包含分离自加工流的大豆乳清蛋白的甜食组合物的制作方法[0002]业内的食品科学家持续努力以开发新方法和所得的产品，其递送了消费者所期望的改善的营养特性。添加大豆蛋白是用于减少脂肪、提高蛋白含量并改善甜食的总体感官特性的一种高性价比方法，所述甜食例如布丁、人造稠黄油、明胶甜食、和冷冻甜点例如冰激凌、刨冰、果子露等。[0003]基于乳品的甜食通常由全脂乳、乳脂、和/或鲜奶油、以及糖制成，而不基于乳品的甜食在损害营养均衡的情况下可包含高含量的糖和卡路里，例如不包含任何纤维或蛋白。虽然许多人可能喜食甜食，但由于多种原因，这些犒赏食物趋于避免被摄入。首先，由于甜食通常包含高含量的脂肪和卡路里，它们历史上尚未成为营养价值高的产品。其次，很大一部分人群不能消耗基于乳品的冷冻甜点，因为他们不能代谢乳糖，一种存在于乳产品中的糖。第三，一些人由于对食用乳产品的宗教或个人信仰原因选择不食用基于乳品的冷冻甜点。根据所有这些因素，需要低乳品含量或不含乳品的甜食产品，它们同样具有营养价值。大豆蛋白也是增强甜食营养特征的高性价比方法。[0004]当人类消费大豆蛋白时它通常为三种形式的其中一种。这些蛋白包括大豆蛋白粉(粗磨粉)、大豆蛋白浓缩物和大豆蛋白分离物。所有三种类型均由脱脂大豆柏制成。粉和粗磨粉包含至少50%的`蛋白并且通过研磨所述柏制成。[0005]基于干重，大豆蛋白浓缩物包含65重量％至90重量％的蛋白，并且主要的非蛋白组分是纤维。大豆蛋白浓缩物通过用水重复洗涤所述大豆制成，大豆柏可任选地包含低水平的食品级醇或缓冲液。弃去来自重复洗涤过程的流出物并且干燥固体残余，从而产生期望的浓缩物。从原料中得到的浓缩物产量为大约60-70%。[0006]大豆蛋白浓缩物的制备一般产生两种流:大豆分离物流和大豆糖浆流，它们可包含至多55重量％的大豆蛋白。在商业规模上，必须弃去产生的显著体积的这种糖浆。总蛋白含量可包含至多15重量％的大豆总蛋白含量，它们来源于所述大豆。因此，在通常用于大豆蛋白浓缩物制备的方法中弃去显著部分的大豆蛋白。[0007]大?蛋白分尚物是可商购获得的最闻度精炼的大?蛋白广品，而且获得起来最昂贵。但是，对于大豆蛋白浓缩物，业内已知的当前加工方法导致大量有价值的矿物质、维生素、异黄酮和植物雌激素被排出，从而与制备所述分离物的低分子量糖一起形成废料流。[0008]大豆蛋白分离物包含基于干重最低90重量％的蛋白和很少或不包含可溶的碳水化合物或纤维。通常通过用稀碱(ρΗ〈9)提取脱脂大豆柏或大豆粉并离心来制备分离物。用食品级酸如硫酸、盐酸、磷酸或乙酸将提取物的PH调节至4.5。在4.5的pH下，蛋白的溶解度是最低的，因此它们将沉淀析出。然后在调节至中性PH之后干燥蛋白沉淀物，或者不进行任何PH调节就干燥蛋白沉淀物以产生大豆蛋白分离物。分离物的产量为初始大豆粉的30%至50%以及大豆粉中蛋白的60%。这种极低的产量以及所需的多个加工步骤导致生产大豆蛋白分离物的高成本。
[0009]至少部分地由于它们相对高的蛋白含量，期望大豆蛋白分离物用于多种用途。在常规的大豆蛋白分离物制造中，通常弃去在沉淀大豆蛋白分离物级份后剩余的水流(即，大豆乳清流)。在商业规模上，处理和处置这种废水流导致可观的成本。例如，大豆乳清流是相对稀的(例如，小于约5重量％的固体，通常约2重量％的固体)。因此，在商业规模上，产生显著体积的大豆乳清流，它们必须被处理和/或弃去。此外，已经观察到大豆乳清流可包含很大比例的大豆总蛋白含量，所述大豆用于制备大豆蛋白分离物。实际上，大豆乳清流可包含至多45重量％的大豆总蛋白含量，大豆蛋白分离物来源于所述大豆。因此，在常规大豆蛋白分离物生产中通常弃去大豆蛋白的显著部分。
[0010]尽管在加工流中通常损失高比例的大豆乳清蛋白，一般来讲尚未认为回收蛋白是经济上可行的。至少部分地，这些潜在有价值的蛋白的损失迄今一直被认为是可接受的，这是因为在乳清中的总蛋白浓度相对较低，并且因此对于每单位质量的回收蛋白来说必须处理的废水体积很大，这产生大量的污染。回收蛋白的尝试已经受到蛋白和大豆乳清中存在的其它组分的复杂混合物、以及蛋白固体的粗混合物缺少商业用途等因素的阻碍。虽然已知大豆乳清包含某些生物活性蛋白，这些蛋白的商业价值已经受到限制，这是因为缺乏以高纯度形式回收它们的方法。
[0011 ] 从大豆乳清中回收产品的方法是本领域已知的。例如，从大豆乳清和大豆糖浆进料流中分离特定异黄酮级份的方法描述于美国专利6，033，714 ;5，792，503 ;和5，702，752。在另一个方法中，当真空蒸馏从脱脂大豆粗粉的含水乙醇提取物中移除乙醇时，得到大豆糖浆(也称为大豆可溶物)。根据期望异黄酮级份的特定溶解度将进料流加热到所选温度。然后使所述流通过超滤膜，其允许低于最大分子量的异黄酮分子透过。然后透过物可使用反向渗透膜进行浓缩。然后使浓缩物流通过使用至少一个液相层析柱的树脂吸附方法进一步分离所述级份。
[0012]用于从大豆废物中移除低聚糖的方法也是本领域已知的。例如，Matsubara等人[Biosc1.Biotech.Biochem.60:421 (1996)]描述了使用反向渗透和纳滤膜从大豆废水流中回收大豆低聚糖的方法。JP07-082，287提出了使用溶剂萃取从大豆低聚糖糖浆中回收低聚糖的方法。该方法包括将有机溶剂加到包含低聚糖的水溶液中、加热所述混合物以提供均质溶液、冷却所述溶液以形成两个液体层、并分离和回收底层。
[0013]加拿大专利申请2，006，957和2，013，190描述了在乙醇水溶液中进行的离子交换方法，该方法用于从谷物加工废物中回收小量的高值副产品。根据CA2，013，190，来自谷物的醇提取物通过阴离子和/或阳离子离子交换柱进行加工以获取微量但是经济上有价值的产品。
[0014]大豆乳清和大豆糖浆也包含显著量的蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂已知至少抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及可能抑制调控一些关键代谢功能的多种其它关键跨膜蛋白酶。蛋白酶的局部给药对于例如特应性皮炎的病症是有用的，特应性皮炎是皮肤炎症的一种普通形式，其可以局限于少数区块或者涉及身体的大部分。蛋白酶抑制剂的去色素活性和它们防止紫外线导致的色素沉着的能力在体外和体内均已被证明(参见，例如，Paine等人，J.1nvest.Dermatol.，116:587-595[2001])。蛋白酶抑制剂还被报道有利于创伤愈合。例如，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂被证明当被局部施用时逆转了组织的破坏并加速了创伤愈合过程。此外，丝氨酸蛋白酶抑制剂还能够有助于在红斑狼疮病人中降低疼痛(参见例如，美国专利6，537，968)。天然存在的蛋白酶抑制剂可见于多种食物中，例如粮谷类(燕麦、大麦和玉米)、芽甘蓝、洋葱、甜菜根、小麦、龙爪稷和花生。所关注的一个来源是大豆。
[0015]从大豆和其它豆类中已鉴定了两大类的蛋白酶抑制剂超家族，每一类具有多种同工抑制剂。库尼兹胰蛋白酶抑制剂(Kunitz-trypsin inhibitor) (KTI)是第一类的重要成员，第一类的成员具有大约170-200个氨基酸，介于20-25kDa之间的分子量，并且主要针对胰蛋白酶。库尼兹胰蛋白酶抑制剂通常是具有以两个二硫键连接的4个半胱氨酸、并且具有一个位于由二硫键限定的环中的反应性位点的单链多肽。第二类的抑制剂包含60-85个氨基酸，具有6-10kDa范围的分子量，相对地热稳定，并且在独立的结合位点抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。鲍曼-伯克抑制剂(Bowman-Birk inhibitor) (BBI)是这一类的一个例子。大豆中存在的蛋白酶抑制剂的平均水平，对于KTI和BBI而言分别是约1.4%和0.6%。要注意的是，这些低水平使得分离天然的蛋白酶抑制剂用于临床用途是不现实的。
[0016]然而制备纯化BBI涉及昂贵的技术。此外，因为在大豆中存在的BBI平均含量仅为约0.6重量％，这一低含量使得分离天然蛋白酶抑制剂用于临床用途是不现实的和成本过高的。当前在本领域使用的纯化方法有多种。一些方法使用利用固载化胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的亲和纯化。固载化胰蛋白酶将结合BBI和库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)，因此未分离出特别纯的BBI产品。作为另外一种选择，涉及使用固载化胰凝乳蛋白酶的方法，虽然它不结合KTI，具有多个问题，例如对于规模化生产性价比不高以及胰凝乳蛋白酶在多个使用和清洁步骤后可能从树脂中滤掉。许多较老的BBI纯化方法使用阴离子交换层析，该技术能够引起BBI异构体的精馏，此外，用阴离子交换层析获取无KTI的BBI级份、同时不显著损失BBI的产量一直是困难的。因此，当前已知的所有用于分离BBI的方法都有问题，这是由于缓慢的加工、低产量、低纯度、和/或需要导致时间和成本增加的多个步骤引起的。
[0017]仅利用过滤作为唯一方法的纯化方法效用不大，这是由于膜污染、非蛋白组分与BBI蛋白不完全的和/或不完整的分离、以及BBI蛋白与其它蛋白的无效的分离。仅利用层析作为唯一方法的纯化方法也效用不大，这是由于结合能力和过载问题、不完全的和/或不完整的分离的问题(例如分离KTI与BBI)、蛋白与树脂的不可逆结合问题、树脂寿命问题、以及与其它技术相比该技术相对更昂贵。仅涉及硫酸铵沉淀作为唯一方法的纯化方法也效用不大，这是由于BBI蛋白的不可逆沉淀的可能性、BBI蛋白活性的潜在损失、BBI蛋白的不完全沉淀(即，产量损失)、以及从最终产品中移除硫酸铵的需求，这增加了一个附加步骤和成本。
[0018]由于库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)蛋白对BBI造成的污染，当前本领域已知的用于获取纯化BBI蛋白的方法受到纯度水平较低的困扰。取决于使用的分离方法，内毒素含量也可能是一个问题。当前的方法使用全大豆作为原料，然后通过多种装置将其脱脂。与之相反，本发明的方法使用脱脂大豆白柏作为原料。因此，现有技术尚未描述从大豆蛋白来源获得的、不使用酸或醇萃取或者丙酮沉淀的、具有高纯度水平的BBI产品。因此，存在对适用于高纯度BBI和变体的生产的方法和组合物的需求。
[0019]因此，在本领域中对于将大豆乳清蛋白作为成分并入的食物产品具有需求，所述大豆乳清蛋白根据本文公开的方法回收自大豆加工流。因此，本发明描述了组合物，其包含根据本文所述的方法而回收的大豆乳清蛋白。除所回收的大豆乳清蛋白之外，组合物还可包含至少一种其它成分，并且形成甜食产品。包含所回收的大豆乳清蛋白作为成分的甜食产品已经发现具有提高量的蛋白以及消费者所期望的整体营养特征，同时维持了当前市场中的典型甜食产品的相同口味、结构、芳香和口感。


[0020]本公开涉及到包含大豆乳清蛋白的组合物，所述大豆乳清蛋白根据本文公开的用于纯化大豆加工流的新型方法而回收。本文所公开的组合物随后用于形成甜食产品如布丁、人造稠黄油、明胶甜食、和冷冻甜点例如冰激凌、刨冰、果子露等。具体地，本公开提供了包含所回收的大豆乳清蛋白的甜食产品，已经发现该产品具有改善的营养特征，包括具有提高量的蛋白，同时维持了当前市场中的和消费者所期望的典型甜食产品的相同结构、芳香和外观。包含本公开的大豆乳清蛋白的甜食组合物可与至少一种其它成分相结合以形成甜食产品。
[0021]在一个实施例中，加入大豆乳清蛋白在最终使用中产生较深的颜色和提高量的泡沫。在另一个实施例中，提高量的SWP降低发泡能力，而降低量的SWP提高发泡能力。在另一个实施例中，提高量的SWP导致甜食熔融的更快。在附加的实施例中，与性质上最可能的替代物(MLA, Most likely Alternatives)相比,加入SWP导致粘度降低。
[0022]本公开的甜食产品并入了大豆乳清蛋白，其根据新型加工方法回收自加工流。为回收所述大豆乳清蛋白，一系列的膜或色谱分离操作步骤(其在下文中更详尽地描述)以多种次序进行结合，用来包含用于从加工流中回收大豆乳清蛋白和其它组成物的总体方法。本发明加工方法导致了一种或多种大豆乳清蛋白、糖和矿物质从大豆加工流中的分离和移除，所述大豆加工流包含大豆乳清蛋白、一种或多种大豆贮藏蛋白、一种或多种糖、以及一种或多种矿物质。所述大豆乳清蛋白根据新型加工方法从所述加工流中的移除使该大豆乳清蛋白得以用于组合物，从而产生了所述甜食产品。



[0023]图1是在乳清流中存在的蛋白、以及它们的特性的示意图。
[0024]图2图示了大豆乳清蛋白在PH3-7的范围内与大豆蛋白分离物相比的溶解度。
[0025]图3图示了大豆乳清蛋白与大豆蛋白分离物相比的流变学特性。
[0026]图4A是描述用于从加工流中回收纯化大豆乳清蛋白的方法中的步骤O至4的流程不意图。
[0027]图4B是描述用于从加工流中回收纯化大豆乳清蛋白的方法中的步骤5、6、14、15、16和17的流程示意图。
[0028]图4C是描述用于从加工流中回收纯化大豆乳清蛋白的方法中的步骤7至13的流程不意图。
[0029]图 5 图不了当以 10mT, / min、15mL / min、20mL / min 和 30mL / min(分别是5.7cm / min、8.5cm / min、11.3cm / min、17.0cm / min 的线性流量)加载大豆乳清通过SP Gibco阳离子交换树脂床时对空载柱体积作图的穿透曲线。
[0030]图 6 图不了 当使大豆乳清以 10mT, / min、15mL / min、20mL / min 和 30mL /min(分别是 5.7cm / min、8.5cm / min> 11.3cm / min> 17.0cm / min 的线性流量)通过SP Gibco阳离子交换树脂时它的蛋白吸附对空载柱体积的作图。
[0031]图7图示了当以15mL / min加载大豆乳清并通过SP Gibco阳离子交换树脂床以3和5的因数浓缩大豆乳清时对空载柱体积作图的穿透曲线。
[0032]图8图示了当使大豆乳清和以3和5的因数浓缩的大豆乳清以15mL / min通过SP Gibco阳离子交换树脂床时，SP Gibco阳离子交换树脂的蛋白吸附对空载柱体积的作图。
[0033]图9图示了当使大豆乳清和以3和5的因数浓缩的大豆乳清以15mL / min通过SP Gibco阳离子交换树脂床时，SP Gibco阳离子交换树脂的平衡蛋白吸附对在通过流中的平衡蛋白浓度的作图。
[0034]图10图示了以不同线性速度随时间解吸的大豆乳清蛋白的洗脱特征。
[0035]图11图示了以不同线性速度与柱体积解吸的大豆乳清蛋白的洗脱特征。
[0036]图12描述对Mimo6ME级份的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
[0037]图13描述对Mimo4SE级份的SDS-PAGE分析。
[0038]图14描述对Mimo6HE级份的SDS-PAGE分析。
[0039]图15描述对Mimo6ZE级份的SDS-PAGE分析。

[0040]本发明提供了包含大豆乳清蛋白的组合物，所述大豆乳清蛋白回收自在大豆蛋白分离物制造中产生的多种豆科植物加工流(包括大豆乳清流和大豆糖浆流)。所回收的大豆乳清蛋白作为成分可用于组合物，其随后用于形成甜食产品。据显示所产生的甜食产品表现出改善的营养特性，包括具有提高量的蛋白，同时维持了当前市场中的典型甜食产品的相同口味、结构、芳香和口感。
[0041]一般来讲，所述大豆加工流的纯化包括一个或多个操作(例如膜分离操作)，其经选择和设计以提供对期望蛋白或其它产品的回收，或提供对所述大豆乳清流的多个组分的分离，或兼而提供两者。回收大豆乳清蛋白(例如鲍曼-伯克抑制剂(BBI)和库尼兹胰蛋白酶抑制剂(KTI)蛋白)和大豆乳清流的一种或多种其它组分(例如多种糖，包括低聚糖)可利用多种分离技术(例如膜、层析、离心、或过滤)。具体的分离技术将取决于有待通过将其与所述加工流的其它组分分离而被回收的所期望的组分。
[0042]例如，纯化KTI级份通常通过下列步骤制备:移除一种或多种杂质(例如，微生物或矿物质)，然后移除包括一种或多种大豆贮藏蛋白(即，大豆球蛋白和β_伴球蛋白)的附加的杂质，然后移除一种或多种大豆乳清蛋白(包括例如，BBI和其它非KTI的蛋白或肽)，和/或然后从大豆乳清中移除包括糖类的一种或多种附加的杂质。通过稀释除去使纯度降低的乳清流的其它主要组分(例如，贮藏蛋白、矿物质和糖类)，同时同样地通过纯化蛋白级份提高纯度，改进了高纯度形式的多种靶组分的回收，其中所述纯化蛋白级份通过除去作为所述蛋白的拮抗物和/或具有有害效应的组分(例如，内毒素)进行。大豆乳清的多种组分的移除通常包括在所述大豆乳清的组分的移除之前和/或过程中对所述大豆乳清的纯化。本发明的方法也将减少加工大量含水垃圾产生的污染。
[0043]贮藏蛋白、糖类、矿物质和杂质的移除产生富集了单个目标蛋白，并且不含可能是拮抗剂或毒素或者可能在其它方面具有有毒效应的杂质的级份。例如，大豆贮藏蛋白富集的级份通常可以与富集了一种或多种大豆乳清蛋白级份一起被回收。富集了一种或多种糖类(例如低聚糖和/或多糖)的级份也通常被制备。因此，本方法提供适合作为用于回收单个目标蛋白的基料的级份，并且还提供能够被用作用于从含水大豆乳清中经济地回收其它有用产品的基料的其它级份。例如，从大豆乳清流中移除糖和/或矿物质产生有用级份，从其中可进一步分离糖，从而产生附加的有用级份:浓缩糖和矿物质级份(其可包括柠檬酸)，以及相对纯的含水级份，其可以最低限度的处理(如果存在的话)被处置或作为工艺用水被利用。如此产生的工艺用水在本方法的实施中可以是尤其有用的。因此，本方法的进一步的优点可以是与常规的分离制备方法相比降低的工艺用水需求。
[0044]本公开的方法以至少两种方式提供了高于制造大豆蛋白分离物和浓缩物的常规方法的优点。如所指出的，制造大豆蛋白材料的常规方法通常处理大豆乳清流(例如含水的大豆乳清或大豆糖浆)。因此，通过本公开的方法回收的产品代表了附加的产品，和目前在与常规的大豆蛋白分离物和大豆蛋白浓缩物制造的关联中未实现的收益来源。此外，对大豆乳清流或大豆糖浆进行的用于回收可出售的产品的处理，可取地降低了与对大豆乳清流或大豆糖浆的处理或处置相关的成本。例如，如本文中其它地方所详述的，本发明的多种方法提供了相对纯的大豆加工流，所述加工流可以在多种其它方法中被容易地利用或者以最低限度的处理(如果存在的话)被处置，从而降低所述方法对环境的影响。某些成本与本公开的方法相关联地存在，但所分离的附加的产品和废物处理的最小化的益处据信弥补了任何增加的成本。
[0045]A.大豆乳清蛋白
[0046]根据本公开方法回收的大豆乳清蛋白代表着本领域中对于其它大豆蛋白和分离物的显著改进。如本文所指出的，从加工流中回收的本公开大豆乳清蛋白与本领域存在的其它大豆蛋白相比具有独一无二的特性。
[0047]大豆蛋白分离物通常在大豆贮藏蛋白的等电点(例如，约4.1的pH)从脱脂大豆柏或大豆粉的水提物中沉淀。因此，大豆蛋白分离物一般包括在酸性液体介质中不可溶的蛋白。类似地，大豆蛋白浓缩物(第二精纯的大豆蛋白材料)的蛋白同样在酸性液体介质中是不可溶的。然而，通过本公开的方法回收的大豆乳清蛋白的区别在于它们一般是酸可溶的，意味着它们在酸性液体介质中是可溶的。
[0048]本公开提供了来源于含水大豆乳清的大豆乳清蛋白组合物，所述含水大豆乳清表现出比本领域存在的大豆蛋白有利的特性。例如，根据本发明方法分离的大豆乳清蛋白在环境条件(例如，约25°C的温度)下在跨越相对宽范围pH的含水(通常为酸性的)介质(例如，具有约2至约10、约2至约7、或约2至约6的pH的含水介质)中具有高溶解度(即SSI%大于80)。如表I和图2所示，据本公开的方法分离的大豆乳清蛋白的溶解度在所有测试的PH值下为至少80%，并且除一种情况(即，pH4)外均为至少约90%。这些发现与大豆蛋白分离物进行比较，其在相同酸性PH值下显示不良的溶解度特性。这种独特的特性使本发明的大豆乳清蛋白能够在具有酸性pH水平的应用中使用，这代表对大豆分离物的显著优势。
[0049]除溶解度之外，本公开的大豆乳清蛋白还具有比其它大豆乳清蛋白低得多的粘度。如表1和图3所示，本发明的大豆乳清蛋白表现出的粘弹性特性(即，流变学特性)与水的相似度高于与大豆蛋白分离物的相似度。水在20°C的粘度为约I厘泊(cP)。发现本公开的大豆乳清蛋白表现出在约2.0至10.0cP，优选地在约3.6至7.5cP范围内的粘度。除了它在酸性PH水平的高溶解度之外，这种低粘度也使得本公开的大豆乳清蛋白有用并且较好地适用于经常涉及使用其它大豆蛋白的用途(例如在饮料中)，因为它具有比大豆分离物好得多的流动特性。
[0050]复1:大豆乳清与其它大豆蛋白相比的溶解度和粘弹性特性
[0051]