一种磷酸化麝香蛸素的纯化方法【技术领域】[0001]本发明涉及一种磷酸化麝香蛸素的纯化方法，属化学纯化【技术领域】，主要为磷酸化多肽在医药等领域的有效应用提供条件。[0002]麝香蛸素(Eledoisin)是从麝香蛸(Eledone)中提取得到的含11个氨基酸的多妝，其序列为 Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-1le-Gly-Leu-Met-NH2,具有强烈的外周血管舒张及增加冠脉血流量的作用，是已知肽类中最有效的降压物质，其效应比硝酸甘油强数千倍。磷酸化麝香蛸素是将其N端第3位Ser磷酸化后得到的，序列为Pyr-Pro-Ser (PO3H)-LyS-ASp-Ala-Phe-1le-Gly-Leu-Met-NH2，其活性比麝香蛸素高两倍多(一种强效降压磷酸肽及其制备方法，申请号:201410118129.2)，降压持续时间延长I倍左右。因此磷酸化麝香蛸素将在医药领域具有良好应用前景。但由于其存在纯化难的问题，限制了其有效应用。目前磷酸化麝香蛸素主要通过化学法合成，虽然磷酸化麝香蛸素比麝香蛸素只多了一个磷酸基团，但要大量制备磷酸化麝香蛸素纯品的难度大为增加，原因:一是磷酸化麝香蛸素的化学合成产率较低，副产物较多；二是色谱法中最常用的反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)，每次纯化的量有限(〈lOOmg)，纯化过程非常费时费力；三是磷酸化麝香蛸素与其对应的非磷酸化麝香蛸素在最常用的色谱分离中行为非常相似，导致RP-HPLC很难将其分离。因此，要得到磷酸化麝香蛸素的纯品，尤其是大量制备，是一项非常重要而又困难的工作。[0003]针对磷酸化多肽的分析水平的纯化，除了色谱法外，目前发展的技术主要有固相金属亲和色谱(IMAC)和金属氧化物富集法。近期，金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注，如二氧化钛(TiO2)和二氧化错(ZrO2)等。2004年Pinkse等(“Selective isolatio n at the femtomole level of phosphopeptides fromproteolytic digests using2D-NanoLC-ESI_MS/MS and titanium oxide precolumns，，，《Analytical Chemistry)), P3935-3943, 2004年)将二氧化钛技术引进磷酸化蛋白质组学领域，并建立了 TiO2为预分离的2D-NanoLC-ES1-MS/MS技术平台。近期利用TiO2富集磷酸肽的文献亦有报道，并证明了二氧化钛对磷酸肽富集的高效性(“A novel titaniumdioxide-polydimethylsiloxane plate for phosphopeptide enrichment and massspectrometry analysis”,《Analytica Chimica Acta》，P105-113, 2014年)。但目前已报道的技术主要在蛋白质组学领域中对生物样本中的天然磷酸化多肽进行微量相对富集(申请号 201310253448.X, 200810202189.7,200810211727.9)，以便提高磷酸化多肽在质谱中的检出率，尚停留在分析水平的纯化，无法满足化学法合成的磷酸化多肽的大量纯化的要求，特别是磷酸化麝香蛸素的纯化方法尚未见报道。
[0004]本发明的目的在于提供一种能用于化学合成的磷酸化麝香蛸素的高选择性、高特异性的纯化方法，为磷酸化麝香蛸素在医药等领域的应用提供条件。[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:[0006]利用二氧化钛与磷酸根在酸性环境中存在较强的路易斯酸碱作用，在碱性环境中路易斯酸碱作用消失的原理并结合自主研发的一种磷酸化多肽的纯化装置(申请号:201420158316.9)而实现的。首先将二氧化钛装填到一种磷酸化多肽的纯化装置中，并在酸性环境下，将磷酸化麝香蛸素加入纯化玻璃管中，由于酸性条件下二氧化钛表现为路易斯酸，钛原子将与磷酸根阴离子结合，起到特异性吸附磷酸化麝香蛸素的目的；然后用酸性较低的清洗液将没有被吸附的非磷酸化多肽和杂质去除；清洗完后，利用碱性环境下二氧化钛表现为路易斯碱，失去与磷酸根作用的特点，因此加入碱性溶液，便可洗脱得到纯品磷酸化麝香蛸素，从而实现化学合成磷酸化麝香蛸素的纯化。具体步骤如下:[0007](I)移取40 μ m, 300A的二氧化钛纳米粒子到自主研发的一种磷酸化多肽的纯化装置(申请号:201420158316.9)中；
[0008](2)用70%乙腈/3%三氟乙酸的浸润液浸润二氧化钛纳米粒子，混悬，0.05~
0.09mbar条件下减压移除浸润液；
[0009](3)将样品溶解在70%乙腈/3%三氟乙酸的上样液中，之后加入(2)中，混悬，
0.05~0.09mbar条件下减压移除上样液；
[0010](4)分别加入清洗液60%乙腈/0.1 %三氟乙酸、50%乙腈/0.1 %三氟乙酸、50%乙腈洗漆，混悬，0.05~0.09mbar条件下减压移除清洗液,除去非磷酸化多肽和杂质；
[0011](5)加入洗脱液0.lmol/L氨水，混悬，移除洗脱液，洗脱磷酸化麝香蛸素；
[0012](6)用色谱 、 质谱分析技术分析鉴定磷酸化麝香蛸素。
[0013]本发明的有益效果是:
[0014]1.为磷酸化麝香蛸素的纯化提供有效方法。化学合成的磷酸化麝香蛸素的粗产品产物比较复杂，纯化难度大，本发明借助二氧化钛与磷酸化麝香蛸素之间的特异性作用，可以高特异性地对磷酸化麝香蛸素吸附，从而起到纯化的效果，将促成其在医药等领域的应用。
[0015]2.方法操作简便、经济高效。与传统的多肽纯化方法相比，本发明的方法(I)操作非常简便，无需昂贵的仪器(如高效液相色谱法仪器、制备型色谱柱等)；(2)效果经济高效，溶剂的用量比传统常用的色谱法大大节省(大约可以节省10倍左右)，所耗时间也极大缩短(一个样本大约只需10分钟左右，传统的纯化方法，特别依赖仪器，一个仅仅50mg左右的样本大约需要90分钟左右，如果样本量大，还要重复上样，时间上也将相应翻倍，溶剂的用量同样也要翻倍)。
[0016]3.特别适用于与其对应的非磷酸化多肽色谱行为非常相近的磷酸化多肽的纯化。色谱行为相近的多肽采用最常用的RP-HPLC很难将其分离，有时即使多次分离也很难实现，而采用二氧化钛与磷酸基团的亲和富集作用，可以很好的特异性地纯化磷酸化多肽。



[0017]图1为纳米二氧化钛材料用于化学合成的磷酸化多肽的纯化流程示意图。
[0018]图2为色谱行为非常相近的麝香蛸素和磷酸化麝香蛸素高效液相色谱分析图。(a)磷酸化麝香蛸素的高效液相色谱色谱图；(b)麝香蛸素的高效液相色谱图。
[0019]图3为化学合成的三个多肽纯品混合后的MALD1-T0F-MS图。(a)未经二氧化钛纯化MS分析；(b)经过二氧化钛纯化后MS分析。(c)为清洗二氧化钛玻璃管中残留的非磷酸化多肽和杂质的质谱图；(d)为洗脱下的磷酸化多肽[Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2]的质谱图。
三个多肽纯品分别为:
[0020]憐酸化多妝I =Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2
[0021]非憐酸化多妝2 =Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Phe (Cl)-Gly-Leu-Met-NH2
[0022]非憐酸化多妝3:Pyr-Pro-Ser-LyS-Asp-Ala-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2
[0023]图4为单体法化学合成磷酸化磨香蛾素Pyr-Pro-Ser (PO3H) -Lys-Asp-Ala-Phe-1 Ie-Gly-Leu-Met-NH2的MALD1-TOF-MS图。(a)未经二氧化钛纯化MS分析；(b)经过二氧化钛纯化后MS分析。
[0024]图5为总体法化学合成磷酸化磨香蛾素Pyr-Pro-Ser (PO3H) -Lys-Asp-Ala-Phe-1Ie-Gly-Leu-Met-NH2的MALD1-TOF-MS图。(a)未经二氧化钛填料纯化MS分析；(b)经过二氧化钛填料纯化后MS分析。
[0025]实施例1
[0026]磷酸化麝香蛸素与其它两个非磷酸肽混合后的简单样本的纯化制备:
[0027]称取IOOmg的二氧化钛到带有筛板的纯化玻璃管中，加入70%乙腈/3% TFA的溶液10mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液0.05~0.09mbar条件下减压滤除，等待上样；称取磷酸化多妝 I 纯品 Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2 和两个非憐酸化多妝纯品[Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Phe(Cl)-Gly-Leu-Met-NH2 和 Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2]各 IOmg,混合后，溶解在 70% 乙腈/3% TFA 的溶液20mL中，上下震荡混匀5分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除；加入60%乙腈/0.1 % TFA的溶液20mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液减压滤除；加入50%乙腈/0.1%TFA的溶液20mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液减压滤除；加入50%乙腈的溶液20mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除；最后加入0.lmol/L的氨水溶液洗三遍，体积分别为20mL、10mL、10mL，上下震荡混匀各3分钟，将溶液在0.05~
0.09mbar条件下减压滤除到干净的容器中。进行MALD1-TOF-MS分析。图3中(a)为磷酸化多妝[Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr (PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2 和两个非憐酸化多妝Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Phe(Cl)-Gly-Leu-Met-NH2和 Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-AlB-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2]混合后经二氧化钛玻璃管纯化前的质谱图；图3中(b)为未被二氧化钛吸附而流出的非磷酸化多肽和杂质的质谱图；图3中(c)为清洗二氧化钛玻璃管中残留的非磷酸化多肽和杂质的质谱图；图3中(d)为洗脱下的磷酸化多肽[Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr (PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2]的质谱图。磷酸化多肽用标记。可见磷酸化多肽简单样本可用本发明方法很好纯化。
[0028]实施例2
[0029]单体法化学合成的磷酸化麝香蛸素的纯化制备:
[0030]称取Ig的二氧化钛到带有筛板的纯化玻璃管中，加入70 %乙腈/3 % TFA的溶液10mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除，等待上样；称取IOOmg 单体法化学合成的憐酸化磨香蛾素[Pyr-Pro-Ser (PO3H) -Lys-Asp-Ala-Phe-1le-Gly-Leu-Met-NH2]粗品，将其溶解在70%乙腈/3% TFA的溶液20mL中，上下震荡混匀5分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除；加入60%乙腈/0.1 % TFA的溶液20mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除；加入50%乙腈/0.1% TFA的溶液20mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液减压滤除；加入50%乙腈的溶液20mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除；最后加入0.lmol/L的氨水溶液洗三遍，体积分别为20mL、IOmL, IOmL,上下震荡混匀各3分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除到干净的容器中。进行MALD1-TOF-MS分析。图4中(a)与图4中(b)为单体法化学合成的憐酸化磨香蛾素[Pyr-Pro-Ser (PO3H) -Lys-Asp-Ala-Phe-1le-Gly-Leu-Met-NH2]粗品经二氧化钛玻璃管纯化前后的质谱图。磷酸化麝香蛸素用标记。可见单体法化学合成的磷酸化麝香蛸素虽然副产物较多，但仍可用本发明方法很好纯化制备。
[0031]实施例3
[0032]总体法化学合成的磷酸化麝香蛸素的纯化制备:
[0033]称取Ig的二氧化钛到带有筛板的纯化玻璃管中，加入70 %乙腈/3 % TFA的溶液10mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除，等待上样；称取IOOmg总体法化学合成的磷酸化磨香蛾素[Pyr-Pro-Ser (PO3H)-Lys-Asp-Ala-Phe-1le-GIy-Leu-Met-NH2]粗品，将其溶解在70%乙腈/3% TFA的溶液20mL中，上下震荡混匀5分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除；加入60%乙腈/0.1 % TFA的溶液20mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除；加入50%乙腈/0.1 %TFA的溶液20mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除；加入50%乙腈的溶液20mL，上下震荡混匀I分钟，将溶液在0.05~0.09mbar条件下减压滤除；最后加入0.lmol/L的氨水溶液洗三遍，体积分别为20mL、10mL、10mL，上下震荡混匀各3分钟，将溶液在0.05~0.09mba`r条件下减压滤除到干净的容器中。进行MALD1-TOF-MS分析。图5中(a)与图5中(b)为总体法化学合成的磷酸化磨香蛾素[Pyr-Pro-Ser(PO3H)-Lys-Asp-Ala-Phe-1le-Gly-Leu-Met-NH2]粗品经二氧化钛玻璃管纯化前后的质谱图。磷酸化麝香蛸素用标记。可见总体法化学合成的磷酸化麝香蛸素虽然副产物较多，但仍可用本发明方法很好纯化制备。