述多肽包括相对彼此以任何顺序排列的下述M2胞外域肽:SEQ ID NO:7(M2e#l_S), SEQ ID NO:8(M2e#2_S), SEQ ID NO:9(M2e#3_S), SEQ ID NO:10(M2e#4_S), SEQ ID NO:11(M2e#5_S),和 SEQ IDNO:12(M2e#6_S)。
11.如权利要求l-10中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽诱导针对流感病毒的免疫响应。
12.如权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述至少2种基质2蛋白(M2)胞外域肽融合在一起而之间没有插入接头肽。
13.如权利要求1-12中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述至少2种M2胞外域肽之间插有接头肽。
14.如权利要求13所述的多核苷酸，其特征在于，所述接头肽包含至少5种氨基酸。
15.如权利要求13或14所述的多核苷酸，其特征在于，所述接头肽与低等生物中发现的氨基酸序列具有同源性。
16.如权利要求13-15中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述接头肽与灵长类动物中发现的氨基酸序列不具有同源性。
17.如权利要求16所述的多核苷酸，其特征在于，所述一种或多种接头肽包含选自SEQID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23和其任何组合的氨基酸序列。
18.如权利要求1-17中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽还包含至少一种T细胞表位。
19.如权利要求18所述的多核苷酸,其特征在于，所述至少一种T细胞表位包含一种或多种 SEQ ID NO:26 和 SEQ ID NO:27。
20.如权利要求1-19中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含SEQIDNO: 16的氨基酸序列[METR_C形式-全长]。
21.如权利要求1-19中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含SEQIDNO: 18的氨基酸序列[METR_S形式-全长]。
22.如权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码区域经密码子优化用于在人中表达。
23.如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码区域还包含可操作连接所述流感病毒基质2蛋白(M2)胞外域肽编码区域的启动子。
24.如权利要求23所述的多核苷酸，其特征在于，所述启动子包含SEQID N0:29的核苷酸序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码区域还包含其他多肽。
26.如权利要求25所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽为血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质I蛋白(Ml)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亚基(PA) ,RNA聚合酶PBl亚基(PBl) ,RNA聚合酶PB2亚基(PB2)、或两种或更多所述流感多肽或其片段的组合。
27.如权利要求26所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽是HA或其片段。
28.如权利要求27所述的多核苷酸，其特征在于，所述HA包含SEQID N0:52的氨基酸序列。
29.如权利要求26所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽是NP或其片段。`
30.如权利要求29所述的多核苷酸，其特征在于，所述NP包含SEQID N0:20的氨基酸序列。
31.如权利要求25所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽是His-标签、泛素标签、NusA标签、壳多糖结合域、ompT、ompA、pelB、DsbA、DsbC、c_myc、KS1、聚天冬氨酸、(AIa-Trp-Trp-Pro) n(SEQ ID NO:28)、聚苯丙氨酸、聚胱氨酸、聚精氨酸、B-标签、HSB-标签、绿色荧光蛋白(GFP)、钙调蛋白结合蛋白(CBP)、半乳糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)、纤维素结合蛋白(CBD’ s)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、链球菌蛋白G、葡萄球菌蛋白A、I7genel0、亲和素/链霉亲和素/iStrep-标签、trpE、氯霉素乙酰基转移酶、IacZ (D-半乳糖苷酶)、His-修补硫氧还蛋白、硫氧还蛋白、FLAGTM肽、S-标签、T7-标签、或两种或更多所述多肽的组合。
32.—种包含权利要求1-31中任一项所述多核苷酸的载体。
33.如权利要求32所述的载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。
34.如权利要求33所述的载体，其特征在于，所述病毒载体选自下组:痘苗病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和逆转录病毒载体。
35.如权利要求34所述的载体，其特征在于所述痘苗病毒载体包含改良的痘苗病毒安卡拉株(MVA)。
36.如权利要求35所述的载体，其特征在于，所述载体还表达其他多肽。
37.如权利要求36所述的载体，其特征在于，所述其他多肽为血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质I蛋白(Ml)、基质2蛋白(M2)、非结构蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亚基(PA) ,RNA聚合酶PBl亚基(PBl) ,RNA聚合酶PB2亚基(PB2)、或两种或更多所述流感多肽或其片段的组合。
38.如权利要求37所述的载体，其特征在于，所述其他多肽是HA或其片段。
39.如权利要求38所述的载体，其特征在于，所述HA包含SEQID N0:52的氨基酸序列。
40.如权利要求37所述的载体，其特征在于，所述其他多肽是NP或其片段。
41.如权利要求40所述的载体，其特征在于，所述NP包含SEQID N0:20的氨基酸序列。
42.如权利要求35-41中任一项所述的载体，其特征在于，所述MVA能在禽类细胞中复制。
43.如权利要求42所述的载体，其特征在于，所述禽类细胞是永生的。
44.如权利要求42或43所述的载体，其特征在于，所述禽类细胞是鸭细胞。
45.如权利要求44所述的载体，其特征在于，所述鸭细胞是栖鸭属视网膜细胞系或胚胎来源的细胞系。
46.如权利要求44或45所述的载体，其特征在于，所述鸭细胞是AGElcr、AGE.pIX或EB66。
47.如权利要求35-46中任一项所述的载体,其特征在于,所述多核苷酸插入所述MVA基因组中天然产生的缺失位点内。
48.如权利要求47所述的载体,其特征在于,所述天然产生的缺失位点是缺失位点3。
49.如权利要求35-48中任一项所述的载体,其特征在于,所述多核苷酸插入所述MVA基因组的开放阅读框(ORF)。
50.如权利要求32-49中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体给予需要的对象时诱导针对流感病毒的免疫响应。
51.如权利要求50所述的载体，其特征在于，所述免疫响应是体液免疫响应、细胞介导的免疫响应或体液和细胞介导的免疫响应的组合。
52.如权利要求32-51中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体能预防、缓解或治疗有关流感病毒的疾病或病症。
53.—种含权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸或权利要求32-52中任一项所述的载体的宿主细胞。
54.如权利要求53所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还包含其他重组MVA，所述MVA包含编码至少一种流感病毒蛋白或其片段的多核苷酸。
55.如权利要求54所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是禽类细胞。
56.如权利要求56-55中任一项所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞是永生的。
57.如权利要求56-56中任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是鸭细胞。
58.如权利要求57所述的宿主细胞，其特征在于，所述鸭细胞是栖鸭属视网膜细胞或胚胎来源干细胞。
59.如权利要求58所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是AGElcr、AGElcr.pIX或EB66。
60.一种由权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸或权利要求32-52中任一项所述的载体或权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞所编码的多肽。
61.—种生产流感病毒多肽的方法,所述方法包括培养权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞并回收所述多肽。
62.—种含权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸、权利要求32-52中任一项所述的载体、权利要求53-59中任一项所述的宿主细胞或权利要求60所述的多肽和药学上可接受运载体的组合物。
63.如权利要求62所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。
64.如权利要求63所述的组合物，其特征在于，所述佐剂选自下组:明矾、膨润土、胶乳和丙烯酸颗粒、普流罗尼克嵌段聚合物、鲨烯、贮存形成剂、表面活性材料、溶血卵磷脂、视黄醛、Quil A、脂质体、和普流罗尼克聚合物制剂；巨噬细胞刺激物、交替途径补充活化剂、非离子型表面细菌组分、铝基盐；钙基盐；二氧化硅；多核苷酸；类毒素；血清蛋白、病毒和病毒衍生的材料、毒剂、毒液、咪唑喹啉化合物、泊洛沙姆、toll-样受体(TLR)激动剂、mLT、CpG、MPL,阳离子脂质、Qs21、和两种或更多所述佐剂的组合。
65.如权利要求62-64中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含其他流感病毒疫苗。
66.如权利要求65所述的组合物，其特征在于，所述其他流感疫苗包含MVA，所述MVA编码相对彼此以任何顺序排列的一种或多种下述蛋白或其片段:血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(N