专利名称：miR-297b的用途的制作方法l.microRNA(miRNA)在肿瘤细胞恶性表型中的作用miRNA是近年来新发现的一类内源性非编码小分子RNA，长约为19 25个核苷酸。它通过完全/不完全与靶mRNA 3’^1 互补结合抑制靶1111 織的翻译或直接介导靶1111 織的降解(Voinnet 0，Cell. 136 =669-87,2009) 自从1993年在线虫中发现第一个miRNA分子以来，至 2011 年 4 月，在 Sanger miRBase Sequence database ver. 17. O (http://www. mirbase. org/)上共收录了 16772个成熟的miRNA，其中人类miRNA共14 个，小鼠的miRNA 720 个。miR_297b 最早是由 Mouse Genome Informatics (MGI, http://www. informatics. jax.org/)所报道的类miRNA。miRNA已被认为是多细胞生物基因表达转录后水平调控一种普遍方式，它们通过调控细胞信号转导通路上关键基因的表达进而影响生物体的生长发育，细胞增殖、分化和凋亡等一系列生理进程，并与多种人类疾病，尤其与癌症的发生密切相关(Chen CZ, et al. , Science. 303 :83-6, 2004 ；Yue J, et al. ,Cancer Biol Ther. 5 (6) 573-8,2006 ；Boren Τ, et al. , Gynecol Oncol. 110(2) :206-15,2008 ；Nicolas F.Ε, et al. , Recent Pat DNA Gene Seq. 4(3) : 142—54，2010)。与肿瘤相关的miRNA大致可分为两类，即肿瘤miRNA (Oncomir)和肿瘤抑制相关miRNA。大量的实验也证明，miRNA在多种肿瘤组织中异常表达。它们通过调节癌基因或抑癌基因的表达，参与细胞中重要的信号途径。例如miRNA-17-92簇被确认为重要的肿瘤相关基因；转基因动物研究发现，miRNA-17-四簇过量表达可导致小鼠体内淋巴细胞的异常增生，其发生机制可能与直接沉默促凋亡因子Bim和抑癌基因PTEN密切相关。而 miR-15a-16-l则是在B细胞淋巴瘤中缺失一个miRNA。作为公认的肿瘤抑制相关基因，它可以作用于抗凋亡因子Bcl2从而明显地逆转慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞MEG-01的恶性表型。因此，对miRNA的研究有助于促进人们对癌症发生发展机制的了解。随着对miRNA 功能和作用机制的进一步研究，以及新技术、新方法的应用，miRNA将在肿瘤的诊断与治疗中起着非常重要的作用。在肿瘤治疗研究方面，引入miRNA基因治疗补偿缺失的miRNA基因已经在小鼠模型中取得了很好的效果。同时，通过注射反义寡核苷酸可以直接作用于体内异常激活的miRNA，并且效果显著。2淋巴瘤发生发展的分子机制恶性淋巴瘤是免疫系统的恶性肿瘤，来源于淋巴细胞或组织细胞的恶变，与淋巴组织免疫应答反应中增殖分化产生的各种免疫细胞有关，可发生在身体的任何部位。近年来，我国恶性淋巴瘤新发病例逐年上升，每年至少超过25000例，死亡率达到1. 5/10万，占所有恶性肿瘤死亡位数的第11 13位。恶性淋巴瘤是原发于淋巴系统的一组不同病理类型和不同临床行为的肿瘤，各型具有各自特征性的分子生物学改变。细胞周期调控和凋亡异常在淋巴瘤的发病中起着重要的作用。从细胞遗传学和分子生物学角度，恶性淋巴瘤的发病机制主要有以下四种(1) 染色体异常易位引起前癌基因的激活，易位把一个正常不表达或低水平表达的基因易位到编码抗原受体的基因位点，使其表达受免疫球蛋白或T细胞受体(TCR)的增强子或启动子所调节，以致其转录失去调节。Burkitt淋巴瘤患者都有染色体结构异常，起病的关键就是易位使C-myc置于Ig增强子的控制下，从而导致C-myc表达异常。( 抑癌基因p53失活高生长比例(High-growth fraction，HGF)B细胞淋巴瘤中p53基因突变最常见，见于 17% 25%的大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤。(3)Bcl_6异常表达Bcl_6基因首先从伴有3q27转位的滤泡性淋巴瘤和大B细胞淋巴瘤中鉴定出来，具有调控细胞周期、细胞分化和免疫应答等多种功能。(4)p27Kipl的改变在反应性淋巴组织和淋巴瘤中p27Kipl表达与细胞增殖均呈负相关，休止期细胞p27Kipl强表达，增殖期细胞低表达。目前研究发现了若干miRNA分子在造血细胞分化和免疫系统疾病发生中起重要作用的，如在正常人髓系细胞中密集的miR-223参与了粒系发生过程；miR-221和miR-222 通过调节靶基因Kit抑制正常的红系分化过程；miR-150在成熟淋巴细胞中特异表达，它的一个重要靶标就是调控淋巴细胞生长发育多个步骤的转录因子c-myb ；在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，miR-155在具有激活B细胞亚型中显现而在幼稚B细胞亚型中不显现，而前者比后者的侵蚀性强。随着对miRNA的深入研究，miRNAs可能成为多种肿瘤治疗的药物靶点。3. MLLT3 的功能MLLT3(Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia(trithorax homolog, Drosophila) ；translocated to, 3),又名 AF9 (ALLl-fused gene from chromosome 9), 定位于人9号染色体短臂2区2带(9p22)，最初从人急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)中发现克隆出来(Iida et al，Oncogene，8 :3085-3092)。MLLT3 蛋白属于 YEATS蛋白家族，该家族成员被认为具有转录激活活性，其他成员为YNK7，ENL, TFIIF小亚基和GAS41。大量研究结果提示了 MLLT3为潜在的转录调控因子，在胚胎的发生、组织器官的发育以及细胞的正常活动等方面发挥着重要作用。例如MLLT3可以调控红细胞/巨核细胞分化，Cristina等人在脐带血细胞中过量表达MLLT3，造血干细胞的分化加快，促进了红细胞生成。相反的，MLLT3的敲降后，红细胞生产量减少，巨核细胞的生成量增加；MLLT3通过调节下游Hox和Cdx基因的表达来控制胚胎发育；MLLT3参与大脑皮层的形成，在皮层投射神经元的形成过程中，它可以抑制上层神经元中TBRl阳性细胞的分化。此外，MLLT3也被定义为一类原癌基因，在急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)和急性淋巴细胞性白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)中，染色体易位导致的Mll和Mllt3基因融合为认为是病发的主要原因。在造血干细胞中表达 MLL-MLLT3融合蛋白会导致急性髓性白血病，急性淋巴细胞性白血病和急性混合系白血病的发生(Wei et al.，2008)。2003年，Pession等发现Mll_Mllt3原癌基因可以直接促进 THP-I的细胞生长。最近研究表明，miRNA是多细胞生物基因表达转录后水平调控的一种普遍方式， miRNA已被证明在许多重要的生命过程中，如发育、代谢、细胞增殖、凋亡和分化过程中起重要作用。根据生物信息学预测结果显示，Mllt3是miR497b潜在靶基因。作为调控细胞分化的重要转录因子，Mllt3介导的肿瘤细胞生长和分化机制可能为人们研究肿瘤发生发展提供新的视角，为淋巴瘤预防和治疗提供新的理论依据。
本发明的目的在于提供miR497b在制备淋巴瘤治疗药物和诊断试剂中的应用。通过生物信息学分析表明，Mllt3是miR497b的潜在靶基因。3，UTR的荧光素酶报告基因实验结果表明，miR497b可以通过与Mllt3的3’UTR的结合位点的相互作用来调控MLLT3的表达。通过在淋巴瘤细胞中过表达miR497b，筛选出稳定表达miR497b的淋巴瘤细胞系，利用实时定量PCR和western blot检测发现miR497b可以显著抑制Mllt3 mRNA和蛋白表达。在以上工作基础上，对筛选出的miR497b稳定表达的淋巴瘤细胞系进行了一系列生长增殖相关的细胞生物学实验，研究结果表明，miR497b介导的Mllt3表达调降可以导致细胞周期阻滞，淋巴瘤细胞增殖的抑制，肿瘤细胞迁移能力及其在裸鼠体内成瘤能力的下降。这些细胞生长的变化部分归因于MLLT3抑制引起的PCNA水平下调以及p27Kipl水平上调。基于以上研究结果表明，miR497b在制备淋巴瘤的治疗药物和诊断试剂中的应用。通过过表达miR497b，从而抑制淋巴瘤细胞的增殖与侵袭，通过检测miR497b和Mllt3 在淋巴瘤组织中的表达水平，并结合PCNA和p27Kipl的表达水平，对淋巴瘤进行早期诊断。图lmiR497b在Mllt3_3，UTR的靶点的示意图。图2荧光素酶报告基因系统检测miR497b对Mllt3转录后抑制作用实验结果示意图。在EL4细胞中分别转染pIRES2、pmiR-297b, pMllt3 3，UTR-luc-1或者 pMllt3 3，UTR-luc-2，在转染 24h 后收集细胞，然后进行 pMllt3 3，UTR-Iuc-I 和 pMllt3 3’ UTR-luc-2报告基因检测。实验设至少3次重复(n = 3)。荧光素酶活性用β -半乳糖苷酶活性校正并将对照组标准化为1(相对荧光素酶活性)(数值表示为mean 士 SEM。NS，没有显著差异，***，P<0. 001)。图3实时定量PCR检测EL4细胞中miR497b抑制Mllt3mRNA表达的实验结果示意图。通过将miR497b的前体序列片段插入pFlag-CMV载体上构建成miR497b的表达载体，稳定转染到EL4细胞中筛选稳定表达miR497b的细胞系。EL4为正常野生型细胞， EL4-pcDNA为转染空白载体的对照细胞，EL4_pmiR297b为稳定转染miR497b的EL4淋巴瘤细胞。18S rRNA作为实时定量PCR检测的内参照。图4Western blot检测EL4细胞中miR197b抑制MLLT3蛋白表达的实验结果示意图。图^Swestern blot结果图；图4b为western blot条带的光密度扫描分析结果图。β-actin作为western blot检测的内参照。图5miR497b稳定表达的EL4细胞系MTT实验结果示意图。miR497b稳定表达的 EL4细胞系增殖受到抑制(MTT assay)。在96孔板中接种4 X IO3细胞/孔，每隔24h加入 10 μ 1浓度为5mg/ml MTT溶液于37°C反应4h，然后加入100 μ 1 DMSO/孔溶解lh，酶标仪测定溶液 0D490(n = 3，*，P < 0. 05，**，P < 0. 01，***，P < 0. 001)。图6实时定量PCR检测稳定转染miR497b的淋巴瘤细胞系中Pcna mRNA表达实验结果图。稳定表达细胞株在含有0. 4mg/ml G418的RPMI-1640维持培养。收集1 X IO6个细胞提取 RNA，并进行 Pcna mRNA 的表达检测(n = 3, NS, not significant，***，P < 0. 001)。 18S rRNA作为实时定量PCR检测的内参照。图7Wetern blot检测稳定转染miR497b的淋巴瘤细胞系中PCNA蛋白表达实验结果图。稳定表达细胞株在含有0. 4mg/ml G418的RPMI-1640维持培养。收集1 X IO6个细胞提取蛋白，并进行PCNA蛋白的表达检测(n = 3，NS，差异不显著，**，P < 0. 01)。图7a 为western blot结果图；图7b为western blot条带的光密度扫描分析结果图。β-actin 作为western blot检测的内参照。图8miR497b稳定表达的EL4细胞系Transwel迁移实验示意图。miR-297b稳定表达的EL4淋巴瘤细胞迁移受到抑制。细胞饥饿24h后，稀释到适当浓度，接种于Transwell 小室的上室中，培养4 后，染色，观察细胞的迁移效率。数值表示为mean士SEM(n = 3，NS， 差异不显著，***，Ρ < 0. 001)。图8a为显微镜200倍放大图片图8b为细胞计数分析结果。 相对迁移速率=(实验组膜细胞计数/对照组膜细胞计数)X 100%。图9miR497b稳定表达的EL4细胞系Transwel侵袭实验示意图。miR-297b稳定表达的EL4淋巴瘤细胞侵袭受到抑制。细胞饥饿24h后，稀释到适当浓度，接种于Transwell 小室的上室中，培养4 后，染色，观察细胞的侵袭效率。数值表示为mean士SEM(n = 3, NS, not significant，*#，P < 0. 001)。左图为显微镜200倍放大图片；右图为细胞计数分析结果。相对侵袭速率=(实验组膜细胞计数/对照组膜细胞计数)X 100%。图10细胞周期检测实验示意图。细胞饥饿24h后，细胞计数接种于M孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养24h收集细胞，75%乙醇固定，4°C过夜，加入 RNase A于37°C孵育30min后，加入溴化乙锭染色，上流式细胞仪检测细胞周期。(n = 3， ***，P < 0. 001)。图11实时定量PCR检测稳定转染miR497b的淋巴瘤细胞系中ρ21αρ Λ Αη和p27Kipl mRNA表达实验结果图。稳定表达细胞株在含有0. %ig/ml G418的RPMI-1640维持培养。收集丄父砂个细胞提取！？嫩，并进行？？广吣—和？〗 1"151 mRNA的表达检测(n = 3，NS，差异不显著，***，P<0. 001)。18S rRNA作为实时定量PCR检测的内参照。图12 Wetern blot检测稳定转染miR197b的淋巴瘤细胞系中p21GipVwAF1和p27Kipl 蛋白表达实验结果图。稳定表达细胞株在含有0. %ig/ml G418的RPMI-1640维持培养。收集化砂个细胞提取蛋白，并进行？〗^ 和p27Kipl蛋白的表达检测(n = 3，NS, not significant, **，P < 0· 01)。图 12a 为 western blot 结果图；图 12b 为 western blot 条带的光密度扫描分析结果图。β-actin作为western blot检测的内参照。图13肿瘤生长曲线示意图。在5周龄雄性裸鼠的右侧背部皮下各注射100 μ 1 EL4、EL4-pcDNA和EL4-pmiR497b这3个细胞系的细胞悬液(含5X IO5个细胞)，其中EL4 和EL4-pCDNA作为阴性对照。7天后待裸鼠长出明显肿瘤，测量肿瘤的长、宽数值，并根据公式(体积(mm3)=长X宽7 计算肿瘤体积，绘制肿瘤的生长曲线。图14肿瘤重量示意图。在细胞注射后第观天处死裸鼠，取出裸鼠皮下肿瘤，称量肿瘤重量(n = 5，**，P < 0. 01)。图15肿瘤组织中MLLT3和PCNA蛋白表达实验结果图。取异位瘤，用裂解液勻浆6裂解肿瘤组织，进行western blot检测，图15a为western blot结果图；图MbSwestern blot条带的光密度扫描分析结果图(n = 5，***，P < 0. 001)。

为了进一步解释MLLT3下调所引起的细胞周期G1/S期阻滞的机制，检测了周期蛋白依赖性激酶抑制物⑶KI家族的p21GWwAF1和P27Kipl的mRNA和蛋白表达水平。Western blot结果显示，miR-297b抑制Mllt3表达后对p21gWwaf1表达影响作用不大；而p27Kipl的 mRNA和蛋白表达水平则在MLLT3下调后约有2倍的升高(P < 0. 01)。p27Kipl在细胞周期的调控中发挥着重要的作用。它能与cyclin结合，抑制cyclin-⑶K的活性，阻止细胞由Gl 期向S期的转变。此外，p27Kipl的表达水平也是反映肿瘤侵袭与迁移的一个重要的标志，其低表达者抑制细胞增殖作用减弱，恶性程度增高，侵袭和转移能力增强。结合细胞迁移和细胞周期的实验结果，暗示了 MLLT3有可能通过调控p27Kipl的表达，进而发挥增强细胞迁移和促进淋巴瘤细胞周期的作用。5. miR-297b抑制Mllt3表达后抑制淋巴瘤细胞裸鼠成瘤能力为了进一步研究miR497b抑制Ml 113表达后对肿瘤生长能力的影响，检测了 miR-297b稳定表达细胞系在裸鼠皮下肿瘤形成和生长能力。在5周龄雄性裸鼠的右侧背部皮下各注射100 μ 1 EL4、EL4-pcDNA和EL4-pmiR497b这三个细胞系的细胞悬液(含5X IO5 个细胞)，其中EL4和EL4-pCDNA作为阴性对照。7天后待裸鼠长出明显肿瘤，测量了肿瘤的长、宽数值，并根据公式(体积(mm3)=长X宽7 计算肿瘤体积，得出肿瘤的生长曲线。在细胞注射后第观天处死裸鼠，取出裸鼠皮下肿瘤，称量肿瘤重量并拍照。实验结果表明，EL4-pmiR497b细胞系成瘤能力显著下降，在裸鼠皮下形成的肿瘤重量约为对照组肿瘤的50% (P <0.01)这些实验表明，在体内，miR497b可以抑制Mllt3表达从而抑制淋巴瘤细胞的肿瘤生长能力。此外，对分离出来的肿瘤组织进行勻浆裂解，提取总蛋白进行western blot检测。 实验结果显示，EL4-pmiR497b细胞系形成的肿瘤中MLLT3和PCNA蛋白表达水平明显低于对照组肿瘤蛋白水平，其中MLLT3和PCNA的蛋白表达均下降了约60% (P < 0. 001)，这说明miR497b抑制Mllt3表达后抑制了淋巴瘤细胞的增殖能力。这表明PCNA参与了 MLLT3 在体内的功能。


miR-297b的用途，涉及一种生物医学材料小分子RNA。提供miR-297b在制备淋巴瘤治疗药物和诊断试剂中的用途。公开了microRNA-297b在制备淋巴瘤的诊断试剂和治疗药物中的应用。通过大量实验证明miR-297b通过作用于其靶基因Mllt3进而间接调控p27Kip，从而抑制肿瘤细胞的增殖，迁移，侵袭和成瘤能力。因此，检测miR-297b及其下游基因Mllt3和p27Kip1的表达，可以对肿瘤进行早期诊断，对肿瘤的转移和预后做出评价。