专利名称：一种抗真菌肽、其制备方法及用途的制作方法抗菌肽是一类广泛存在于整个生物界中的双亲性小分子碱性多肽，广泛存在于生物体内，包括细菌、真菌、植物、昆虫、鱼类、鸟类、甲壳动物、两栖动物和哺乳动物等，已有超过750种之多，其中绝大部分为阳离子抗菌肽，也有少量阴离子抗菌肽。由于抗菌肽表现出广谱抗微生物活性，并对细菌毒素有中和作用，其作用机制独特，不易产生耐药性，而且某些抗菌肽又只对原核生物和突变细胞起作用，对真核生物无害。因而在许多致病菌产生了明显耐药性的情况下，抗菌肽的发现和深入研究为开发全新的抗菌药物提供了可能。抗菌肽是机体先天免疫的关键因子。抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有毒副作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。抗菌肽是由一个编码多肽的庞大的基因家族，原核生物、真核生物甚至人类都可以产生。目前，科学家已经获得了几百种天然和人工合成的抗菌肽，但是这些抗菌肽不论在大小、成分组成、电荷和二级结构上都存在很大差异。此外，抗菌肽有五种结构类型线形结构，往往是螺旋结构；富含半胱氨酸残基；形成β -片层结构的多肽；富含脯氨酸的多肽; 含有稀有或修饰氨基酸的多肽。这些特征对于识别微生物的靶结构是很重要的。关于抗真菌的蛋白和多肽，虽然近几年取得了很大进展。真菌细胞膜已经被证实作为防御素样多肽和植物防御素的理想靶位。但是，真菌细胞存在一些内部多肽和外部多肽，而抗菌肽与其外部多肽作用后通过调节细胞间信号级联诱导真菌细胞死亡是完全可能的。
本发明基于对尖膀胱螺天然多肽的化学结构的分析，化学修饰和合成其有效结构，制备出一种新型的抗真菌肽，以期作为传统抗生素的替代物，来增强抗菌肽的多方面优势。因此，本发明的目的在于，提供一种新型的抗真菌肽。本发明的另一个目的在于，提供上述抗真菌肽的制备方法及用途。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种抗真菌肽， 所述抗真菌肽为具有SEQ. ID. NO. 2所示氨基酸序列的肽、其生物活性功能片段、变体或衍生物。优选地，所述抗真菌肽的有效抗真菌的浓度为不低于I. 3μ M ;优选地所述浓度为I.3_33 u Mo优选地，所述真菌选自尖孢镰刀菌、粗糙链孢菌和水霉菌。另一方面，本发明还提供了所述抗真菌肽的制备方法，所述抗真菌肽可以通过生物或化学方法制备。本发明还提供了上述抗真菌肽在制备抗真菌的药物中的用途。优选地，所述真菌选自尖孢镰刀菌、粗糙链孢菌和水霉菌。此外，本发明还提供了一种抗真菌制剂，其包含有效抗真菌量的上述抗真菌肽。优选地，所述抗真菌肽的浓度为不低于I. 3 μ M ;优选地所述浓度为I. 3-33 μ M0在一个优选的实施方案中，本发明提供的抗真菌肽的设计和合成方法包括以下步骤I)从野外捕捉的野生尖膀胱螺于实验室饲养，温度保持在15°C，盐度保持在 35%0。2)每只尖膀胱螺采集O. 5ml的血液，并加入等体积的抗凝缓冲液混匀。3)血液样品的处理。4)按照常规的固相萃取和HPLC(高效液相色谱)方法提取和纯化蛋白。5)用反相HPLC进一步纯化蛋白。6)对上述纯化的蛋白进行真空冷冻干燥，获得尖膀胱螺血细胞抗菌肽。7)用SDS-PAGE方法测定抗菌肽的分子量，用Edman测序法分析氨基酸的组成。8)用微球菌，表皮葡萄球菌，大肠杆菌，嗜水气单胞菌，副溶血性弧菌和霍乱弧菌进行抗细菌活性测定。9)用尖孢镰刀菌，粗糙链孢菌和水霉进行抗真菌活性的测定。10)采用CHSE-214细胞测定抗菌肽细胞毒性。11)新抗菌肽Apn的设计为了提高抗菌肽的疏水性(从25%提高到38% )和阳离子表面活性(从+1提高到+5)，从N-末端开始删除10个亲水性氨基酸T-1，Y-2，Y-10， N-13，S-15，Y-16，Q-19，N-23，Q-31 和 Υ-44。同时删除 5 个带负电荷的氨基酸Ε_6，Ε-7， E-9，D-18和D-37。将形成的两性分子多肽命名为Αρη，其是一个不同于AP的多肽，疏水性从25%提高到38%，阳离子表面活性从+1提高到+5。12)用标准的化学合成法合成并纯化多肽Ap和Αρη。13)采用圆二色(⑶)的光谱法对多肽Ap和Apn进行分析，采用ClustalW生物软件进行同源性分析，分析标准同源性高于30%。14)用生物信息学软件PSIPRED和SOPMA对多肽Ap和Apn进行二级结构预测。综上所述，本发明提供了一种基于尖膀胱螺的血细胞抗菌肽一级结构而设计的具有抗真菌活性的抗真菌肽，该抗真菌肽的设计方法包括以下几个步骤首先从尖膀胱螺的血细胞中分离和纯化得到一个天然多肽，从其一级结构可见，这个多肽含有47个氨基酸残基，将其命名为AP ;其次，通过人工合成得到一个分子量为5100. 78Da的多肽；这个多肽含有25%的疏水氨基酸，并带有I个净正电荷，该多肽与已知的活性抗菌肽具有部分同源性， 基于这个序列信息，设计和构建了一个具有30个氨基酸残基的新多肽并命名为Αρη，它带有5个净正电荷，分子量为3028Da，具有38%的疏水分子，其具有较强的疏水性和阳离子表面活性；Apn的二级结构是采用圆二色法测定的，因此N-末端有一个疏水性表位，C-末端有一个亲水性表位，形成了一个两性分子。通过实验证明，Apn多肽比AP多肽更具活性，而且达到100μM时仍然对CHSE-214细胞为细胞毒作用。可见，对天然多肽的化学修饰和有效结构的化学合成也可以获得更具活性抗菌肽，同时还克服了天然多肽规模化生产和应用时的低比活度等缺陷。本发明提供的抗真菌肽具有较为广泛的抗真菌谱，并且对细胞毒性低，可采用生物或化学方法制备，克服了天然多肽规模化生产和应用时的低比活度等缺陷，可应用于水产养殖业，尤其用于控制水霉菌，可以有效地保护鱼类生长的各个阶段。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图I为实施例I中馏分的多肽谱系图，其中，图上的蛋白质电泳图中左侧为标准蛋白质分子量，右侧为具有抗真菌活性的馏分。图2为实施例4中抗菌肽的同源性分析图。图3为实施例4中圆二色谱法对多肽的分析结果。图4为实施例4中得到的抗菌肽二级结构模型，其中，左图为抗菌肽Ap，右侧为抗菌肽Αρη ο



本发明提供一种抗真菌肽、其制备方法及用途。本发明提供的抗真菌肽为具有SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列的肽、其生物活性功能片段、变体或衍生物。本发明提供的抗真菌肽具有较为广泛的抗真菌谱，并且对细胞毒性低，可采用生物或化学方法制备，克服了天然多肽规模化生产和应用时的低比活度等缺陷，可应用于水产养殖业，尤其用于控制水霉菌，可以有效地保护鱼类生长的各个阶段。