专利名称：一种血管内皮生长因子壳聚糖微球及应用的制作方法血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)是一种广泛 存于组织细胞，具有多种生物学功能的糖蛋白。VEGF具有很强的促血管内皮细胞增殖、促新 生血管生长的功能。通过加强VEGF的表达，VEGF及其基因治疗在改善心肌缺血、抗动脉粥 样硬化、防治动静脉血管损伤及防治血管再狭窄、促进心血管移植、骨科缺血性疾病及骨折 治疗等方面均有重要的作用。如果抑制VEGF的表达，拮抗其生物效应则为肿瘤的治疗开展 了新途径。但是，单纯地将VEGF植入机体内，VEGF很容易在机体内被扩散、稀释、降解，生 物利用度低，应用效果差。这就需要将VEGF加入合适的载体中，使其免受蛋白酶降解或扩 散，在需要的地方较长时间控制释放，实现在一定时间内保持局部较高的浓度，利于有效的 发挥其生物活性。壳聚糖是壳聚糖是从虾、蟹等废弃甲壳中提取得到的一种生物活性物质，由甲壳 素在强碱性条件下进行脱乙酰基作用后形成的一种重要的衍生物，化学名称为聚葡萄糖胺 (1-4) -2-氨基-B-D葡萄糖，壳聚糖不仅来源丰富，制备简单，而且具有很好的生物相容性， 在体内能完全降解并代谢，其分解产物及代谢产物对人体健康无害。目前利用壳聚糖制备缓释、控释制剂已经取得较好的效果，尤其是利用壳聚糖微 球包封药物已引起人们浓厚的兴趣。如用壳聚糖微球包封抗癌药(52Fu、顺钼等)、消炎药 (地塞米松等)、利尿剂(茶碱)和生化药物(小牛胸腺DNA)等；碱性成纤维细胞生长因 子壳聚糖微球具有优良缓释效能。壳聚糖微球包封药物有以下特点①有明显的控制药物 释放和延长药效的作用；②增加药物的靶向性；③降低所包封药物的毒副作用；④提高药 物的稳定性；⑤提高疏水性药物对细胞膜的通透性。壳聚糖微球的制备方法有乳化交联法、溶剂蒸发法、复乳法、喷雾干燥法、沉淀/ 凝聚法和壳聚糖溶液包裹法。乳化交联法是制备壳聚糖微球最成熟的方法之一，制得的微 球球形好，粒径均勻，有很好的可溶胀性。但由于使用了戊二醛或甲醛等化学交联剂，对蛋 白质类细胞因子有一定的破坏作用，使其应用有一定的局限。因为多肽蛋白质类药物都含 有氨基，会与交联剂的醛基发生作用而失活。而采用Berthold的沉淀/凝聚法则不需有机 溶剂和戊二醛等交联剂，反应条件温和，操作简单易行，PH近中性，对蛋白质类细胞因子影 响较小。
本发明的目的是提供一种血管内皮生长因子壳聚糖微球，微球的基质为壳聚糖 (脱乙酰度彡90.0%，黏度< 100 mPa*s，购自sigma公司)，包裹的活性蛋白是血管内皮生长因子(human VEGF 121，购自P印ro-tech公司)，药物包封率为74. 99%，包载的药量为每 20mg 微球含 0. 15-1. 45ugVEGF。本发明采用Berthold的沉淀/凝聚法制备壳聚糖微球，反应条件温和，操作简单 易行，PH近中性，对血管内皮生长因子影响较小。本发明中壳聚糖与交联剂多聚磷酸钠的浓度均为2. 5g/L，体积比为4:1。本发明提供的一种血管内皮生长因子壳聚糖微球可在制备促血管内皮细胞增殖 和促新生血管生长药物中的应用。实验证实，壳聚糖微球可以对血管内皮生长因子进行良 好的包载和包封，并且可以在较长时间内对血管内皮生长因子的释放进行良好的控制。本发明的特点在于利用壳聚糖微球作为载体，包裹血管内皮生长因子，经实验证 实，壳聚糖微球可以对血管内皮生长因子进行良好的包载和包封，并且可以在较长时间内 对血管内皮生长因子的释放进行良好的控制。并且，载体在给药后无需再次取出，在体内可 以完全降解并代谢，其分解产物及代谢产物对人体健康无害，在医药领域有良好的应用前 景，如加快成骨过程，促进骨折的愈合，加速创面血管的生成等。图1为血管内皮生长因子壳聚糖微球原子力显微镜图(标尺1000纳米)。图2为血管内皮生长因子壳聚糖微球扫描电镜图(标尺500纳米)。图3为血管内皮生长因子壳聚糖微球体外释放曲线。采用改良的Berthold法制备壳聚糖微球，方法如下取200mg壳聚糖溶于80ml 2%的 冰乙酸中，加Iml吐温-80磁力搅拌2小时，超声振荡至溶液澄清。室温磁力搅拌下缓慢滴 加20ml的浓度为2. 5mg/ml的交联剂多聚磷酸钠，磁力搅拌2小时。lOOOOrpm/min，离心15 分钟，所得沉淀纯水反复离心洗涤水洗3次，收集送冻干保存，得到空白的壳聚糖微球。壳 聚糖与交联剂多聚磷酸钠的浓度均为2. 5g/L，体积比为4:1。VEGF壳聚糖微球的制备精确秤取壳聚糖冻干微球20mg于EP管中，加0. 9ml 觊冰乙酸与0. Iml VEGF，超声振荡。置于4°C摇床(l!35r/min)混勻，6小时后IOOOOrpm/ min,离心15分钟，沉淀纯水反复离心洗涤水洗3次，沉淀送冷冻冻干，最后所得即为制备 的VEGF壳聚糖微球。收集离心液和洗涤上清液。所得空心微球外观呈圆球形，均勻度 好，颗粒规则无粘连，粒径较均勻，多在200-300纳米间，球体表面较光滑，微球表面形态 学观察见原子力显微镜(参见图1)和扫描电镜(参见图2)。包载的药量为每20mg微球含 0.15-1. 45ugVEGF。实施例2 包封率与载药量研究
取实施例1所得离心液(Iml)、每次洗涤上清液(Iml)，以PBS稀释50倍，取Iml于离 心管中作为待测样本，按照ELISA试剂盒说明书操作，测定其吸光度(A450)值。根据标准 曲线的标准方程计算样品中VEGF浓度，从而推算出离心液、洗涤上清液及合并液中VEGF总量。


本发明提供一种血管内皮生长因子壳聚糖微球，微球的基质为脱乙酰度≥90.0%，黏度<100mPa s的壳聚糖，包裹的活性蛋白是血管内皮生长因子，微球粒径为200-300纳米。本发明利用壳聚糖微球作为载体，包裹血管内皮生长因子，经实验证实，壳聚糖微球可以对血管内皮生长因子进行良好的包载和包封，并且可以在较长时间内对血管内皮生长因子的释放进行良好的控制。并且，载体在给药后无需再次取出，在体内可以完全降解并代谢，其分解产物及代谢产物对人体健康无害，可在制备促血管内皮细胞增殖和促新生血管生长药物中的应用。