专利名称：一种厌氧发酵丙酮丁醇梭菌产丁醇的方法受世界石油资源、价格、环保和全球气候变化的影响，发展生物燃料已成为许多国家提高能源安全、减排温室气体、应对气候变化的重要措施。生物燃料是指通过生物资源生产的适用于汽油或柴油发动机的燃料，包括燃料乙醇、生物柴油、生物丁醇、生物气体、生物甲醇、生物二甲醚等，目前市场上以燃料乙醇和生物柴油最为常见。生物丁醇与乙醇相似，可以和汽油混合，但却具有许多优于乙醇之处，因此，生物丁醇的研究开发日益受到许多国家的重视。丁醇，又称正丁醇，是重要的有机化工原料，可用作油漆和表面涂料，也用于生产邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)等增塑剂，还用来制造醋酸丁酯、 甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸丁酯、正丁胺、氨基树脂、乙二醇醚，并可用于表面涂料、皮革处理、 香料、橡胶加工助剂和农用化学品等方面。随着我国化学工业和医药工业的不断发展，丁醇将有一定增长[柴国梁.国内丁醇市场分析.上海化工，2006，31 O): 49 52]。从丁醇的消费市场看，丙烯酸丁酯和醋酸丁酯需求的强劲增长将是推动丁醇消费增长的主要动力。作为燃料，丁醇有能量密度大、对水的稳定性高、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。丁醇与乙醇相似， 都是醇类燃料，但是丁醇和乙醇相比具有以下优势[沈佩芝，任诚.丁醇、辛醇生产技术与市场需求预测·化工进展，2005，24(2) :216 220]。(1) 丁醇具有较高的能量密度，和汽油相近，而乙醇的能量密度比汽油低35%。由于丁醇有较高的能量含量，可更方便地与汽油调和，同时可调入更高浓度，无需改造汽车。(2)因其类似烃类的结构，丁醇对水的溶解性比乙醇小得多，并且可在炼油厂调和并用管道运送，不像乙醇，必须在分销终端进行调和。(3)汽油中的主要组成是C6 C8，因此丁醇比乙醇更类似于“油”，它与燃料添加剂和润滑油配伍性更好。(4)生物丁醇可利用炼油厂原有基础设施，而乙醇不行。丁醇的化学结构使其与乙醇相比有几方面的优点，包括低蒸汽压和在汽油调和物中耐水污染，使其有利于在现有的分配管网中使用；而乙醇易吸引水分子，并有腐蚀管线的倾向，在它用于与汽油调和时，必须使用汽车槽车等运输工具，以相对较小的数量运送[DUrre P. New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation. Appl Microbiol Biotechnol. 1998，49:639 648]。丙酮丁醇梭菌的代谢途径开始是从葡萄糖经丙酮酸到大量乙酸、丁酸积累，然后从乙酸和丁酸形成丙酮、丁醇和乙醇。此过程是一个厌氧、发酵的过程，且可分为三个时期， 即前发酵期、主发酵期和后发酵期。在前发酵期，PH值下降，丙丁菌细胞数目激烈增加，溶剂产生很少，主要发酵产物是乙酸、丁酸、H2和C02等；在主发酵期，丁酸和乙酸被还原，pH值上升，其减酸速率与前发酵期的升酸速率相似，其中丁酸的减少比乙酸多，转变成丙酮、丁醇等溶剂，在这个时期，发酵现象最旺盛，菌体活力最强，菌体数量最多；在后发酵期，由于减酸达到最低点，有时会继续产酸，最终PH值维持在一定水平直至发酵结束[陈駒声.发酵法丙酮和丁醇生产技术.北京化学工业出版社，1991]。丙酮丁醇梭菌的发酵时间多数维持在48 72小时之间。
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用PH胁迫调控厌氧发酵丙酮丁醇梭菌生产丁醇的方法，以缩短发酵时间，提高产量和生产强度。为了解决上述问题，本发明提供了一种厌氧发酵丙酮丁醇梭菌产丁醇的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵生产丁醇三步骤，其特征在厌氧发酵步骤中，监测发酵体系的OD值，当OD值小于2时，控制发酵体系的PH值为5. 5 ；当OD值大于等于2时，控制发酵体系PH值为4. 7 4.9。本发明所述的厌氧发酵生产丁醇的步骤中，pH值的控制方法是在发酵体系中放入PH电极测定发酵体系的pH值，通过添加NaOH溶液或HCl溶液控制pH值。其中，所述的NaOH溶液或HCl溶液的浓度为2 mol/L。其中，本发明所述的丙酮丁醇梭菌是CZo1SiriiZi腫acetobutylicum XY16 (CCTCC NO :M 2010011)，丙酮丁醇梭菌 C/osirii/i腫 acetobutylicum ASl. 134 (CGMCC 1. 134)，或者丙酮丁醇梭菌 ^Zo1SiriiZi腫 acetobutylicum ASl. 135 (CGMCC 1. 135)。本发明所述的菌种活化步骤是常规的丙酮丁醇梭菌所采用的菌种活化方法。在本发明中，是将菌种由冻存的甘油管中接入50 mL血清瓶的pH为6. O 7. O的含有淀粉的能提供碳源、氮源以及无机盐的常规液体培养基中，通入队或CO2,在恒温培养箱中培养，温度为30 40°C，活化培养12 M h，用于种子培养基接种和菌种保存。本发明所述的种子培养步骤是常规的丙酮丁醇梭菌所采用的种子培养方法。在本发明中，种子培养的培养基为PH 6. O 7. O的含有糖类的能提供碳源、氮源以及无机盐的常规液体培养基，培养时将500 mL血清瓶中加入种子培养基100 400 mL,通入N2或CO2, 115 121°C灭菌15 30 min，冷却后接入活化的种子液，培养温度为30 40°C，在恒温培养箱中培养，培养时间为8 16 h，用于发酵罐接种。本发明所述的厌氧发酵生产丁醇的步骤中，发酵培养的培养基为pH 6. 0 7. 0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基，5 L发酵罐中发酵培养基的体积为2 4 L ；且厌氧发酵的操作和发酵条件也是常规的利用丙酮丁醇梭菌厌氧发酵产丁醇的方法，在本发明中，接种量为体积比5% 10%，温度为35 40°C，发酵罐通入队或C02， 以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在100 200 rpm，发酵时间为48 72 h。本发明的有益效果在于本发明通过PH电极检测发酵过程的pH值变化，加入浓NaOH和浓HC1，将体系的pH控制在最适值，达到丙酮丁醇的高效率生产，提高了丁醇以及总溶剂的生产强度，缩短了发酵时间；本发明采用PH电极测定丁醇发酵体系的pH值，并利用浓NaOH和浓HCl控制发酵体系的PH值，对于缩短发酵时间，提高分批和连续发酵的生产强度都具有重要的理论意义和应用价值。 菌种丙酮丁醇梭菌 CZo1SiriiZi腫 acetobutylicum XY16 (CCTCC NO :M 2010011)。种子培养基种子培养基酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，乙酸铵 2 g/L, NaCl 2 g/L, MgSO4 3 g/L, KH2PO4 1 g/L, K2HPO4 1 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 1 g/L, pH 6. 0。发酵培养基(P2)碳源(葡萄糖60 g/L 分消)，K2HPO4 0. 5 g/L, KH2PO4 0. 5 g/L, CH3COONH4 2.2 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.2 g/L, MnSO4 ·Η20 0. 01 g/L, NaCl 0. 01 g/L，FeSO4 ·7Η20 0.01 g/L;玉米浆 1 g/L。5 L发酵罐培养时培养基装液量为3 L。将冻存的甘油管中的菌种接入50 mL血清瓶中30 mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37°C，活化培养。培养12 h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300 mL种子培养基的500 mL血清瓶中，扩大培养，12 h后用于上述发酵培养基接种(5 L发酵罐)，接种量为10% (ν/ v)，搅拌转速在120 rpm，37°C发酵培养。接种后通入N2，通气量为0. 25 vvm, 10 min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将NaOH和HCl都配成2 mol/L的溶液，通过校准的PH电极测定发酵体系的pH值，控制发酵体系的pH值分别为4. 3,4. 5,4. 7,4. 9,5. 2、 5. 5、6. 0，当pH低于设定值时，采用2 mol/L的NaOH升高pH值，当pH高于设定值时，采用 2 mol/L的HCl降低pH值，并与不控制pH值的发酵结果对比，发酵至总溶剂产量不再变化。 结果如表1。 表1不同pH下发酵结果对比菌体生长速率(h—1)丁醇(g/L)总溶剂(g/L)发酵结束时间(h)丁醇生产速率(g · L"1 · h"1)对照组0. 23111. 418. 1480. 284pH6. 00. 3492. 63. 1280. 093pH5. 50. 57. 311. 7440. 162pH5. 20. 35910. 415. 1400. 237pH4. 90. 27811. 519. 2360. 320pH4. 70. 27511. 519. 6440. 295pH4. 50. 2511. 418. 8400. 283pH4. 30. 16110. 415. 1400. 149由表1中的实验结果可看出，在不同的PH下，丁醇发酵的结果不一致，主要特点为， 在较高的pH (5. 2 6. 0)下，菌体生长快，发酵时间短，但丁醇产量不高；而在较低的pH (4. 3 4. 9)下，菌体生长慢，发酵时间延长，但丁醇产量高。这为pH胁迫调控提供了理论依据。实施例2
菌种丙酮丁醇梭菌 CZo1SiriiZi腫 acetobutylicum XY16 (CCTCC NO :M 2010011)。种子培养基种子培养基酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，乙酸铵 2 g/L, NaCl 2 g/L, MgSO4 3 g/L, KH2PO4 1 g/L, K2HPO4 1 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 1 g/L, pH6. 0。发酵培养基(P2)碳源(葡萄糖60g/L 分消)，K2HPO4 0. 5 g/L，KH2PO4 0. 5 g/L， CH3COONH4 2.2 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.2 g/L, MnSO4 ·Η20 0. 01 g/L, NaCl 0. 01 g/L，FeSO4 ·7Η20 0.01 g/L;玉米浆 1 g/L。5 L发酵罐培养时培养基装液量为3 L。将冻存的甘油管中的菌种接入50 mL血清瓶中30 mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为37°C，活化培养。培养12 h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300 mL种子培养基的500 mL血清瓶中，扩大培养，12 h后用于上述发酵培养基接种(5L发酵罐)，接种量为10%(v/v)， 搅拌转速在120 rpm，37°C发酵培养。接种后通入N2，通气量为0. 25 vvm, 10 min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将NaOH和HCl都配成2 mol/L的溶液，通过校准的 PH电极测定发酵体系的pH值，前8 h控制发酵体系的pH值为5. 5，当pH低于设定值时，采用2 mol/L的NaOH升高pH值，当pH高于设定值时，采用2 mol/L的HCl降低pH值；当OD 大约长到2后，迅速将发酵体系的pH值调到4. 9，并维持到发酵结束。结果如表2。表2 pH胁迫调控(5. 5-4. 9)与对照组的发酵结果对比从表2中的实验结果看出，米用pH胁迫调控策略后，菌体的生长速率提高了 112%，发酵周期缩短了 33. 3%，丁醇生产速率提高了 28. 9%。. 实施例3
菌种丙酮丁醇梭菌 CZo1SiriiZi腫 acetobutylicum ASl. 135 (CGMCC 1. 135)。


本发明涉及一种厌氧发酵丙酮丁醇梭菌产丁醇的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵生产丁醇三步骤。本发明根据丙酮-丁醇梭菌厌氧发酵生产丁醇时pH变化的特性，在发酵体系中引入了pH胁迫调控，对丙酮-丁醇梭菌产酸期和产醇期的pH进行胁迫调控，当产酸期pH5.5，产醇期pH调节到4.7-4.9，相对于不调控pH的丁醇发酵，丁醇产量提高了20%，发酵周期缩短了33%，生产速率提高了28.9%，；此方法缩短了发酵周期、提高了产量、降低了成本，操作简便，易应用于丁醇的工业化生产。