专利名称：脂肪酶催化合成熊果苷的方法熊果苷具有显著的抑制酪氨酸酶活性，减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变和祛斑的功效；是国际公认的正在极力推广的高效、安全的美白剂，是美白、祛斑、防晒化妆品理想的添加成份。酶固定化(Enzyme immobilization)技术是20世纪60年代发展起来的一门新兴生物技术，在化工、发酵生产、能源、医药等行业，实际应用效果显著。它是利用物理或化学的手段将游离酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性反复利用的方法。酶固定化技术与传统的悬浮生物处理法相比，酶固定化有提高单位体积的酶密度，酶易回收，对环境的耐受力增强(如PH值、温度、有机溶剂、有毒物质等)等优点。目前，熊果苷主要通过化学合成方法制备，该方法主要以葡萄糖和对苯二酚为原料，经乙酰化、溴代、缩合、脱乙酰基等一系列复杂反应制得。化学合成熊果苷存在工艺步骤复杂、反应条件苛刻、使用大量有毒溶剂，给环境造成严重污染。为了克服这些问题，许多研究开始转向采用酶法催化合成熊果苷，但目前普遍采用的糖苷酶存在成本高、酶活低的缺点，不利于工业化推广。脂肪酶作为一种应用广泛、价格低廉的商业酶，具有反应条件温和、脂肪酶可多次重复利用，生产周期短，产物提取工艺简单等优点，大大降低了生产成本。对熊果苷的酶法工业化生产具有重要的现实意义。
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用游离或固定化脂肪酶催化合成熊果苷反应条件温和、脂肪酶可多次重复利用、缩短了生产周期、提高了熊果苷的产率，降低熊果苷的生产成本，使大规模生产熊果苷成为了可能。本发明的整体技术构思是游离猪胰脂肪酶催化合成熊果苷的方法，该方法由下列工艺步骤组成a.游离脂肪酶催化合成熊果苷；b.游离脂肪酶的回收及多次重复使用；C.游离脂肪酶催化合成的熊果苷的分离纯化；固定化猪胰脂肪酶催化合成熊果苷的方法，该方法由下列工艺步骤组成A.固定化脂肪酶催化合成熊果苷；B.固定化脂肪酶的回收及多次重复使用；C.固定化脂肪酶催化合成的熊果苷的分离纯化。本发明的具体工艺步骤及工艺条件是步骤a中反应条件为对苯二酚和糖按两者摩尔比在1 1-1 5的范围，加入到反应媒介中，反应以游离猪胰脂肪酶为催化剂，在温度20-60°C，摇床转速100-200r/min的条件下，反应10-240小时，脂肪酶的用量是糖质量的0. 01-1倍；糖为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖；反应媒介为水、有机溶剂、离子液体或混合溶剂；其中有机溶剂为正己烷、环己烷、石油醚、正庚烷、正辛烷、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、叔戊醇、二甲基亚砜、吡啶、四氢呋喃、 二氯甲烷或四氯甲烷；离子液体为[bmim]PF6、[nmim]PF6、[bmim]BF4、[nmim]BF4、[omim]BF4、 [4-mbp]BF4, [bmim]0Tf、[bmim]NTf2、[讓加]1116504或[emim]benzoate ；混合溶剂为有机溶剂之间的混合溶剂或有机溶剂与水之间的混合溶剂，如正己烷与环己烷的混合溶剂，正己烷与正辛烷的混合溶剂，正丁醇和叔丁醇的混合溶剂，叔丁醇和二甲基亚砜的混合溶剂，正己烷、正丁醇和吡啶的混合溶剂、正己烷和水的混合溶剂，叔丁醇和水的混合溶剂，叔丁醇、 二甲基亚砜和水的混合溶剂或正己烷、叔丁醇、二甲基雅芳和水的混合溶剂等。步骤A中反应条件为对苯二酚和糖按两者摩尔比在1 1-1 5的范围，加入到反应媒介中，反应以固定化猪胰脂肪酶为催化剂，在温度20-60°C，摇床转速100-200r/min的条件下，反应10-120 小时，脂肪酶的用量是糖质量的0. 01-5倍；糖为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖；反应媒介为水、有机溶剂、离子液体或混合溶剂；其中有机溶剂为正己烷、环己烷、石油醚、正庚烷、正辛烷、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、叔戊醇、二甲基亚砜、吡啶、四氢呋喃、 二氯甲烷或四氯甲烷；离子液体为[bmim]PF6、[nmim]PF6、[bmim]BF4、[nmim]BF4、[omim]BF4、 [4-mbp]BF4, [bmim]0Tf、[bmim]NTf2、[讓加]1116504或[emim]benzoate ；混合溶剂为有机溶剂之间的混合溶剂或有机溶剂与水之间的混合溶剂，如正己烷与环己烷的混合溶剂，正己烷与正辛烷的混合溶剂，正丁醇和叔丁醇的混合溶剂，叔丁醇和二甲基亚砜的混合溶剂，正己烷、正丁醇和吡啶的混合溶剂、正己烷和水的混合溶剂，叔丁醇和水的混合溶剂，叔丁醇、 二甲基亚砜和水的混合溶剂或正己烷、叔丁醇、二甲基雅芳和水的混合溶剂等；脂肪酶固定化介质为固体颗粒、纤维织物或非织造布，如硅胶、硅藻土、树脂、棉布、聚酯、尼龙或丝绸。步骤b中游离脂肪酶的回收及多次使用为回收方法板框过滤、滤纸过滤、微滤、超滤、纳滤或离心；使用寿命5-10周期。步骤B中固定化脂肪酶的回收及多次使用为回收方法板框过滤、滤纸过滤、微滤、超滤、纳滤或离心；使用寿命10-50周期。步骤c和步骤C中的熊果苷的分离纯化包括以下四个步骤①将去除脂肪酶后的反应液真空浓缩回收反应媒介，真空浓缩真空度为0. IMpa, 温度为30-65度；②把经过①步骤的浓缩液通过弱极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化；③把经过②步骤大孔吸附树脂柱的流出液真空干燥，即可得到纯度为95%以上的熊果苷粗品，真空干燥真空度为0. IMpa，温度为40-65度，干燥后的成品为白色粉末状；④把经过③步骤的熊果苷粗品溶于水后进行结晶，即得到纯度为99. 5%以上得熊果苷纯品，结晶温度为0-4度。本发明提供的利用脂肪酶催化合成熊果苷的方法，其中脂肪酶酶活的定义为 40°C条件下，pH8. 0的磷酸缓冲溶液中水解橄榄油，没分钟释放出1 μ mol脂肪酸的酶量为一个酶活单位。本发明所用的脂肪酶的酶活单位为250-10000U/g。本发明所取得的技术进步在于(1)本发明为国内外首次利用脂肪酶催化对苯二酚和糖合成熊果苷；(2)相对于化学法合成熊果苷，本发明具有反应条件温和、工艺步骤简单、不使用有毒害溶剂、环境友好等优点；(3)相对于传统酶法合成熊果苷，本发明所用的脂肪酶为商业化脂肪酶，具有成本低、来源广泛、可大规模工业化生产等优点；(4)本发明使用固定化脂肪酶，具有脂肪酶与底物和产物容易分离的特点，而且脂肪酶的使用寿命长，可重复利用和连续化生产；实施例以下结合实施例对本发明做进一步描述。实施例1(a)游离脂肪酶催化合成熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 18g(Immol)葡萄糖加入到IOml叔丁醇中，反应以0. 02g游离猪胰脂肪酶为催化剂，在温度40°C，摇床转速150r/min的条件下，反应M小时，转化率达65% ；(b)游离脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 18g(Immol)葡萄糖的IOml叔丁醇反应体系中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成熊果苷，在此条件下， 游离脂肪酶转化8周期，熊果苷的转化率分别为64. 5%,63. 0%,63.0%,62. 2%,60. 0%, 58. 5%,55.0%,52. 6%，所以游离脂肪酶在使用8次后，酶活仍保持在50%以上。(c)熊果苷的分离纯化①将离心后的上清液真空浓缩回收叔丁醇，真空浓缩真空度为0. IMpa，温度为55 度；②把经过①步骤的浓缩液通过弱极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化；③把经过②步骤大孔吸附树脂柱的流出液真空干燥，即可得到纯度为96%的熊果苷粗品，真空干燥真空度为0. IMpa，温度为45度，干燥后的成品为白色粉末状；④把经过③步骤的熊果苷粗品溶于水后进行结晶，即得到纯度为99. 5%以上得熊果苷纯品，结晶温度为4度。实施例2(a)游离脂肪酶催化合成熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖加入到IOml含二甲基亚砜体积份数为10%的叔丁醇中，反应以0. 05g游离猪胰脂肪酶为催化剂，在温度40°C，摇床转速150r/min的条件下，反应72小时，转化率达85% ；(b)游离脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖的IOml含二甲基亚砜体积份数为10%的叔丁醇中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成熊果苷，在此条件下，游离脂肪酶转化9周期，熊果苷的转化率分别为84.5%、83.0%、 83. 0%、82. 2%、80. 0%、78. 5%、75. 0%、73. 8%、72. 6%，所以游离脂肪酶在使用 9 次后， 酶活仍保持在70%以上。(c)熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例1的步骤c。实施例3(a)游离脂肪酶催化合成熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 90g(5mmol)葡萄糖加入到IOml含二甲基亚砜体积份数为10%的叔丁醇中，反应以0. 2g游离猪胰脂肪酶为催化剂，在温度40°C，摇床转速150r/min的条件下，反应72小时，转化率达96% ；(b)游离脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 90g(5mmol)葡萄糖的IOml含二甲基亚砜体积份数为10%的叔丁醇中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成熊果苷，在此条件下，游离脂肪酶转化10周期，熊果苷的转化率分别为95. 5%,94. 3%, 93. 0%、92. 2%、89. 0%、87. 5%、85. 0%、82. 8%、81. 6%、80. 3%，所以游离脂肪酶在使用 10次后，酶活仍保持在80%以上。(c)熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例1的步骤C。实施例4(a)游离脂肪酶催化合成熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 68g(2mmol)蔗糖加入到IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%二甲基亚砜和体积份数85%叔丁醇及体积份数5%水组成)中，反应以0. 05g游离猪胰脂肪酶为催化剂，在温度45°C，摇床转速150r/min的条件下，反应96 小时，转化率达90. 5% ；(b)游离脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 68g(2mmol)蔗糖的IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%二甲基亚砜和体积份数85%叔丁醇及体积份数5%水组成)中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成熊果苷，在此条件下，游离脂肪酶转化9周期，熊果苷的转化率分别为90. 5%,89. 0%,88. 5%,87. 2%,85. 8%,82. 0%, 81. 2%,80. 1%,72. 6%，所以游离脂肪酶在使用9次后，酶活仍保持在80%以上。(c)熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例1的步骤C。实施例5(a)游离脂肪酶催化合成熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 72g(2mmol)麦芽糖加入到IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%吡啶和体积份数85%正己烷及体积份数5%水组成)中，反应以 0. IOg游离猪胰脂肪酶为催化剂，在温度45°C，摇床转速150r/min的条件下，反应96小时， 转化率达93% ；(b)游离脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 72g(2mmol)麦芽糖的IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%吡啶和体积份数85%正己烷及体积份数5%水组成)中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成熊果苷，在此条件下，游离脂肪酶转化 9 周期，熊果苷的转化率分别为93. 0%,92. 0%,89. 5%,87. 5%,85. 0%,84. 6%,82. 2%, 82. 2%,80. 6%，所以游离脂肪酶在使用9次后，酶活仍保持在80%以上。(c)熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例1的步骤C。实施例6(a)固定化脂肪酶催化合成熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖加入到IOml水中，反应以 0. 20g固定化猪胰脂肪酶为催化剂，在温度40°C，摇床转速150r/min的条件下，反应48小时，转化率达70% ；(b)固定化脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液用滤纸过滤即可把固定化脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖的IOml水中继续进行反应；如此重复循环，实现固定化脂肪酶多次催化合成熊果苷，在此条件下，固定化脂肪酶转化15 周期，熊果苷的转化率分别为70. 0%、69. 2%、68. 5%、66. 8%、65. 5%、63. 0%、61. 2%、 59. 5%,57. 6%,56. 0%,54. 8%,54. 5%,53. 0%,52. 1%,50. 5%、，所以固定化脂肪酶在使用15次后，酶活仍保持在50%以上。(c)熊果苷的分离纯化①将过滤后的滤液真空浓缩，真空浓缩真空度为0. IMpa，温度为45度；②把经过①步骤的浓缩液通过弱极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化；③把经过②步骤大孔吸附树脂柱的流出液真空干燥，即可得到纯度为96%的熊果苷粗品，真空干燥真空度为0. IMpa，温度为45度，干燥后的成品为白色粉末状；④把经过③步骤的熊果苷粗品溶于水后进行结晶，即得到纯度为99. 5%以上得熊果苷纯品，结晶温度为4度。实施例7(a)固定化脂肪酶催化合成熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 68g(2mmol)蔗糖加入到IOml含二甲基亚砜体积份数为10%的正己烷中，反应以0. 50g固定化猪胰脂肪酶为催化剂，在温度40°C，摇床转速150r/min的条件下，反应72小时，转化率达90% ；(b)固定化脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液用滤纸过滤即可把固定化脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 68g(2mmol)蔗糖的IOml含二甲基亚砜体积份数为 10%的正己烷中继续进行反应；如此重复循环，实现固定化脂肪酶多次催化合成熊果苷， 在此条件下，固定化脂肪酶转化40周期，熊果苷的转化率分别为90. 0%、89. 5%,89. 8%, 89. 2%,88. 5%,87. 0%,87. 2%,86. 5%,87. 6%,86. 0%,85. 8%,85. 5%,85. 0%,85. 3%, 85. 0%,85. 1%,84. 5%,84. 8%,84. 2%,84. 5%,83. 0%,83. 2%,82. 5%,83. 6%,82. 0%,80.8%,80. 5%,78. 0%,78. 5%,78. 0%,77. 8%,77. 5%,77. 7%,76. 3%,75. 5%,75. 8%,75.0 %、73. 7 %、72. 3 %、72. 0 %，所以固定化脂肪酶在使用40次后，酶活仍保持在70 %以上。(c)熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例6的步骤C。实施例8(a)固定化脂肪酶催化合成熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 72g(2mmol)麦芽糖加入到IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%二甲基亚砜和体积份数85%叔丁醇及体积份数5%水组成)中， 反应以1. Og固定化猪胰脂肪酶为催化剂，在温度45°C，摇床转速150r/min的条件下，反应 120小时，转化率达96. 5% ；(b)固定化脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液用滤纸过滤即可把固定化脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 72g(2mmol)麦芽糖的IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%二甲基亚砜和体积份数85%叔丁醇及体积份数5%水组成)中继续进行反应；如此重复循环，实现固定化脂肪酶多次催化合成熊果苷，在此条件下，固定化脂肪酶转化50周期，熊果苷的转化率分别为96. 5%、96. 5%、96. 2%、96. 0%、95. 5%、95. 0%、 95. 2%,95. 5%,94. 6%,94. 0%,94. 2%,94. 5%,94. 0%,93. 3%,93. 0%,93. 1%,92. 5%, 91. 8%,91. 2%,88. 5%,89. 0%,88. 2%,87. 5%,86. 6%,85. 0%,84. 8%,84. 5%,83. 2%,81.5%,81. 0%,81. 2%,79. 9%,79. 7%,78. 3%,78. 0%,77. 8%,77. 5%,76. 7%,76. 3%,
76.0%,75. 8%,75. 5%,74. 7%,74. 3%,74. 0%,74. 8%,73. 5%,73. 2%,72. 3%,71. 0%, 所以固定化脂肪酶在使用50次后，酶活仍保持在70%以上。(c)熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例6的步骤C。


本发明涉及利用游离或固定化猪胰脂肪酶(Porcine pancreatic lipase)催化合成熊果苷的制备方法，它包括反应体系的选择，固定化脂肪酶的制备，反应条件的优化和产物的提取等工艺步骤；将对苯二酚和糖按两者摩尔比在1∶1～1∶5的范围，加入到反应媒介中，反应以脂肪酶为催化剂。在20～60℃的条件下，反应10-120小时，熊果苷的转化率最高可达95％以上。脂肪酶的用量是糖质量的0.01-5倍。本发明首次通过游离脂肪酶或固定化脂肪酶催化合成熊果苷，具有反应条件温和、脂肪酶可多次重复利用，生产周期短，产物提取工艺简单等优点，大大降低了生产成本。