专利名称：冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其制备方法 甲肝疫苗是预防甲型肝炎的有效手段。目前国内外生产的甲肝疫苗(包括灭活疫苗和减毒活疫苗)都是液体剂型，其基本特点是在保存和运输过程中必须依赖于冷链系统以保证其质量。我国作为一个人口众多、经济不发达、地理环境复杂、交通不方便的发展中国家，液体剂型的甲肝减毒活疫苗在保存和运输过程中难于处于严格的冷链环境中，常因此而影响疫苗的质量。利用冷冻干燥技术将甲型肝炎减毒活疫苗制成冻干剂型，能够更有效地保障疫苗的热稳定性和免疫原性。但当采用现有技术对疫苗进行冷冻干燥时，由于甲型肝炎病毒对热较为敏感，在冻干过程中疫苗的活性损失很大，冻干后病毒滴度很低。因此，有必要研究新的技术方案，以提高冻干后甲型肝炎减毒活疫苗的滴度，并且保证它的热稳定性。
本发明的目的正是为解决现有技术存在的上述不足而提供了一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗产品。本发明的另一个目的在于提供一种制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方法，以便生产出具有良好稳定性和免疫原性的冻干甲型肝炎减毒活疫苗。本发明的第一个目的通过下列技术方案实现一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗，其特征在于按1∶0.7-1.2的体积比在甲型肝炎减毒活疫苗病毒液中加入冻干保护剂，冻干保护剂由下列成分组成海藻糖2～10％明胶 0.1～1％右旋糖苷 0.5～1.5％甘氨酸0.5～1.5％。本发明的第二个目的通过下列技术方案实现一种生产冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方法，其特征在于经过下列工艺步骤A、取人胚肺二倍体细胞KMB17的20～40代，用0.03～0.05％的胰蛋白酶+0.02～0.04％的乙二胺四乙酸，将单层细胞分散并悬浮于培养液中，在转速为8～12转/小时，温度为37±0.5℃条件下培养3～6天，使细胞长成致密单层；B、将长成致密单层的KMB17细胞弃营养液，消化后，用含2～5％血清的MEM培养基收集细胞，在该细胞中按病毒数与细胞数比例为1∶40-60的量加入甲型肝炎减毒活疫苗病毒毒种，在37℃温度，转速为20～120转/分钟的条件下搅拌0.5～2小时使病毒悬浮吸附，补加含5～10％血清的维持液至每个转瓶终体积为180ml，35±0.5℃恒温并继续旋转培养至14天，换新鲜的营养液，共培养26～28天；C、弃营养液，按1∶10～20的体积比加入细胞消化液，再按10μl/cm2的量加入0.1mmol/L、pH为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液收集细胞，2000～2500rpm离心15～20分钟，弃上清，按10μl/cm2的量加入0.1mmol/L、pH为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液，悬浮沉淀细胞，用1500w超声仪进行5～6分钟的超声处理，加入等量氯仿，振摇10～30分钟，3000rpm离心15分钟，吸取水相，蛋白相内加入等量6.6mmol/L、pH为7.6的磷酸盐缓冲液，振摇10～30分钟，3000rpm离心15分钟，吸取水相，如此重复3次；D、病毒液按1∶0.7-1.2的体积比加入冻干保护剂，保护剂的配方是2～10％海藻糖+0.1～1％明胶+0.5～1.5％右旋糖苷+及0.5～1.5％甘氨酸，在-40℃预冻2小时，升温至-30℃，200ubar抽真空8～16小时，升温至-25℃，100ubar抽真空6～10小时，升温至-20℃，100ubar抽真空6～10小时，升温至-10℃，100ubar抽真空2～6小时，升温至0℃，100ubar抽真空2～6小时，升温至10℃，20ubar抽真空2～6小时，升温至20℃，10ubar抽真空4～8小时，即得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。本发明与现有技术相比具有下列优点和效果1)冻干后疫苗的滴度不变；2)热稳定性好，在37℃放置7天液体疫苗感染性滴度平均下降0.8logCCID50/ml，而冻干疫苗则不变；3)冻干疫苗具有良好的安全性和免疫原性。本发明解决了下列技术难点由于甲肝病毒对热敏感，在冻干过程中疫苗的活性损失很大，冻干后病毒滴度很低。另经研究表明，甲型肝炎病毒在蔗糖基质中冻干后，病毒的活性大大下降。因此选择冻干保护剂，这对冻干冻干甲型肝炎减毒活疫苗起着至关重要的作用。又经研究表明，在干燥时海藻糖起着保护细胞与生物大分子的作用，例如，抗血清抗体在有海藻糖存在时，室温或37℃下空气干燥后在室温贮存几年生物活性仍不发生明显变化。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成，无毒无害，化学性质非常稳定，在体内可被酶水解成葡萄糖而被利用。所以，本专利的发明人将海藻糖应用于甲型肝炎减毒活疫苗的冷冻干燥，经过多年的潜心研究与实验，并付出了创造性的劳动，筛选到一组最佳的冻干保护剂，并将保护剂与甲型肝炎减毒活疫苗混合后进行冷冻干燥，获得的冻干疫苗感染性滴度(logCCID50/ml)与冻干前比较无显著差异(P＞0.05)，具有较好的稳定性，冻干后疫苗的残余水份含量＜3.0％，达到生物制品规程要求，经小白鼠安全性试验合格，经临床研究证实冻干甲型肝炎减毒活疫苗具有良好的临床安全性和免疫原性。其结果如下1、甲型肝炎减毒活疫苗冻干前、后感染性滴度变化见表1。
从表1看出经过6批试验，冻干前感染性滴度平均值为7.155logCCID50/ml，冻干后感染性滴度平均值为7.107logCCID50/ml，两组无显著差异(P＞0.05)。
经反复验证，冻干前、后两组感染性滴度平均值无显著差异(P＞0.05)。表明该保护剂组合对甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)耐受冻干具有优良的保护作用。
2、干甲型肝炎减毒活疫苗在不同温度下感染性滴度变化2.1冻干甲型肝炎减毒活疫苗在45℃下感染性滴度变化，见表2。
2.2冻干甲型肝炎减毒活疫苗在37℃下感染性滴度变化，见表3。
2.3冻干甲型肝炎减毒活疫苗在室温下稳定性，见表4。
2.4冻干甲型肝炎减毒活疫苗在2～8℃下稳定性研究，结果见表5。
从上表看出，冻干甲型肝炎减毒活疫苗在2～8℃下24个月内其感染性滴度无显著变化(P＞0.05)，说明其在2～8℃下具有较好的稳定性。而液体疫苗在6个月内无显著变化，但6个月后其感染性滴度则逐渐下降。到18个月时其感染性滴度平均下降3.5～4.0logCCID50/ml。
结果表明冻干甲型肝炎减毒活疫苗分别在45℃下1天、37℃下6天、室温下28天感染性滴度维持不变，而液体剂型的甲肝减毒活疫苗在同等条件下感染性滴度明显下降，说明其具有良好的热稳定性。冻干甲型肝炎减毒活疫苗在2～8℃下24个月内其感染性滴度无显著变化。说明其在2～8℃下保存2年内稳定，其感染性滴度无显著变化。此外，在45℃下、37℃下及室温下冻干甲型肝炎减毒活疫苗的稳定性明显优于液体疫苗。
3、冻干甲型肝炎减毒活疫苗安全性研究共3批冻干甲型肝炎减毒活疫苗，每批成品用注射水溶解后混合均匀，每一批用5只17～20g小白鼠，每只腹腔注射0.5ml进行安全试验，每日观察，共观察7天。结果见表6。
从表6可以看出，3批冻干甲型肝炎减毒活疫苗安全试验合格，证明H2株冻干甲型肝炎减毒活疫苗具有很好的安全性。
4、冻干甲型肝炎减毒活疫苗冻干保护剂急性毒理反应研究6批冻干保护剂分别用于6批冻干疫苗的制备。冻干保护剂，系无色透明液体，人用剂量为1ml/次。通过皮下注射，肌肉注射和静脉注射三种给药途径，观察冻干保护剂的急性毒性反应。试验动物采用7周龄健康昆明种小鼠，每组20只。各组动物禁食不禁水12小时后，第一、二组以20ml/kg剂量在24小时内分别皮下注射和肌肉注射冻干保护剂3次，每次间隔8小时；第三组动物以20ml/kg剂量经尾静脉注射给受试物一次。结果见表7。
各组动物给药后，其外观、行为活动、精神状态、食欲、大小便、被毛、肤色及呼吸等均无明显毒性反应。观察7天，无一动物死亡。处死解剖小鼠，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾脏内脏组织，也未见明显异常。
试验结果表明(1)小鼠一日内以20ml/kg的剂量3次皮下注射和肌肉注射冻干保护剂，无明显毒性反应发生。小鼠一日内皮下注射和肌肉注射冻干保护剂的最大耐受量为60ml/kg，此剂量相当于人用量的3000倍。(2)小鼠一次静脉注射冻干保护剂的最大耐受量为20ml/kg。所选用的冻干保护剂是根据《中华人民共和国药典》，并经急性毒理反应研究证明无毒副作用。
5、冻干甲型肝炎减毒活疫苗的检定按《冻干剂型的甲肝减毒活疫苗制造与检定规程》进行检定，各项指标均合格。
(1)物理检查为乳白色疏松体，溶解后为无色透明、澄清无异物液体。
(2)残余水份含量冻干疫苗残余水份含量≤3％。
(3)病毒滴定及稳定性试验每批冻干疫苗，取3～5支样品混合进行病毒滴定，再取3～5支放37℃7天，与前者同时进行病毒滴定，方法同前。37℃放置7天后滴度下降不超过1个logCCID50/ml。疫苗滴度不低于6.5logCCID50/ml。
(4)安全试验用14～16g小白鼠4只，每只腹腔注射1ml，注射后密切观察，30分钟内无异常反应，观察3天均健存。
(5)残余牛血清蛋白含量测定用检定所认可的方法测定，残余牛血清白蛋白含量≤50ng/ml。
6、冻干甲型肝炎减毒活疫苗的临床研究由中国药品生物制品检定所作为临床研究负责单位，与广西壮族自治区疾病预防控制中心和中国医学科学院医学生物学研究所共同对中国医学科学院医学生物学研究所生产的冻干甲型肝炎减毒活疫苗进行临床研究。经广西疾病预防控制中心伦理审查委员会审查批准后，该项目于2003年12月～2004年4月在广西壮族自治区天等县进行。
研究对象为广西天等县的5所中小学校共2421名6～16岁学生进行筛选后，初选出无甲肝疫苗接种史，无疫苗接种禁忌症，抗-HAVIgG阴性，ALT正常范围，无肝炎病史、症状和体征的1300人作为研究对象。所用的冻干甲型肝炎减毒活疫苗滴度为6.67LogCCID50/1.0ml，液体甲型肝炎减毒活疫苗滴度为6.67LogCCID50/1.0ml，两疫苗均由中国医学科学院医学生物学研究所生产、提供。批号分别为20030901和20030806，效期分别为2005年9月和2004年8月。临床观察分组、性别组成、年龄分布、接种疫苗后的反应以及抗体应答见表8-表16。
6.1临床安全性此次临床研究冻干疫苗和液体疫苗的局部反应率仅为1.34％和1.79％，且反应症状轻微；体温异常(发热)反应率分别为2.15％和4.29％，两种疫苗间体温异常反应率差异无显著性(x2＝0.2648，P＞0.05)。除接种液体疫苗组发生2例体温超过38.5℃强反应外，其余以弱反应为主，并且所有异常反应持续时间均未超过24小时。冻干甲型肝炎减毒活疫苗和液体甲肝减毒活疫苗均具有良好安全性。
6.2免疫原性免疫后1、2个月血清抗体检测结果，冻干苗组阳转率为99.7％和100％，液体苗组抗体阳转率为74.8％和87.0％。冻干苗组免后抗体阳性率高于液体苗组(X21月＝103.1，P1月＜0.01；X22月＝49.43，P2月＜0.01)。抗体滴度比较，冻干甲肝苗组1、2月血清抗体GMT为1249和893，液体苗组为1026和589，两组相比无显著统计学意义(t1月＝0.3374，P1月＞0.05；t2月＝0.0424，P2月＞0.05)。中国医学科学院医学生物学研究所生产的冻干甲型肝炎减毒活疫苗具有良好的免疫原性。从以上可以看出，冻干甲型肝炎减毒活疫苗具有良好的安全性和免疫原性。

下面结合实施对本发明做进一步描述，但本发明之内容并不局限于此。
实施例1按1∶0.7的体积比在甲型肝炎减毒活疫苗病毒液中加入冻干保护剂，冻干保护剂由下列成分组成海藻糖2％明胶 0.1％右旋糖苷 1.5％甘氨酸1.5％经过下列方法A、取人胚肺二倍体细胞KMB17的30代，用0.03％的胰蛋白酶+0.04％的乙二胺四乙酸，将单层细胞分散并悬浮于培养液中，在转速为8转/小时，温度为37±0.5℃条件下培养6天，使细胞长成致密单层；B、将长成致密单层的KMB17细胞弃营养液，消化后，用含2％血清的MEM培养基收集细胞，在该细胞中按病毒数与细胞数比例为1∶40的量加入甲型肝炎减毒活疫苗病毒毒种，在37±0.5℃温度，转速为20转/分钟的条件下搅拌0.5～2小时使病毒悬浮吸附，补加含5～10％血清的维持液至每个转瓶终体积为180ml，35℃恒温并继续旋转培养至14天，换新鲜的营养液，共培养26天；C、弃营养液，按1∶10的体积比加入细胞消化液，按10μl/cm2的量加入0.1mmol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液收集细胞，2000rpm离心20分钟，弃上清，按10μl/cm2的量加入0.1mmol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲液，悬浮沉淀细胞，用1500w超声仪进行5分钟的超声处理，加入等量氯仿，振摇10分钟，3000rpm离心15分钟，吸取水相，蛋白相内加入等量6.6mmol/L、pH为7.6的磷酸盐缓冲液，振摇10分钟，3000rpm离心15分钟，吸取水相，如此重复3次；D、在病毒液按上述体积比加入上述配比的冻干保护剂，在-40℃预冻2小时，升温至-30℃，200ubar抽真空8小时，升温至-25℃，100ubar抽真空6小时，升温至-20℃，100ubar抽真空6小时，升温至-10℃，100ubar抽真空2小时，升温至0℃，100ubar抽真空2小时，升温至10℃，20ubar抽真空2小时，升温至20℃，10ubar抽真空4小时，即得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。
实施例2按1∶1.2的体积比在甲型肝炎减毒活疫苗病毒液中加入冻干保护剂，冻干保护剂由下列成分组成海藻糖10％明胶 1％右旋糖苷 0.5％甘氨酸0.5％经过下列方法经过下列工艺步骤A、取人胚肺二倍体细胞KMB17的40代，用0.05％的胰蛋白酶+0.02％的乙二胺四乙酸，将单层细胞分散并悬浮于培养液中，在转速为12转/小时，温度为37±0.5℃条件下培养3天，使细胞长成致密单层；B、将长成致密单层的KMB17细胞弃营养液，消化后，用含5％血清的MEM培养基收集细胞，在该细胞中按病毒数与细胞数比例为1∶60的量加入甲型肝炎减毒活疫苗病毒毒种，在37±0.5℃温度，转速为120转/分钟的条件下搅拌0.5～2小时使病毒悬浮吸附，补加含2％血清的维持液至每个转瓶终体积为180ml，35±0.5℃恒温并继续旋转培养至14天，换新鲜的营养液，共培养28天；C、弃营养液，按1∶20的体积比加入细胞消化液，按10μl/cm2的量加入0.1mmol/L、pH为7.0～7.2的磷酸盐缓冲液收集细胞，2500rpm离心15分钟，弃上清，按10μl/cm2的量加入0.1mmol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲液，悬浮沉淀细胞，用1500w超声仪进行5分钟的超声处理，加入等量氯仿，振摇30分钟，3000rpm离心15分钟，吸取水相，蛋白相内加入等量6.6mmol/L、pH为7.6的磷酸盐缓冲液，振摇30分钟，3000rpm离心15分钟，吸取水相，如此重复3次；D、在病毒液中按上述体积比加入上述配比的冻干保护剂，在-40℃预冻2小时，升温至-30℃，200ubar抽真空16小时，升温至-25℃，100ubar抽真空10小时，升温至-20℃，100ubar抽真空10小时，升温至-10℃，100ubar抽真空6小时，升温至0℃，100ubar抽真空6小时，升温至10℃，20ubar抽真空6小时，升温至20℃，10ubar抽真空8小时，即得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。
实施例3按1∶1的体积比在甲型肝炎减毒活疫苗病毒液中加入冻干保护剂，冻干保护剂由下列成分组成海藻糖5％明胶 0.6％右旋糖苷 1％甘氨酸0.8％经过与实施例1相同的方法制得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。
表1甲型肝炎减毒活疫苗冻干前、后感染性滴度变化

表2冻干与液体剂型的甲肝减毒活疫苗在45℃下感染性滴度变化

表3冻干与液体剂型甲肝减毒活疫苗在37℃下感染性滴度变化

表4冻干与液体甲型肝炎减毒活疫苗在室温下感染性滴度变化

表5冻干与液体甲型肝炎减毒活疫苗2～8℃下感染性滴度变化，单位logCCID50/ml

表6不同批次冻干疫苗接种小白鼠反应观察

表7 6批冻干保护剂急性毒理反应结果

表8临床观察分组

表9分组性别组成

表10疫苗接种者的年龄分布

表11接种后局部反应观察

表12接种后体温观察

表13接种后全身弱、中、强反应率

表14接种后ALT测定结果

表15免疫后不同时间的抗HAV阳转率

表16免疫后不同时间的抗HAV水平



本发明涉及一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其制备方法，按1∶0.7－1.2的体积比在甲型肝炎减毒活疫苗病毒液中加入冻干保护剂，冻干保护剂由下列成分组成海藻糖2～10％，明胶0.1～1％，右旋糖苷0.5～1.5％，甘氨酸0.5～1.5％，经过冻干工艺制得。本发明提供的冻干甲型肝炎减毒活疫苗与现有的液体疫苗相比，其感染性滴度无显著变化，但其热稳定性显著提高，并且经临床实验证实具有良好的安全性与免疫原性。冻干甲型肝炎减毒活疫苗的有效期可延长至18个月，而液体剂型只为6个月，具有重大经济效益和应用价值。