专利名称：一种中药冻干注射剂定性的测定方法中药冻干注射剂在质量标准上，要求控制的项目比较多，其中，指纹图谱的定性是 一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评 价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其 显著特点。目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱 法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、 红外光谱法(IR)、质谱法(MQ、核磁共振法(NMR)和X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方 法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有 分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点；中药成分绝大多数 可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已 成为中药指纹图谱技术的首选方法。CN1785223A公开了一种治疗肌肉萎缩及重症肌无力的药物及其制备方法，该专利 公开了该药物的组方、制剂以及胶囊、片剂等制备方法；该专利还公开了该药物的药效学实 验，证实该药物具有增强正常运动神经元活力，促进神经突起生长，又能保护兴奋性氨基酸 毒性损伤运动神经元，减少细胞凋亡，在维持中枢神经系统功能，延缓病情发展，提高患者 生存质量方面具有重要的临床应用价值；该专利还公开了其中人参提取物的制备方法，“取 人参药材，用60-90%乙醇提取1-3次，第1次加药材8-12倍量溶剂提取1_2小时，第2次 加6-10倍量溶剂提取1-2小时，第3次加6-10倍量溶剂提取0. 5-1小时；合并上述提取液， 趁热滤过，减压回收乙醇，并浓缩，放入不锈钢桶内，加纯水搅拌均勻，冷藏将冷藏 液取出，放至常温，板框过滤器过滤，用少量水洗涤板框，滤液加纯水稀释，备用；取人参浓 缩药液通过处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，并分别用pH值8-9的氨水、20%乙醇、80% 乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液。将80%洗脱液加入纯水，配成50%醇溶液，通过中性氧 化铝柱，收集洗脱液，再用少量50 %乙醇洗涤柱子，合并洗脱液备用；取药液加入活性炭， 回流加热，煮沸20min，趁热板框抽滤，收集滤液，浓缩，冷藏过夜；澄清板过滤，减压干燥， 即得人参提取物。”该人参提取物即为人参总皂苷提取物；该专利还公开了淫羊藿提取物的 提取方法，“取淫羊藿药材，加水煎煮提取2-5次，加水量为10-30倍，第一次提取时间定为 0. 5-2h，以后3次为0. 5-lh ；合并上述提取液，趁热滤过，减压浓缩，放入不锈钢桶内，加乙 醇至药液含醇浓度为70%，冷藏；过滤，滤液回收乙醇并浓缩，加水搅拌均勻，冷藏，过滤， 备用；取淫羊藿药液通过处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，并分别用纯水、20%乙醇、50% 乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液；洗脱液拌入适量硅藻土混勻，用无水乙醇提取2-5次，提 取液合并，回收乙醇并浓缩，浓缩液加入丙酮，并搅拌均勻，冷藏，过滤，沉淀加丙酮再同前 处理2次，合并3次滤液，回收溶剂，并浓缩，减压干燥，即得淫羊藿提取物。”该淫羊藿提取 物即为淫羊藿总黄酮提取物。该专利未公开冻干注射剂制备及其质量控制的测定方法。由CN1785223A公开的技术内容，可以看出，该中药组合物包括的原料包含淫羊藿 总黄酮提取物和人参总皂苷提取物。本专利申请即是在CN1785223A的基础上做了进一步的研发，在研制该中药组合 物的冻干注射剂的基础上，制定了该中药冻干注射剂定性的鉴别的测定方法。
本发明的目的是提供一种中药冻干注射剂定性的测定方法。本发明所述中药冻干注射剂是由如下重量份比例的原料制成人参总皂苷提取物30-70淫羊藿总黄酮提取物20-60。本发明采用高效液相色谱法，测定本发明所述中药冻干注射剂的指纹图谱，用于 本发明所述中药冻干注射剂的定性表征。本发明建立了所述中药冻干注射剂的指纹图谱测 定方法，建立该中药指纹图谱将能较为全面地反映本发明所述中药冻干注射剂中所含化学 成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，以确保其安全有效。本发明测定方法中，液相色谱条件优选如下液相色谱条件色谱柱为C18柱；流动相A为水，B为乙腈；流速为lmL/min ；梯度 如下0-23分钟，A为80%,23-40分钟，A由80%勻速降至65%,40-51分钟，A由65%勻速 降至20%、51-62分钟，A由20%勻速降至0%、62_68分钟，A为0%、68_75分钟，A由0% 勻速升至80%、75-85分钟，A为80% ；检测器蒸发光检测器，气体压力为25psi，漂移管温 度为75°C，加热级别66% ；供试品溶液的制备精密称取本发明中药冻干注射剂内容物0.50g，50%乙腈充分 溶解，定容到25ml量瓶中，即得；测定法分别精密吸取供试品溶液10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明所述测定方法中色谱条件中柱温优选为25V ；流动相流速优选为ImL/ min ；色谱柱优选为ES-C18柱。本发明检测方法所检测的本发明所述中药冻干注射剂的原料重量比例优选为人参总皂苷提取物35淫羊藿总黄酮提取物55。还优选为人参总皂苷提取物65淫羊藿总黄酮提取物25。或者人参总皂苷提取物50淫羊藿总黄酮提取物40。为证实本发明方法可行性，发明人进行了如下的验证试验1、样品制备人参总皂苷提取物50克淫羊藿总黄酮提取物40克制备方法a、将800克羟丙基-β -环糊精加水4000ml溶解制成20%的溶液，将淫羊藿总黄 酮提取物加水750ml (5. 33% )加热溶解，分次缓慢加入羟丙基- β _环糊精溶液中，保温 800C 士 1°C，动态搅拌包合，包合时间3小时，将人参总皂苷提取物加水IOOml (50% )加热 溶解，加入包合液中，继续包合1小时；b、加水调节溶液总量至6000ml，用10 %的氢氧化钠溶液调节PH到7. 5，加入活性炭M克(即含活性炭0. 4% )，煮沸10分钟，趁热用澄清板框过滤，滤除活性炭，再用 0.22 um微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml ；c、105°C热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0. 22 μ m微孔滤膜过滤，分装至15ml 西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-40°C预冻3小时；d、按照预冻条件，在真空度为0. 05Pa状态下，从_40°C至0°C升温升华28小时，再 从0°C至30°C升温干燥4. 5小时；e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。2、方法学验证2. 1仪器与试药Waterd695-2420型高效液相色谱仪(包括四元泵、在线脱气机、 蒸发光检测器、柱温箱、100 μ 1进样阀、化学工作站等，waters公司)。人参皂苷Rgl、Re、Rbl、Rc、Rb2和Rd对照品；朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C和淫羊 藿苷对照品；乙腈(色谱纯)；水(超纯水)；其余试剂均为分析纯。2. 2色谱条件选择2. 2. 1流动相的选择试验过程中，考察了多种流动相比例和组成，最终确定表1中 的流动相条件，结果表明该条件的色谱峰分离效果好、保留时间适中。本发明提供了一种中药组合物冻干注射剂中多种组分含量的测定方法，本发明中药冻干注射剂原料包括人参和淫羊藿，临床用于运动神经元疾病(肌萎缩侧索硬化症、进行性脊肌萎缩症、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化症)、进行性肌营养不良症、先天性肌病等疾病所致的肌肉萎缩及重症肌无力的治疗，本发明方法采用高效液相色谱法进行指纹图谱测定，用于产品定性质量控制。