专利名称：针对黄病毒感染的重组包膜疫苗的制作方法 黄病毒科包括原型黄热病病毒(YF)、四种血清型的登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、日本脑炎病毒(JE)、蜱媒脑炎病毒(TBE)和约70种其他致病病毒。黄病毒是小型包膜病毒，含有一条正链RNA基因组。黄病毒的包膜衍生自宿主细胞膜，嵌有病毒编码的跨膜包膜蛋白。最大的病毒结构蛋白质E糖蛋白含有功能性结构域，负责细胞表面吸附和核内体融合活性。它也是宿主免疫系统的主要目标，诱导病毒中和抗体和保护性免疫力，以及抑制凝血作用的抗体。虽然黄病毒传播和感染病理学在不同病毒中变化很大，但是登革热病毒是该科的一个说明性例子。登革热病毒通过伊蚊属(主要是埃及伊蚊(A.aegypti)和白纹伊蚊(A.albopictus)传播给人。该病毒导致特征为高烧、头痛、肌肉和关节疼痛、皮疹的疾病。一些病例(尤其在儿童中)导致感染的更严重形式，即登革出血热/登革热休克综合征(DHF/DSS)，表现是严重出血，血管渗漏或两者，导致休克。如果没有及时的诊断和药物干预，DHF/DSS的突然发作和迅速发展可能是致命的。就全球发病率和死亡率，登革热是节肢动物传播的病毒中最重要的一群，估计每年有100,000,000例登革热发生，包括25,000-50,000例DHF/DSS(Rigau Perez等，1998；Gubler，1998)。随着全球人口增长，人口城市化(尤其在热带地区)和缺乏对蚊子长期控制的措施，登革热的蚊子载体将其分布扩大到了热带、亚热带和一些温带地区，给全世界一半以上的人群带来了登革热感染的危险。现代的喷气式飞机旅行和人类迁移促进了血清型登革热的全球分布，因此在许多地区现在流行着多种血清型的登革热。与此同时，登革热流行的频率和DHF/DSS的发生率在过去15年中增加。例如，在东南亚，DHF/DSS是儿童住院和死亡的主要原因(Hayes和Gubler，1992)。黄病毒基因组是一条正链RNA分子，长约10,500个核苷酸，含有短5’和3’非翻译区，一个长开放阅读框，一个5’帽，和非聚腺苷酸化3’末端。已报道了各种黄病毒基因组(包括所有四种DEN血清型和YF病毒)完整的核苷酸序列(Fu等，1992；Deubel等，1986；Hahn等，1988；Osatomi等，1990；Zhao等，1986；Mackow等，1987；Rice等，1985)。该单一开放阅读框编码的10个基因产物已翻译成按下列顺序组织的一个多蛋白衣壳(C)蛋白，前膜/膜(prM/M)蛋白，包膜(E)蛋白，非结构蛋白(NS)1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5(Chambers等，1990)。该多蛋白的加工是由共翻译开始的，完全成熟需要宿主和病毒编码的蛋白酶。已通过比较核苷酸序列和病毒蛋白质氨基末端序列，确定了YF病毒中蛋白水解切割的位点。多蛋白加工开始后，prM在病毒释放中被转变成M(Wengler和Wengler，1989)，病毒在成熟过程中加工锚定的C蛋白(Nowak和Wengler，1989)。虽然所有登革热病毒在抗原上相关，但存在明确的4种血清型的登革热抗原性区别。感染了一种血清型的个体提供了抵抗该血清型重新感染的长期免疫力，但不能保护免受其他血清型的感染。事实上，一种血清型感染获得的免疫力可能潜在的增强其他血清型登革热的病原性。这特别令人困扰，因为异源血清型的二次感染由于病毒传播变得越来越普遍，导致在许多地理区域内多种血清型共同周转和DHF/DSS病例数增加(Rigau Perez等，1998；Gubler，1998)。Halstead(1982)显示抗登革热抗体能在体外增强病毒感染性，并提出血清型交叉反应性的针对E的非中和抗体能增强体内感染，导致DHF/DSS(Halstead，1981)。然而该观点并未被普遍接受(Rosen，1989)。特别是可引起致病性增强的登革热基因产物仍然是一些争论的主题。例如，已提出对NS3专一性的血清型登革热-交叉反应性CD4+CD8-细胞毒性T细胞(CTL)，可通过产生IFN-γ和通过裂解登革热病毒感染的单核细胞导致DHF/DSS发病(Kurane等，1991；Okamoto等，1998；Mathew等，1998)。近来的证据显示，对E特异性的CTL不是血清型-交叉反应性的，这可能提示用E亚单位疫苗不会诱导潜在的有害交叉反应性CTL应答(Livingston等，1994)。其他研究已提示NS1在DHF/DSS中的可能作用(Falconer，1997)。不论二次异源登革热感染增强致病性的机制如何，使用四价疫苗的策略应能避免这种并发症。现可得到的综述有助于认识登革热疾病的性质、尝试开发合适的疫苗的历史、黄病毒共有的结构特征、以及黄病毒包膜蛋白的结构特征(Halstead 1988；Brandt 1990；Chambers等，1990；Mandl等，1989；Henchal和Putnak，1990；Putnak 1994；Rey等，1995；Rigau Perez等，1998；Gubler，1998；Cardosa，1998)。虽然已寻找到许多制备登革热疫苗的方法，但现在还没有可接受的疫苗。虽然开发候选登革热减毒活疫苗株的投入中已作出了大量努力，但迄今测试的病毒株证明是不能令人满意的(见例如，Eckels等，1984；Bancroft等，1984；McKee等，1987)。虽然成功有限，但继续开发和测试着候选的减毒活疫苗株(Hoke等，1990；Bhamarapravati等，1987；Dharakul等，1994；Edelman等，1994；Angsubhakorn等，1994；Vaughn等，1996)。几种感染性全长黄病毒克隆的构建(Rice等，1989；Lai等，1991；Sumiyoshi等，1992；Kapoor等，1995；Polo等，1997；Kinney等，1997；Gualano等，1998)促进了鉴定黄病毒毒性决定簇的研究(Bray和Lai，1991；Chen等，1995；Kawano等，1993；Cahour等，1995；Men等，1996；Hiramatsu等，1996；Pryor等，1998；Lai等，1998；Gualano等，1998；Valle和Falgout，1998)。虽然这些研究仍然非常初步几乎未获得毒性信息，但是这些研究衍生的cDNA克隆已被用于开发重组嵌合性登革热疫苗株的骨架(Bray和Lai，1991；Chen等，1995；Bray等，1996；Lai等，1998)。然而，开发适当减毒的病毒株和实现平衡的四价制剂的困难仍然困扰着所有的活病毒疫苗法。类似的，开发登革热死疫苗的尝试也只收到了有限的成功。这些研究主要收到不能从细胞培养系统中获得足够的病毒产率所限制。昆虫细胞(如C6/36细胞)的病毒产量通常是104-105pfu/毫升，远在生产具有成本-效益的死疫苗所需水平之下。哺乳动物细胞(包括LLC-MK2和Wero细胞)的产量高一些，但最高产量(一Vero细胞系约108pfu/ml)仍低于实现真正的具有成本-效益的疫苗产品所需的水平。由于没有有效的登革热减毒活疫苗或死疫苗，因此在开发重组的登革热亚单位或病毒-载体疫苗中投入了大量努力。用重组DNA法的许多疫苗尝试集中于E糖蛋白。该糖蛋白是亚单位疫苗的一种合理选择，因为它是病毒生物学和宿主对病毒免疫应答的关键成分。E糖蛋白暴露于病毒表面，与细胞受体结合，介导融合(Chambers等，1990；Chen等，1996)。还已经显示它是中和抗体应答的主要目标。针对纯化的黄病毒E糖蛋白的单克隆抗体在体外具有中和性，一些已显示能赋予体内被动保护力(Henchal等，1985；Heinz等，1983；Mathews等，1984；Kimuro-Kuroda和Yasui，1988)。
虽然黄病毒E糖蛋白的一级氨基酸序列是不同的(45-80％相同性)，但它们都具有12个保守半胱氨酸残基，形成6个二硫键，其几乎可叠加的亲水性模式提示，它们可能具有相似的二级和三级结构。近来，以2?分辨率(Rey等，1995)解译了蜱媒脑炎(TBE)病毒包膜糖蛋白的一可溶性片段的结构。共同合成prM和E看来对于获得E的天然构型是重要的。在缺乏prM时表达E可导致一重组产物，它具有一组与天然病毒颗粒不同的表位(Konishi和Mason 1993；Heinz等，1994；Matsuura等，1989)。与prM一起表达的E表位作图提示，该共表达的蛋白质与天然病毒更加相似。由于prM和E似乎在病毒成熟过程中形成异二聚体，而且E要经历酸性pH诱导的构型转变，Heinz等(1994)提出prM与E的结合是通过分泌途径转运中防止不可逆性pH诱导的构型转变所必需的。然而，己显示在缺乏prM情况下表达的黄病毒E蛋白的羧端截短形式能诱导抵抗攻击的保护力(Men等，1991；Jan等，1993；Coller等，未公开资料)，提示在prM缺乏时E蛋白的表达可导致保护性表位的出现。
迄今已在几种异源表达系统中表达了重组登革热E糖蛋白(见Putnak，1994和Chambers等，1997近来的综述)。通常由于受到抗原质量、数量或两者的限制，对于生产具有成本效益的登革热疫苗，这些系统被证明是无效的。下列段落着重于叙述主要的登革热重组亚单位疫苗的尝试，并总结迄今获得的结果。
用大肠杆菌的大部分尝试得到的弱免疫原不能诱导保护性应答。这可能反映了细菌表达的登革热蛋白质不是天然构型的，和通过分泌途径加工病毒蛋白质以达到正确形成二硫键和糖基化的必要性。虽然小鼠初步试验提示有某种水平的效力(Srivastava等，1995；Mason等，1990)，但随后在灵长类试验中不能证实该效力(R.Putnak，个人通讯)。近来，将编码DEN-2病毒包膜蛋白的氨基酸298-400(B结构域)的基因片段融合表达成与大肠杆菌甘露糖结合蛋白的融合蛋白(Simmons等，1998)。该融合蛋白仅赋予小鼠抵抗DEN-2病毒致死剂量攻击性感染的部分保护力，再次证明了大肠杆菌表达产物的效力有限。我们实验室的工作证实大肠杆菌表达的重组产物不能诱导小鼠中登革热的特异性免疫应答。
使用真核酵母表达系统酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母(Pichia patoris)表达登革热E蛋白也已证明获得的免疫原性重组产物的量低于所需的量。我们实验室的工作证实在这些系统中实现的登革热E蛋白表达水平比产生具有成本-效益的登革热疫苗所需的低。其他实验室的工作提示，该系统可用于产生病毒样颗粒(Sugrue等，1997)。然而，表达水平也非常低，该重组产物诱导的中和抗体滴度也非常低(1∶10；Sugrue等，1997)，尽管报道该表达系统能非常有效的异源表达各种重组产物(Cregg等，1993)。
使用杆状病毒表达系统产生黄病毒亚单位疫苗也收到了有限的成功(Putnak综述，1994)。与各种异源蛋白质在杆状病毒系统中高表达水平的报道相反，黄病毒结构蛋白的表达水平仅是轻度的(Deubel等，1991；Staropoli等，1997)。另外，一组抗黄病毒单克隆抗体(MAb)的反应性表明，表达的黄病毒蛋白不存在许多构型性敏感的表位(Deubel等，1991)。这提示杆状病毒系统产生的重组E蛋白的折叠可能与天然病毒E蛋白不同。另外，用杆状病毒-表达的DEN-1(Putnak等，1991)、DEN-4(Eckels等，1994)、DEN-2/DEN-3杂交体(Bielefeldt-Ohmann等，1997)、日本脑炎病毒(McCown等，1990)或黄热病病毒(Despres等，1991)的重组包膜蛋白免疫不能诱导出基本滴度的病毒中和抗体，或抵抗病毒攻击的保护力。近来，Staropoli等(1997)用亲和纯化的DEN-2包膜作为免疫原，能在小鼠中显示中和性抗体和某种保护力。将截短的包膜糖蛋白的C-末端用6个组氨酸残基(His6尾)代替最后100个氨基酸进行修饰，然而，该产物仅诱导了轻度的中和抗体滴度，在灵长类中仅显示部分保护力(Velzing等，1999)。
有几篇报道描述了痘病毒-黄病毒重组株可表达作为聚蛋白质一部分的包膜蛋白。通过在表达黄病毒蛋白质的痘病毒中共表达prM和E，获得了最一致的成功结果。用表达日本脑炎(JE)病毒prM和E蛋白的重组痘病毒免疫小鼠，产生了较高的中和抗体滴度，并能在更高剂量的病毒攻击(＞10,000LD50；Konishi等，1992)下存活。与此相比，采用仅表达E的重组痘病毒免疫的小鼠在＞10LD50病毒攻击时不能存活(Mason等，1991)。类似的，用重组表达prM-E的痘病毒-黄热病(YF)病毒免疫的小鼠受到保护抵御了病毒攻击(水平相当于减毒YFV-17D疫苗)，而痘病毒-YF病毒重组株(表达E-NS1、C-prM-E-NS1或NS1)不能保护小鼠(Pincus等，1992)。表达prM-E的痘病毒-DEN-1重组株诱导了小鼠的中和抗体和血凝抑制抗体，而表达DEN-1 C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b的重组株不能诱导E-特异性免疫应答(Fonseca等，1994)。该技术领域最近缺乏进展主要与其实用性有限有关，以及与痘病毒载体用于人免疫接种的问题有关。
采用基于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的哺乳动物表达系统来表达登革热病毒E蛋白也是令人失望的。我们和其他实验室的努力显示，虽然它是产生各种重组产物的非常有用的表达系统(Bebbington和Hentschel，1987；Cockett等，1990；Kaufman等，1985；Kaufman，1990)，但不能有效表达DEN-2 E。DEN-2 80％E的胞内表达水平是≤100纳克/毫升，分泌不可检测到。
因此，虽然已开发了许多异源表达系统，并显示能有效产生某些重组产物，但不是所有表达系统都能有效产生所有的重组产物。事实上，尽管某系统据报道对于产生一种重组蛋白质有效，但对于表达其他重组产物效力的预测并不总是正确的。特别是，有效表达构型相关的黄病毒E蛋白仍然除外。上述各种各样的细菌、真菌和昆虫表达系统到哺乳动物表达系统都不能有效产生显著量的构型相关性黄病毒E蛋白，强调了异源基因有效表达的高度经验性。
过去十年内，己开发了一种用果蝇(Drosophila melanogaster)Schneider2(S2)细胞系的另一种真核表达系统，它被用于有效表达人免疫缺陷病毒的包膜糖蛋白(Ivey-Hoyle等，1991；Culp等，1991；van der Straten等，1989)。在本文中，本发明具体采用果蝇S2系统来产生重组黄病毒亚单位多肽(具体例子是登革热和日本脑炎E亚基)，并发现该系统能轻易的产生每升培养液20-50毫克重组蛋白质(未发表)。我们大部分努力所致力的重组产物是一种E蛋白的可溶形式，它的羧基端被截短，得到一条代表大约80％全长E分子(氨基酸1-395；80％E)的多肽。我们表达的80％E是含有prM的一条开放阅读框以增强上述的正确折叠和分泌。用该表达系统和重组DNA构建物的组合实现的表达水平达到(20-50毫克/升)，远远超过了其他系统，因此提供了对于疫苗生产具有成本-效益的黄病毒抗原来源。另外，我们已证明这些细胞分泌的重组80％E产物是构型相关的，即它能与构型敏感的单克隆抗体结合，并能在小鼠和猴中诱导高滴度的病毒中和抗体(Coller等，准备发表)。
佐剂是能增强对其给定抗原的免疫应答的物质。1925年首次描述了在疫苗中加入免疫刺激性化合物(Ramon，1925)。从那以后，已开发了许多佐剂，但现在人类疫苗产品仅批准使用钙盐或铝盐。虽然这些佐剂对于一些疫苗是足够有效的，但许多研究证明其他佐剂对于诱导体液和细胞免疫应答更有效，而且可用于诱导保护性应答。这些佐剂中的一些(包括弗氏完全佐剂(FCA)和Quil A)已显示在动物中是十分有效的佐剂。然而，它们具有显著的毒性或副作用，使它们不能为人用或兽用疫苗所接受。事实上，甚至最近也将氢氧化铝与动物注射部位产生的肉芽肿相关联起来，从而对其使用的安全性产生了关注。因为这些问题，对于开发没有当前佐剂(如FCA)的不良副作用的强佐剂投入了大量努力。
已开发了许多现代佐剂制剂，并显示具有显著的引用前景，特别是和重组产物联用的。已在设计用于检测效力和安全性的临床前和临床试验中测试了几种这样的现代佐剂。近来的几篇综述总结了用于开发人类疫苗的现代佐剂的方法(Cox和Coulter，1997；Gupta和Siber，1995；Hughes和Babiuk，1994)。如这些综述所述，有5种主要的佐剂作用模式免疫调节、递呈、诱导细胞毒性细胞应答、靶向和储存。各种佐剂制剂在免疫动物内针对不同作用模式，导致各种应答。对于任何给定疫苗可根据目标疾病和需要的应答预设最优的特异性佐剂制剂。然而，常常需要凭经验确定这种最佳制剂。
佐剂可用多种方法分类(Cox和Coulter，1997；Gupta和Siber，1995；Hughes和Babiuk，1994)。广义而言有两大类，颗粒状或非颗粒状佐剂。在颗粒状佐剂中有铝盐、钙盐、油包水乳液、水包油乳液、免疫刺激复合物(ISCOM)和ISCOM基质、脂质体、纳米和微米颗粒、蛋白质体、病毒颗粒、硬酯酰酪氨酸和γ-菊粉。非颗粒佐剂包括胞壁酰二肽(MDP)和衍生物(如苏氨酰MDP、胞壁肽等)、非离子嵌段共聚物、皂苷(如Quil A和QS21)、脂类A或其衍生物4’一磷酯酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖脂(TDM)、各种细胞因子(包括γ-干扰素和白细胞介素2或4)、糖类聚合物、衍生的多糖(如二乙基氨基乙基葡萄糖)和细菌毒素(如霍乱毒素或大肠杆菌不稳定毒素)。现代佐剂制剂常常设计成各种成分的组合以产生最大的特异性免疫应答。
描述各种现代佐剂在疫苗制备中的应用的文献非常广泛。许多研究已用动物模型证明，用各种重组产物和现代佐剂制剂免疫后能产生强免疫应答(Vogel综述，1998；O’Hagan 1998；Cox和Coulter，1997；Gupta和Siber，1995；Hughes和Babiuk，1994)。几种佐剂在效力和安全性上表现卓越，而且正在人类临床试验中测试。然而，任何给定佐剂的效力是免疫原依赖性的，因此不能可靠的预测哪种组合能成功。
在最有效的现代佐剂中，有ISCOM和ISCOM基质(美国专利号5,679,354)它们显示在动物中对于流感、呼吸道合胞病毒、利什曼病、疟疾和HIV免疫原有效(Andersson等，1999；Verschoor等，1999；Hu等，1998；Deliyannis等，1998；Papadopoulou等，1998；Bengtsson和Sjolander，1996；Barr和Mitchell，1996；Jones等，1995；Ronnberg等，1995；Takahashi等，1990)。还证明以可代谢的油配制的由脱毒的内毒素衍生物、单磷酰脂A、二霉菌酸海藻糖酯、含或不含细胞壁骨架组成的Ribi佐剂系统，能在动物研究中诱导强免疫应答(Baldridge和Ward，1997；Todd等，1997；Lipman等，1992；Johnson和Tomai，1990；Kenney等，1989；Tomai和Johnson，1989；Ribi等，1984)。虽然这些佐剂己显示对于某些免疫原是有效的，但也有报道描述了比理想差的效果，包括用IscoMatrix(细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)外被抗原-Carol和Nieto，1998；单纯疱疹病毒糖蛋白-Simms等，1998；利什曼主要寄生表面抗原-Sjolander等，1998)和Ribi佐剂系统(合成的多肽-Deeb等，1992；多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)抗原-McClimon等，1994；三硝基苯酚-鸡蛋清蛋白-Bennet等，1992；Smith等，1992)。因此，虽然在文献中描述了许多佐剂的可能效力，但对任何给定免疫原和任何给定目标疾病的最佳佐剂还必需凭经验来确定。
我们已证明某些现代佐剂，特别是ISCOM基质和Ribi佐剂系统(RAS)与我们果蝇表达的prM80％E黄病毒亚单位组合，获得了一种特别强的疫苗制剂。IscoMatrix是具有iscom样结构的免疫调节剂，并在iscom样结构中含有至少一种脂质和至少一种皂苷，和一种药物学上可接受的载体。该组合在小鼠和猴中诱导了非常高滴度的病毒中和抗体，并提供了抵抗病毒攻击的显著保护力。然而，我们的重组prM80％E与其他现代佐剂的组合不能诱导这种强免疫应答，提示该组合的独特性。因此，黄病毒prM80％E表达构建体与果蝇表达系统的这种独特组合使我们克服了先前在尝试有效产生重组黄病毒亚单位蛋白质疫苗中所遇到的主要限制。在该重组产物中加入特异性现代佐剂能有效克服这个最后的障碍，产生了能显著增强疫苗接种动物免疫应答的有效的黄病毒重组亚单位疫苗。下文包括描述该独特组合效力的实施例。
发明公开本发明提供了含有作为活性成分的果蝇细胞分泌的、重组产生的截短形式的黄病毒包膜糖蛋白疫苗。本发明还包括一种现代佐剂，作为该有效疫苗制剂的关键成分。该疫苗能诱导产生针对黄病毒的中和抗体，并提供保护力抵抗活病毒的攻击。在下文说明中，所有产物表达为含有prM的多蛋白，采用人组织纤溶酶原激活物分泌信号序列(tPAL)从果蝇Schneider2细胞中分泌产生其成熟的重组80％E产物。
因此在一个方面，本发明涉及一种用于保护个体抵抗黄病毒感染的疫苗。该疫苗含有作为活性成分的截短的黄病毒包膜蛋白，和用于调节对包膜蛋白的免疫应答的现代佐剂。该截短的E蛋白作为重组产生的蛋白质可从昆虫细胞中分泌出来。该疫苗还可以含有其他类似产生的截短的黄病毒E蛋白。
附图简述

图1显示了用DEN-1、-2、-3和-4prM80％E表达构建物转染的S2细胞的粗培养液的SDS-PAGE分析。
图2代表转染的S2细胞在生物反应器中的典型生长曲线，以及DEN-2 80％E表达的蛋白质印迹分析。
图3显示了登革热免疫亲和柱各组分的银染色SDS-PAGE分析。
图4显示了成年小鼠对给予以IscoMatrix和弗氏佐剂配制的纯80％E的剂量应答。
图5显示了用IscoMAtrix配制的DEN-2 80％E蛋白免疫的小鼠的存活情况。
图6证明了用几种佐剂配制的DEN-280％E免疫的小鼠免疫力持续的时间。
图7A-D比较了含有DEN-2 80％E蛋白的样品冻干前和冻干后没有丧失产品，没有丧失免疫反应性。
图8A-C比较了不含赋形剂和含有蔗糖或海藻糖赋形剂的冻干DEN-2 80％E的稳定性。
实施本发明的模式本发明首次提供了具有增强免疫原性的黄病毒亚单位疫苗，它可用重组表达系统有效产生和分泌，而且在诱导对黄病毒的强病毒中和应答中有效。虽然已进行了许多尝试以获得这种亚单位疫苗，但先前的研究未能达到符合商品化疫苗产品所要求的抗原表达的质和量的水平。本申请人发现-基因工程重组改造的羧基端截短的黄病毒包膜糖蛋白(对应于氨基酸1-395)可被某些常规真核重组宿主有效分泌，其形式允许加工来模拟该蛋白质的天然构型。另外，该分泌形式能(尤其当在某些现代佐剂存在时施用时)在动物中产生高滴度的病毒中和抗体，保护这些动物抵抗活病毒的攻击。因此，这些蛋白质代表了有用的疫苗组分，可保护个体抵抗黄病毒感染。
本文所用的“80％E”指跨越DEN-2包膜蛋白的Met 1-Gly395的多肽。本申请中所述的序列代表登革热2型病毒的包膜蛋白；已知还有3种不同登革热的血清型。因此，“80％E”还指这些血清型包膜蛋白的对应肽区域，以及任何天然存在的变体。“80％E”还指其他黄病毒(包括但不限于日本脑炎、黄热病、蜱媒脑炎和丙型肝炎病毒)的包膜蛋白相应的肽区域。所有80％E蛋白是由含有编码黄病毒prM(作为与80％E的融合蛋白)的DNA的载体所产生的。通过细胞酶加工该融合蛋白质以释放成熟的80％E蛋白质。
重组技术提供了大规模生产这些亚单位用于疫苗的最实际的方法。然而，为了有效，这些蛋白质必须经过正确的加工，采取与天然登革热包膜蛋白相似的构型。为了实现这个目的，重组生产必须在真核细胞(优选果蝇细胞)中进行，因为必须实现有效产生正确加工和正确折叠的产物，以实现具有成本-效益的实用疫苗。
如前所述，己发现具有生物活性的、截短的成熟黄病毒包膜蛋白的有效分泌可用果蝇Schneider-2细胞最好的实现。该产物的表达是由有效的昆虫细胞启动子(果蝇金属硫蛋白启动子)驱动的，用真核细胞分泌前导肽(人组织纤溶酶原激活物分泌前导肽)和含有E的分泌信号的黄病毒prM蛋白靶向分泌。还可采用其他启动子和分泌前导肽。一般本发明包括能在真核细胞中操作的表达系统，它导致截短的黄病毒包膜蛋白质有效分泌到培养基中。因此，本发明所用的是含有能导致产生和分泌截短的成熟黄病毒包膜蛋白的表达系统的细胞和细胞培养物。
从细胞培养液中回收正确加工的截短的E蛋白，纯化并配制成疫苗。纯化使用标准技术，这是常规的优化工作。必须凭经验确定合适的制剂(包括佐剂)。
本发明的活性疫苗可单独使用，或与其他活性疫苗联用，如含有减毒病毒或死病毒形式的疫苗，或含有其他可得到的活性亚单位疫苗。该疫苗可以仅含一个亚单位作为活性成分，或可加入其他分离的活性成分。可在一具体制剂中包含一个或几个血清型的相应或不同的亚单位。
为了免疫个体抵抗登革热，例如将含有亚单位的疫苗用常规免疫方案施给个体，这些方案通常涉及疫苗的多次施用。施用疫苗通常通过注射，通常肌肉内或皮下注射；然而，还可使用其他全身性施药模式。虽然技术还未完全开发，在本发明的范围内包括透粘膜和透皮制剂作为口服给药的有效方法。
在下列实施例中，说明了分泌的黄病毒糖蛋白的表达、分泌、加工和免疫原性。作为修饰的prM-80％E融合蛋白重组产生的产物须经宿主细胞蛋白酶有效加工，以除去prM部分并从果蝇细胞中分泌出来。分泌的80％E产物以高水平(达50微克/毫升)分泌。另外，根据与构型敏感性单克隆抗体的反应性，分泌的80％E产物具有类似天然的构型，并且用80％E免疫接种小鼠和/或非人类灵长类诱导强病毒中和性免疫应答。
下列实施例是为了说明但不是为了限制。
实施例1登革热病毒RNA的分离将登革热病毒型1、3或4感染的细胞小团在C6/36细胞中盲目传代。收集全部培养物、细胞和培养液，在Vero细胞上滴定。以0.1pfu/细胞感染C6/36细胞的单层培养物，在感染后4、5和6日分别收集细胞和培养液。150,000xg离心3小时从澄清培养液中沉淀病毒。以酸性硫氰酸胍裂解病毒感染的细胞和沉淀的病毒，用苯酚-氯仿和氯仿抽提，然后用乙醇沉淀纯化得到RNA。还根据该方法制备了DEN-1株258848、DEN-3株CH53489和DEN-4株H241的病毒RNA。
实施例2登革热2prM80％E(包膜)cDNA表达克隆的制备这是根据制备方法A的方法，用2’-O-苯甲酰基-6-O-烯丙基-11-氨基-3-去克拉定糖基-11-脱氧-3-氧-2-氟-15甲基红霉素A 11，12-环氨基甲酸酯代替2’-O-苯甲酰基-6-O-烯丙基-11-氨基-3-去克拉定糖基-11-脱氧-3-氧-15-甲基红霉素A11，12-环氨基甲酸酯制备的。
用衍生自血清型登革热2(DEN-2)的病毒株PR159/S1的cDNA克隆(Eckels等，1980，Infect.Immun.27175-180)作为产生所有DEN-2表达质粒的起始材料。用cDNA克隆pC8(Hahn等，1988，Virology 162167-180)作为模板扩增编码包膜蛋白(80％E)氨基末端80％的基因组部分。用聚合酶链式反应(PCR)，引物D2E937p和D2E2121m实现了该扩增。在引物名称中，首先标出病毒血清型(D2代表DEN-2)，然后是相应的登革热基因(即在次指出了包膜，E)。数字表示引物在克隆序列中采用Hahn等(1988)的编号的位置，最后的字母表示该寡核苷酸引物引导正(p)链或负(m)链合成。用上方的字母写出了引物中对应于登革热cDNA的序列，用下方的数字写出了非登革热的序列。D2E937p2 ATG CGC TGC ATA GGA ATA TC-3′(SEQ ID NO1)D2E2121m TTT CTT GAA CCA G-3′(SEQ ID NO2)D2E2121m引物位于E的第395个密码子后的两个终止子。在该克隆衔接子中的XbaI位点消化80％E扩增的cDNA片段，并克隆入pBR322的NheI位点获得9D280E。用链式终止测序法确定了克隆的80％E的核苷酸序列。该分析鉴定到在核苷酸2001处有一个PCR诱导的沉默突变(AAC/Asn到AAT/Asn)。
用基本如上所述亚克隆80％E的PCR扩增，构建了所设计的编码前膜，膜和包膜基因(prM100％E)的DEN-2 PR159/S1的cDNA克隆。该cDNA克隆包括DEN-2基因组的核苷酸439-2421(Hahn等的编号，pC8)。用合成寡核苷酸引物D2pM439p和D2E2421m，和质粒pC8(Hahn等，1988)作为模板产生了登革热cDNA片段。除了DEN-2特异性序列外，该引物紧靠前膜序列的第一个密码子(苯丙氨酸)前含有上述相同衔接子序列(除了甲硫氨酸密码子(ATG))。引物是D2prM439p TTT CAT CTG ACC ACA CGC-3′(SEQ ID NO3)D2E2421m CTG CAC CAT AAC TCC-3′(SEQ ID NO4)用限制性内切酶XbaI消化PCR-产生的prM100％E cDNA片段，并连接入pBluescript SK+的XbaI位点(Stratagene，San Diego，CA)以获得质粒p29prME13。PCR产生的cDNA克隆的DNA序列分析鉴定到三个位于pc8和p29prMe13之间的PCT导入的核苷酸差异。核苷酸1255处T→C的转变导致沉默突变。核苷酸1117处A→G转变导致缬氨酸保守性氨基酸取代了异亮氨酸。最后在核苷酸1750处的转变用缬氨酸代替了甲硫氨酸。
为了产生代表prM80％E的cDNA亚克隆，从编码包膜羧基末端的p29prME13除去了794bpBamHI-SalI片段。用p29D280E(编码截短的包膜糖蛋白80％E的羧基端)的431碱基对Bam HI-Sal I片段替换该片段。该BamHI位点是包膜cDNA内天然存在的位点，而SalI位点是紧靠PCR引物编码的终止密码子之后的基因工程改造的位点。用限制消化和DNA序列分析确证得到的截短的cDNA克隆p48BSprM80E，以编码整条prM蛋白质和该包膜糖蛋白的氨基酸1-395。该cDNA保持了核苷酸1117处的转变(异亮氨酸→缬氨酸的改变)，保持了核苷酸1255和2001处的沉默突变，但修复了核苷酸1750处的改变。
构建的用于从果蝇S2细胞分泌DEN2 80％E的表达载体其基础是pMttbns载体(Culp等，1991)。载体pMttbns基于pBR322，含有果蝇金属硫蛋白基因启动子(Pmtn)，人组织纤溶酶原激活物前导序列(tPAL)，和SV40早聚腺苷酸信号(Culp等，1991)。除去pMttbns的含有Xho I位点的15bpBam HI DNA片段，产生pMttΔXho，其中Bgl II和Xho I限制性内切核酸酶位点是唯一的。通过序列分析证实了该改变。通过限制性消化质粒p48BSprM80E并连接入用Bgl II和Xho I消化的pMttΔXho中，获得了编码全长的DEN2prM和包膜的氨基酸1-395的Bgl II-Sal I片段。该构建导致prM80％E片段与tPAL序列融合。在组织纤溶酶原激活物正常成熟中，内质网中的信号酶除去了该前导序列的20个氨基酸的前肽区域，在高尔基体中酶反应除去了11个氨基酸的原肽区域。通过限制性消化和有限的序列分析证实了得到的质粒pMttD2prM80％E。下文显示了tPAL-prM80E融合基因的核苷酸序列和设计的氨基酸序列(分别是SEQ ID NO5和SEQ ID NO；6)。
前原-tPA接头序列分别用前-tPA和原-tPA标出了tPA前肽和原肽区域，用黑体表示登革热序列。Phe1残基是prM蛋白质的N-末端氨基酸，Gly395是该包膜糖蛋白氨基末端的残基395。接头序列包括引入异源基因序列的限制性位点。
鉴于核苷酸1117的突变(缬氨酸代替包膜氨基酸61的异亮氨酸)可能有不良作用，在pMttD2prM80％E表达克隆中纠正了该突变。我们鉴定到包含突变1117的独特的限制性内切核酸酶片段，使我们能够在一个简单步骤中用pC8的相应片段替换pMttD2prM80％E中的该片段。因此，从pMttD2prM80E除去783bp的AflII片段(核苷酸1101-1783)，在其位置上连接pC8的相应的AflII片段。得到的质粒pMttD2prM80E(Ile61).4在2001位具有一个沉默突变，并产生与野生型病毒E蛋白质序列等价的80％E多肽。附录1中列出了该表达质粒的特征和序列。由于分析中使用的软件将文件名限于8个字母，所以附录I中列出的质粒名为MttprM80。
实施例3从DEN-1(病毒株2548848)、DEN-3(病毒株CH53489)和DEN-4(病毒株H241)克隆prM80％E在果蝇Schneider2细胞中克隆并表达了与DEN-2 prm80％E构建物类似的DEN-1、-3和-4prM80％E cDNA构建物。用于制备prM80％E cDNA的克隆策略采用了反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)法。简单说，如实施例1所述制备了感染的C6/36蚊子细胞沉淀的总RNA。RT-PCR反应采用登革热特异性的合成性寡核苷酸引物来扩增所需片段。对于DEN-1产生的cDNA片段含有基因组图(DEN-1病毒株的共有序列图)上的核苷酸422-2102；对于DEN-3，为基因组图(根据参考病毒株D3H87)上的核苷酸437-2113；和对于DEN-4，所选片段包含基因组图(病毒株H241)上的核苷酸441-2120。用限制性内切核酸酶BglII和XhoI(在寡核苷酸引物中所含的位点)消化DEN-1和-4的PCR产物，直接克隆入用BglII和XhoI消化的果蝇表达质粒pMttΔXho(见实施例2)。用gglII和SalI消化DEN-3的PCR产物，直接克隆入用BglII和XhoI消化的果蝇表达质粒pMttΔXho中。选择三个血清型登革热各自的克隆进行DNA序列分析。
衍生自病毒株258848的DEN-1 prM80％E(克隆#2)分子克隆的序列分析表明，它具有一个PCR-引起的错误，导致一个氨基酸取代。然后对其他己冷冻保存但最初未测序的克隆测序。发现克隆#7具有无PCR错误的相应的限制性片段(BglII-XbaI)，随后用于替换克隆#2中的片段来纠正该错误。用序列分析验证了所得克隆pMttDlprM80Ef.6的DNA序列，在所有随后的表达工作中均采用该克隆。
从病毒株CH53489衍生的DEN-3 prM80％E分子克隆的序列分析证明一个克隆pMttD3prM80E.11含有天然的DEN-3序列。在所有随后的表达工作中均采用该克隆。
衍生自病毒株H241的DEN-4 prM80％E的两个所选的分子克隆的序列分析表明各自含有一个PCR诱导的错误，它导致一个氨基酸取代。选择克隆#2用于修复，因为它在果蝇Schneider细胞中显示有最高表达水平。对冷冻保存但最初未测序的其他4个克隆，随后进行测序。发现克隆#4拥有无PCR错误的相应的限制性片段，将其用于替换克隆#2中的片段来纠正该错误。用DNA序列分析验证了所得克隆pMttD4prM80Ef.3的序列。
将pMttD4prM80Ef.3序列与各种出版的序列广泛比较，表明在E氨基酸153处预测的糖基化位点周围存在序列异源性。虽然DEN-4 H241序列的初始报道提出，该糖基化位点是完整的(Kawano等，1993)，但后来的报道(出版的(Lanciotti等，1997)和未出版的)提出在某些病毒株中，包括某些H241分离物中，未保留该糖基化位点，因为氨基酸从苏氨酸改变成异亮氨酸。我们的克隆在该位置编码异亮氨酸，从而不含该糖基化位点。由于缺乏该糖基化可能对产物的表达或免疫原性造成不良影响，我们进行了定点诱变，将E的氨基酸155位的异亮氨酸改变为苏氨酸。用寡核苷酸定向诱变的标准技术，我们将密码子从ATA突变为ACA，来编码苏氨酸。通过序列分析证实了得到的克隆pMttprM80Ef.3+6.13，将其用于所有随后的表达研究。
实施例4构建JEV prM80％E的cDNA表达克隆在果蝇S2细胞中构建并表达了与上述登革热病毒类似的JEV构建物。从含有JEV病毒株JaOArS9821-5576位核苷酸(Sumiyoshi等，1992)的cDNA克隆1079.14PCR扩增了编码JEV的prM和80％E蛋白产物的序列。设计了寡核苷酸引物JEpM477p和JEE2177m来扩增对应于JEV编码prM和80％E的核苷酸477-2177的片段。5’末端引物含有BglII位点，而3’末端引物含有XhoI位点以方便克隆。用这些酶消化PCR产物，并直接克隆入事先用相同限制性内切核酸酶消化的pMttΔXho载体中。通过限制性消化和有限的序列分析确认了所得表达克隆的身份。
实施例5
用表达质粒传染果蝇细胞果蝇表达系统是以S2细胞与含有感兴趣的基因和选择质粒的表达质粒的共转染为基础的。将这些质粒以高拷贝数共整合入基因组中，并选择含有整合的表达构建物的细胞所偏爱的质粒。在产生我们的细胞系中使用的选择质粒pCoHygro(Van der Straten等，1987；Van der Straten等，1989)携带有在果蝇可转座元件长末端重复序列的转录控制下的大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因，从而可赋予对潮霉素B的抗性。
在转染前一天，将S2细胞以1×106细胞/毫升接种于含有10％热灭活的胎牛血清(FBS；Hyclone)的4毫升Schneiders培养基(Gibco-BRL)中，该培养液置于60毫升组织培养皿中。用磷酸钙共沉淀法转染细胞(Wigler等，1977)。简单说，将20微克表达质粒(如pMttD2prM80E(Ile61).4)和1微克选择质粒pCoHygro与钙溶液混合。将该混合物缓慢加到等体积的含有磷酸盐的HEPES缓冲盐中，得到细磷酸钙-DNA沉淀。将沉淀置于S2细胞上，培养过夜。约16小时后，换培养液2次洗涤转染细胞，重新接种在含有10％FBS的5毫升新鲜Schneiders培养液中。3日后，加入最终浓度为300微克/毫升的潮霉素B(Boehringer MannheimBiochemicals)。转染后，将细胞维持在含有300微克/毫升潮霉素B的选择性培养基中。所有细胞维持在26℃的湿室中。将细胞以2×106细胞/毫升接种于无血清的培养液(Excell400，JRH Biosciences)中，加入最终浓度0.2mM的硫酸铜诱导启动子评价重组产物的表达。诱导后第7日收集细胞和培养上清液，用SDS-PAGE和Western印迹法评估。
实施例6分泌的黄病毒80％E产物的特征分析SDS-PAGE和Western印迹法对胞内和分泌的蛋白质的分析揭示，有效产生了重组的80％E产物(DEN-1、-2、-3、-4和JEV)，并分泌入培养液中。考马斯蓝染色未浓缩的培养液可见～48干道尔顿(kD)的条带，该条带可被血清型特异性多克隆抗血清(超免疫的小鼠腹水-HMAF)识别。比较胞内和分泌的蛋白质证明，这些产物是有效分泌的。时间过程揭示，80％E蛋白质随时间聚集于培养液中。如图1所示，在诱导后第7日，未克隆细胞群中分泌水平根据考马斯染色凝胶估计是5-20毫克/升。
特别是，图1显示了用DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4 80％E转染的S2细胞粗培养液的SDS-PAGE分析。将10微升粗培养液加到非还原性12％SDS-PAGE凝胶上，用考马斯蓝染色。箭头表示80％E条带的位置。注意在这些条件下DEN-2 80％E比DEN-1、-3和-4 80％E条带迁移得稍慢一些。
在内切糖苷酶处理后，用SDS-PAGE中蛋白质分子量漂移和Western免疫印迹评估了分泌的80％E对内切糖苷酶的敏感性。分泌的80％E对内切糖苷酶Hf(EndoHf；New England Biolabs)消化的抗性和对肽N-糖苷酶F(PNGase F；New EnglandBiolabs)消化的敏感表明了该分泌的产物具有N-连接的糖基化，并提示了甘露糖-3型糖基化，这是昆虫细胞表达系统的特征(数据未显示)。
免疫荧光研究证明，未克隆群中5-25％的细胞是抗原阳性的，这些抗原阳性细胞可被许多构型敏感性和不敏感性抗黄病毒MAb所识别。该组MAb包括各种表位特异性，包括那些登革热型特异性、登革热复合物和亚复合物特异性和黄病毒组特异性的MAb。表1总结了所选MAb的80％E结合活性谱。MAb与S2细胞表达的DEN-2 prM80％E的反应性与预期的模式一致。显示各已知与DEN-2E蛋白质(4G2、5A2和9D12；Henchal等，1982；Megret等，1992)结合的MAb能与该亚单位抗原结合。如预期的，用S2 DEN-2 prM80％E细胞作IFA试验，MAb 2H2(对登革热prM/M蛋白质特异的)是阳性的，因为prM80％E构建物也表达M蛋白。IFA显示对登革热NS1蛋白质特异性的MAb 7E11不起反应，这与prM80％E构建物中不存在NS1序列相一致。

*渗透的(prM)80％E转化的果蝇细胞的间接免疫荧光分析。染色强度的主要指标-＝阴性；+＝阳性；+++＝强阳性。
实施例7用可除去的饲养层有限稀释法克隆转染的S2细胞免疫荧光研究证明，5-25％细胞对于黄病毒80％E抗原表达是阳性的(实施例6)，因此如果能将抗原阳性细胞从该混合群中克隆出来，那么表达水平可能提高。开发克隆细胞的方法，目的是实现克隆性纯化的、高水平表达的细胞系。因为S2细胞对低细胞密度非常敏感，明显需要优化。
用可除去的饲养层实现了细胞亚克隆，使细胞能在亚克隆过程中存活。将细胞以特定的细胞密度接种于含有10％FBS和150微克/毫升潮霉素B的完全IPL-41培养基中。我们发现细胞在亚克隆中存活需要血清，潮霉素B的浓度必须降低到150微克/毫升，以避免潮霉素B晶体在96孔培养皿中沉淀。以30个细胞/毫升在96孔培养皿中进行第一轮亚克隆。支撑可除去饲养层的插入物是0.2微米Anopore膜组织培养插入物(Nunc)。将由同源细胞构成的饲养层以1000细胞/插入物接种。一旦细胞达到汇合，除去饲养层，一般在1-2周之内。一旦达到了显著的亚克隆生长，首先让它们在96孔中，然后在6孔，最后在60毫升组织培养皿中的无血清的培养液中扩增。最初通过在各96孔培养皿中诱导亚克隆和斑点印迹分析评估表达情况。然后扩增最佳的表达物，并边培养边诱导用上述的SDS-PAGE和Western印迹分析(实施例6)进行评估。如上所述主要进行第二轮和第三轮亚克隆，除了将细胞以1细胞/孔，而不是30细胞/孔接种外，插入物中的细胞数增加到10,000。
用该方法我们产生了克隆纯化的DEN-2 80％E细胞系，它以25-35毫克/升表达80％E。表达DEN-1、DEN-3和DEN-4 80％E的细胞通过了第一轮亚克隆，达到了20-50毫克/升的表达水平。
实施例8转化的果蝇S2细胞系的大规模培养大规模培养转化的果蝇S2细胞的尝试采用了具有5升容器的New BrunswickScientific(NBS)Bioflo3000生物反应器。该仪器是一种采用船用桨叶轮的搅拌罐系统。这些方法的开发中一个重要的考虑是所用培养液的成本。在静态培养中，我们采用Schneider(Gibco-BRL)和Excell 400(JRH Biosciences)培养液培养果蝇细胞。当完全补充时，这些培养液是较贵的。因此，我们找到了一种较便宜的合适培养液。根据Olsen等(1992)的报道，IPL-41培养液(Gibco-BRL)能支持果蝇细胞的剧烈生长，成本是每升～$10。在大量运转的基础上，我们开发出了能促使有效生产运行的条件。该条件总结如下标准化的生物反应器条件·培养基IPL-41(粉末状；Gibco-BRL)·去离子水·培养基添加物(列出了培养基中的最终浓度)◇Yeastolate，3.33克/升(Gibco-BRL)◇脂类浓缩物，1％(v/v)(Gibcol-BRL)◇Pluronic多醇F-68，0.1％(w/v)(Gibco-BRL)·溶解氧维持在50％空气饱和度·气体喷射速度0.133升气体/升培养基/分，用环形分布器·搅拌速度用两个船用浆叶80rpm。
·pH6.4，用酸-碱进料维持·Schneider细胞接种密度1×106细胞/毫升·用0.2mM CuSO4诱导时的细胞密度2-3×106细胞/毫升·收集时的细胞密度≥1×107细胞/毫升图2显示了在典型生物反应器运转过程中80％E分泌入培养液的时间过程的生长曲线和相应的Western印迹。
在该图中，图2a显示了在生物反应器中培养的S2 DEN-2prM80％E细胞的生长曲线，图2b显示了在指定时间点从同一培养物中取得的分泌的DEN-2 80％E的Western印迹分析。在7日诱导后从组织培养皿(“TC培养皿”)收集了培养液。
实施例9黄病毒抗原的免疫亲和纯化在S2细胞中各种黄病毒重组80％E亚单位均有显著表达，以及在小鼠中测试纯化的抗原的需要必须开发迅速的纯化方法。最初，我们采用免疫亲和层析(IAC)来纯化用于在小鼠中测试的抗原。
免疫亲和层析依靠抗体和抗原之间的选择性、高亲和性识别和可逆的相互作用。对于黄病毒抗原纯化，选择了两种构型敏感性单克隆抗体(MAb)9D12(DEN-1、-2、-3)和4G2(DEN-4，JEV)。通过在柱上加载抗体(其缓冲液已换成0.1M NaHCO3、0.5M NaCl(pH8.3)缓冲液，并在室温下温育3小时)使这些抗体与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的Sepharose柱偶联。从柱上洗下未偶联的抗体，用0.5M乙醇胺灌注柱，灭活任何剩余的NHS位点。
在层析制备中，在无细胞培养液中加入最终浓度0.05％(w/v)的叠氮化钠(用10％储液)，通过0.2微米滤膜(SerumAcrodisc?，Gelman Sciences)过滤。将体积基本对应于1毫克80％E的培养液加到预先用含有0.05％叠氮化钠的磷酸缓冲液(PBS140mM NaCl，3mM NaH2PO4和8mM Na2HPO4，pH7.2)平衡的IAC柱上。用PBS(含有0.05％叠氮化钠)洗涤，从柱上洗去未结合的物质，直到洗液光密度(在280纳米处测量)达到基线。用100mM甘氨酸pH2.5和在线监测280纳米处的光密度，以确保准确收集蛋白质峰，进行了80％E的洗脱。加样和PBS洗涤步骤的流速约为0.6毫升/分钟，但低pH洗脱以1.5-2毫升/分钟进行。立即用大约1/10体积的1M TrispH8中和酸-洗脱的物质，然后用Centricon-30(Amicon)将缓冲液换成PBS，0.2微米膜无菌过滤(Acrodisc13?，Gelman Sciences)。
未纯化起始培养基、流穿和洗脱的含抗原组分的SDS-PAGE分析表明通常产物的产率大约是80％，在流穿组分中有5％的起始80％E损失。最终产品的纯度一般约80-90％。图3显示了典型的纯化过程的SDS-PAGE分析。特别是，该图显示了黄病毒免疫亲和层析柱各组分的银染色SDS-PAGE凝胶情况。用SDS-加样缓冲液(不含还原剂)1∶1稀释各组分的一部分，加到12％聚丙烯酰胺凝胶凝胶上。银染色可见被分辨的蛋白质。箭头表明登革热80％E的位置。抗体对照泳道含有5％抗体作为标准。
实施例10采用羟基磷灰石/大小排阻高效液相层析(HTP-SEC)的纯化将含有重组DEN 80％E抗原(血清型1-4)的果蝇Schneider2细胞培养物以羟基磷灰石(HTP；BioRad)柱缓冲液(10mM磷酸钠，pH6.45)渗液，采用装有30kDa分子量截留膜的切面流装置。然后将缓冲液己交换的培养液加到HTP柱上，用分步梯度50、100、150、200和400mM的磷酸钠缓冲液(pH6.45)洗脱。用紫外光谱(280纳米处的吸光度)监测产物洗脱，用SDS-PAGE分析鉴定含有80％E的组分。超滤浓缩含有80％E的组分，进一步用TSK G3000SWXL柱(TosoHaas)和20mM磷酸钠(pH6.45，含有100mM NaCl)的流动相以HPLC-SEC纯化。用紫外光谱A280监测产物洗脱。可将四种血清型DEN 80％E抗原各自纯化到95％以上的均一性，该方法产率60％以上。
实施例11在小鼠中评价采用几种不同佐剂的DEN-2 80％E的免疫原性用各种现代和传统佐剂中配制的DEN-2 80％E免疫成年小鼠。免疫时间视佐剂制造者的推荐而不同，表2包括了细节。免疫过程完成后对动物取血，血清分析抗体应答。用DEN-2 80％E作为包被抗原，以间接ELISA试验检测了能与80％E结合的抗体。用蚀斑减少中和试验(PRNT)测试了中和抗体，与对照相比，导致蚀斑数量至少减少80％的最高血清稀释度报告为PRNT80滴度。表2总结了结果。简单说，几种佐剂(包括MF75、RIBI和IscoMatrix)诱导了强的病毒中和抗体应答。另一方面，MF59、弗氏佐剂和铝盐诱导了高滴度的80％E结合抗体，但低滴度的中和应答。这与这些佐剂已显示和其他各种免疫原合作良好的事实不同。这证明确定佐剂亚单位疫苗制剂效力需要经验，即制剂是否有效并不能根据文献报道来预计，而必须用实验证明。
表2成年小鼠中佐剂对DEN-2 80％E免疫原性的影响佐剂 免疫原/接种时间表 ELISA滴度PRNT80滴度2.5微克DEN-2 80％E，第0日MF59佐剂 25,600 2612.5微克DEN-2 80％E，第21日12.5微克DEN-2 80％E，第42日皮下接种2.5微克DEN-2 80％E，第0日MF75佐剂 102,000 229812.5微克DEN-2 80％E，第21日12.5微克DEN-2 80％E，第42日皮下接种25微克DEN-2 80％E，第0日RIBI佐剂 25,600 33312.5微克DEN-2 80％E，第21日12.5微克DEN-2 80％E，第42日皮下接种25微克DEN-2 80％E，第0日Alum 8445 2412.5微克DEN-2 80％E，第21日12.5微克DEN-2 80％E，第42日(氢氧化铝)皮下接种弗氏完全佐剂 25微克DEN-2 80％E，第0日36,204 ＜10弗氏不完全佐剂 12.5微克DEN-2 80％E，第21日弗氏不完全佐剂 12.5微克DEN-2 80％E，第42日腹膜内接种10微克DEN-2 80％E，第0日IscoMatrixTM25,600400010微克DEN-2 80％E，第28日皮下接种佐剂25微克DEN-2 80％E，第0日无佐剂 8445 1112.5微克DEN-2 80％E，第21日12.5微克DEN-2 80％E，第42日皮下接种仪PBS，第0日PBS＜100 ＜10仪PBS，第21日仪PBS，第42日皮下接种实施例12对IscoMatrix和弗氏佐剂配制的DEN-2 80％E的剂量应答为了证明对重组80％E产物免疫应答的剂量依赖性，用各种剂量的DEN-2 80％E和弗氏佐剂或IscoMatrix免疫成年小鼠。用弗氏佐剂免疫的小鼠间隔两周接受了三次剂量，两次加强剂量是最初剂量的一半，以弗氏不完全佐剂配制施用。用IscoMatrix配制的该重组产物接种的小鼠，间隔28日接受以10微克IscoMatrix配制的两次等价剂量接种。在图4中显示了获得的中和抗体滴度。特别是，该图显示了用DEN-2 80％E和IscoMatrix或弗氏佐剂免疫的小鼠的剂量应答。用各种剂量的DEN-2 80％E和IscoMatrix或弗氏佐剂免疫后测定了中和抗体滴度。将几何平均PRNT80滴度对两种佐剂疫苗的抗原剂量作图。对两种佐剂疫苗的剂量应答都冥想，然而对弗氏佐剂疫苗的应答在大约3微克蛋白质时看来达到了平台。显然，病毒中和抗体应答则是IscoMatrix佐剂疫苗强得多。
实施例13用IscoMatrix配制的所有4种血清型的登革热纯化的80％E接种小鼠的免疫应答用经羟基磷灰石/大小排阻层析(HTP/SEC)或免疫亲和层析纯化的DEN-1-DEN-4 80％E抗原免疫成年雌性BALB/c小鼠。用10微克纯化的80％E抗原和10微克IscoMatrixTM佐剂以100微升PBS配制皮下接种小鼠(每实验组5只小鼠)。间隔28日给予两次注射，第二次免疫10日后收集血清。系列稀释用DEN-2 80％E免疫的小鼠血清，用纯化DEN-2 80％E包被的微量滴定板作ELISA分析。以捕获ELISA测试用DEN-1、-3和-4 80％E免疫的小鼠血清，其中用家兔-抗-登革热病毒抗体包被板来捕获同源重组DEN-80％E抗原。还用蚀斑减少中和法测试了血清中针对同源病毒的中和抗体的存在。表3总结了几何平均ELISA滴度和血清中和抗体应答反应(80％蚀斑减少)。

实施例14采用IscoMatrix的纯化DEN-1-DEN-480％E抗原接种成年小鼠的剂量应答关系用增量的免疫亲和纯化的DEN 80％E抗原和10微克IscoMatrixTM(IscotecAB，Sweden)佐剂免疫接种成年雌性BALB/c小鼠。小鼠皮下接种两次，间隔28天。第二次免疫后10天采集血清，用ELISA(以DEN-2 80％E直接包被在板上)或用MAb 4G2抗原捕获ELISA(DEN-1-DEN-3)法评价抗体滴度，并用蚀斑减少中和试验评价对同源病毒的病毒中和抗体滴度(表4)。采用DEN-1、DEN-2和DEN-4的80％E可见清晰的剂量应答反应。采用DEN-3的80％E于大约1微克剂量时达到了平台，而1微克以上剂量未见滴度明显增加。


NT-未测试*yi PRNT50滴度报告DEN-4 PRNT滴度，虽然其他报告为PRNT80滴度。
这反映了方法中一个变化，以适应登革热领域其他人所用的标准。实际滴度包括与PRNT80法相比2倍稀释，因此可比较用我们的PRNT80和新的PRNT50法获得的数据。
实施例15用DEN-2 80％E和IscoMatrix免疫的哺乳期小鼠对病毒攻击的保护将皮下诱导剂量的含DEN-2 80％E和IscoMatrixTM佐剂的PBS溶液施给哺乳期小鼠。2周后进行增强接种，一周后进行颅内DEN-2病毒攻击(100LD50剂量)。攻击后监测小鼠21日，看是否有发病和死亡症状的变化。该实验包括以下实验分组1.DEN-2 80％E(5微克/剂量)+2微克IscoMatrixTM佐剂2.DEN-2 80％E(5微克/剂量)+1微克IscoMatrixTM佐剂3.DEN-2 80％E(5微克/剂量)+0.5微克IscoMatrixTM佐剂4.DEN-2 80％E(5微克/剂量)的盐水溶液5.阳性对照，活DEN-2病毒(S16803)的5×105颗粒形成单位6.阴性对照，PBS图5描述了该攻击研究的结果，显示用活登革热-2病毒攻击后免疫的小鼠的存活。以不同剂量的IscoMatrixTM佐剂、盐水(阴性对照)配制的DEN-2 80％E，或活DEN-2病毒(阳性对照)免疫接种后，颅内用100LD50剂量的DEN-2病毒(NewGuinea C)攻击小鼠。第0日是病毒攻击日。接种以2微克IscoMatrixTM配的DEN-280％E和皮下活DEN-2病毒的阳性对照获得了完全保护抵御了神经嗜性病毒攻击，没有致病的迹象。减少佐剂量导致保护下降。
实施例16用JEV 80％E和IscoMatrix免疫对哺乳期小鼠的部分保护用8微克JEV 80％E和2微克IscoMatrix佐剂皮下免疫三周龄的ICR或Balb/c小鼠。一些动物在21日后用相同剂量加强。加强免疫7日后，颅内注射100LD50(50,000pfu)毒性JEV病毒攻击动物。表5总结了结果。用ELISA监测病毒结合反应，记录为1∶400血清稀释度时获得的光密度。病毒中和应答记录为PRNT75滴度。虽然PRNT滴度比用登革热抗原获得的低，但这代表了免疫系统尚未成熟的乳鼠的非最佳免疫方案。即使这样，这种数量级的滴度也是其他有效JEV疫苗典型的。类似的，虽然不是完全保护，至少对于ICR小鼠，两剂量方案与对照动物相比较显示抵御病毒攻击的保护力有显著增强。

实施例17免疫接种各种佐剂配制的用DEN-2 80％E所诱导的免疫力的持续时间按下列时间表给成年雌性BALB/c小鼠接种DEN-2 80％E(a)RIBI第0日，25微克80％E和0.2毫升RIBI MPL+TDM(0.1毫升皮下，肩部；0.1毫升皮下，后腿)；第21日，如上用12.5微克80％E；第42日，如第21日；6个月，加强免疫，如第21日和42日。(b)IscoMatrixTM第0日，10微克80％E+10微克IscoMatrixTM，0.1毫升皮下，肩部；第28日，如第0日；6个月后，如第0日。(c)MF-75第0日，1∶1稀释的抗原与佐剂混合。与RIBI时间表相同，除了皮下而非肩部注射0.1毫升体积外。(d)MF-75+ThrMDP同MF-75，每剂用40微克ThrMDP。在上述初次接种/加强方案后，每隔1月取测试血样，共6个月。在6个月时，如上所述给予末次加强接种，10日后采取末次测试血样。用蚀斑减少中和试验测试所有测试血样，测定了PRNT80滴度。图6总结了结果，显示给予上述列出的各种佐剂疫苗后对DEN-2 80％E免疫力的持续时间。
实施例18用所有4种血清型登革热的80％E免疫小鼠所诱导的四价应答测定了成年雌性BALB/c小鼠对免疫亲和纯化的DEN-1、-2、-3和-4 80％E抗原或等重量的DEN-1-DEN-4的80％E组合抗原的病毒中和抗体应答。用10微克或2.5微克DEN-1、-2、-3或-4 80％E(每组5只)或四种抗原各10微升联合(每组10只小鼠)皮下免疫小鼠。各0.1毫升剂量还含有10微克IscoMatrixTM佐剂和PBS稀释液。4周后给予加强免疫，10日后收集血清。表6显示了接受10微克剂量的各血清型80％E抗原或四价登革热疫苗和IscoMatrixTM的小鼠的中和抗体滴度总和。这些结果证明同源80％E抗原诱导了对各病毒的中和抗体应答，重要的是，当以四价制剂递呈抗原时，保持了这种应答。

NT-未测试实施例19用在IscoMatrixTM佐剂和DEN-2 80％E免疫恒河猴为了评价有效的DEN-2 80％E和IscoMatrix制剂，进行了恒河猴(Macanamulatta)的研究。该研究的终点是a)以体外病毒蚀斑减少试验测定血清病毒中和抗体的诱导，和b)活病毒攻击后登革热病毒血症的减轻。该实验使用了11只猴子。在研究第0日用指定的疫苗皮下免疫接种，和在研究第34和97日加强接种动物ID编号的恒河猴。IscoMatrix疫苗制剂含有50微克佐剂。在铝疫苗制剂中，于接种前用来自Reheis，Inc的氢氧化铝(Alum)佐剂0.1％吸附抗原1小时。WRAIR(实验室批号9，97年5月)的登革热-2纯化灭活疫苗(PIV)在接种前用1∶4的PBS稀释。在研究的第132日，用104pfu活登革热-2病毒(S16803亲本病毒株)攻击所有动物，攻击后12日进行病毒血症测定。表7显示了中和抗体分析的结果。所有制剂在三剂量方案后诱导了高滴度的中和抗体应答。在接受IscoMatrix和5微克DEN-2 80％E抗原的猴子中检测到了特别高的滴度应答。

在研究第132日，用104蚀斑形成单位的活登革热-2病毒(菌株S16803亲本)攻击所有动物。每日采集血样12日，将血清(0.1毫升)接种在C6/36细胞上。28℃培养接种的细胞14日，来扩增存在的任何病毒。在Vero细胞单层上用蚀斑试验检测0.2毫升C6/36细胞培养液中的病毒。然后，直接在Vero细胞单层上蚀斑滴定经C6/36扩增试验检测为病毒阳性的血清样品。表8显示了病毒血症研究的结果。用5微克DEN-2 80％E联合50微克IscoMatrixTM佐剂达到了病毒血症的完全抑制，证明在非人灵长动物中该疫苗的效力。

a)+＝约100或更多病毒蚀斑；？＝1-5个病毒蚀斑；0＝无病毒蚀斑实施例20DEN-2 80％E和IscoMatrix的冻干任何疫苗的稳定性对其成功的实施都是关键的，因此重组80％E产物的稳定性是其专利性的重要组成。因此，我们证明了纯化的80％E可以冻干形式储藏在室温下是稳定的。它在ELISA和小鼠测试中保持了全部免疫原性。
以10mM磷酸钠，pH7.0和5％(w/v)蔗糖、海藻糖或乳糖赋形剂溶液将纯化的DEN-2 80％E抗原配成0.525毫克/毫升分成等份(200微升)。在干冰-丙酮上冻结样品后，-34℃，在45mT的压力下19小时。然后将搁板温度在400分钟内提升到25℃，每30分钟递增5℃。25℃干燥样品19小时，真空密封。
用SDS-PAGE和ELISA比较冻干前后样品，证明冻干不会导致产品损失或免疫反应性改变。图7A-7D分别显示了DEN-1到DEN-4 80％E冻干后的ELISA活性。一式两份(即#1和#2)进行各血清型80％E的试验，起始浓度为0.5毫克/毫升(以10mM磷酸pH7.2)含有5％(w/v)乳糖的溶液配制。-35℃冻结样品。-33℃冻干样品过夜，25℃真空再次干燥。加入水将冻干的团块重建到起始条件，在夹心ELISA试验中与未冻干的相匹配样品进行比较。ELISA涉及以9D12 MAb包被和针对DEN-2B结构域(E138-2)的第二多克隆家兔血清作夹心试验分析。
2和5个月储藏后，溶解用海藻糖或蔗糖作为赋形剂冻干的DEN-2 80E样品。ELISA(9D12和E138-2夹心法)和SDS-PAGE分析表明相对于在冻干后立即重建的样品，显示无蛋白质降解或免疫反应性丧失。图8A-8C说明冻干的DEN-2 80％E的稳定性。冻干了以不含(8A)无赋形剂(8B)5％蔗糖，或(8C)5％海藻糖的10mM磷酸盐(pH7.2)配制的几种样品对室温储藏2-5月的重建到起始条件的样品进行了夹心ELISA(9D12 MAb为捕获抗体，E138-2抗结构域B家兔多克隆抗体为检测抗体)；“第0日”的检测数据相应于冻干的并在次日重建的样品。
用免疫亲和纯化的DEN-2 80％E(已从含有下列赋形剂蔗糖、海藻糖或乳糖(方法上文详述)的溶液中冻干)皮下免疫成年雌性BALB/c小鼠(n＝5每组)。冻干后一日，以PBS重建抗原样品，用于免疫小鼠，各0.1毫升剂量，含有10微克DEN-280％E和10微克IscoMatrixTM佐剂。首次免疫4周后，小鼠接受了冻干储藏在环境室温下一月后新鲜重建的DEN-2 80％E的加强注射。4℃贮存在PBC中的DEN-280％E作为阳性对照。加强接种每剂也含有10微克DEN-2 80％E和10微克IscoMatrixTM。在加强免疫后10日收集血清用于分析。虽然所有赋形剂均显示具有稳定80％E抗原的倾向，但仅在乳糖存在下冻干的DEN-2 80％E显示出与液态储藏的对照抗原相比中和抗体滴度，具有统计学显著的升高(0.025＜p＜0.05)。表9显示了ELISA和病毒中和抗体滴度(80％病毒蚀斑减少，PRNT80)。

在新的重组DEN-2 80％E制剂中，将免疫亲和纯化的80％产物单独，而且与IscoMatrix佐剂联合冻干。证明该重建产物在小鼠中保持了免疫原性能力。冻干每等份200微升的含5％(w/v)乳糖赋形剂和10mM磷酸钠、pH7.0的100微克纯化的DEN-2 80％E。小管的一半还含有等量(100微克)的IscoMatrix佐剂。在干冰-丙酮上冻结样品，-33℃57mT压力下冻干20小时。然后将搁板温度在400分钟内提升到25℃，每30分钟递增5℃。25℃干燥样品19小时，真空密封。
用加或不加IscoMatrix佐剂一起冻干的免疫亲和纯化的DEN-2 80％E皮下免疫成年雌性BALB/c小鼠(如上所述)。冻干后一日，以PBS重建抗原样品，用于免疫小鼠；各0.1毫升剂量含有10微克DEN-2 80％E和10微克IscoMatrix佐剂。冻干时不加IscoMatrix的DEN-2 80％E样品在注射时加入IscoMatrix。首次免疫4周后，小鼠接受了已冻干储藏在环境室温下一月后新鲜重建的DEN-2 80％E加或不加IscoMatrix的加强注射。加强接种每剂也含有10微克DEN-2 80％E和10微克IscoMatrix。加强免疫后10日收集血清用于分析，用前述的PRNT试验分析中和抗体应答。表10总结了结果。数据清楚显示，和IscoMatrix一起冻干的DEN-280％E与液体形式的DEN-2 80％E和不和IscoMatrix一起冻干的DEN-2 80％E相比，保持了完全的免疫原性(见实施例11、12、13和14)。就我们的知识而言，这首次证明了含有IscoMatrix佐剂的冻干的重组亚单位的制剂的效力。


1.一种疫苗，其特征在于，该疫苗含有一种或多种重组黄病毒包膜蛋白质亚单位和具有免疫刺激复合物的免疫调节剂以及药物学上可接受的载体，所述免疫调节剂免疫刺激复合物样结构中含有至少一种脂质和至少一种皂苷。
2.一种疫苗，其特征在于，该疫苗含有一种或多种重组黄病毒包膜蛋白亚单位，和一种免疫调节剂，以及药物学上可接受的载体，所述免疫调节剂含有内毒素衍生物、二霉菌酸海藻糖酯。
3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述至少一种脂质是固醇。
4.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述固醇是胆固醇。
5.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述至少一种皂苷是三萜皂苷。
6.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述三萜皂苷是Quil A。
7.如权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述内毒素衍生物是单磷酰脂质A。
8.如权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述二霉菌酸海藻糖是合成的海藻糖二柯楠霉菌酸酯。
9.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述重组黄病毒包膜蛋白质是羧基末端截短的蛋白质。
10.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述黄病毒是登革热病毒。
11.如权利要求1所述的疫苗，其特征在