CRISPR-Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA的制作方法[0002]乙型肝炎病毒(!fepatitis B VIRUS, HBV)属于嗜肝DNA病毒科，是引发病毒性乙型肝炎的病原体。全球约1/3的人曾感染过HBV，慢性HBV感染者约有3-4亿人，其中25%-40%人死于HBV感染相关疾病，HBV是全球第九大致死性疾病。我国属于HBV感染的高流行区，一般人群的乙肝病毒感染标志，乙肝病毒表面抗原(h印atitis B surfaceantigen, HBsAg)阳性率接近10%。对现有病毒性乙型肝炎患者及HBsAg携带者的防治工作，在今后几十年里仍会是一项艰巨的任务。[0003]乙型肝炎病毒又是一种逆转录病毒，其基因组是由两条螺旋的DNA链围成的一个环状结构，大小约为3.2KB，是一个相当小的病毒。其基因组共有四个开放阅读框(openreading frame, 0RF),编码以下一些蛋白:Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白(L，M，S)。两条螺旋的DNA链，其中一条较长负链已经形成完整的环状，另一条长度较短的正链，呈半环状。一旦感染肝细胞，病毒DNA就会入核，在核里，这条半环状的DNA链要以负链为模板，在乙肝病毒DNA聚合酶的作用下延伸，最终形成完整的环状。乙肝病毒基因组也就形成了一个完整的环 状双链DNA,即共价闭合环状DNA(Covalently closedcircular DNA, cccDNA)。cccDNA可以看做是病毒复制的原始模板,既能转录产生3.5KB的前基因组mRNA，又能转录出病毒mRNA并翻译产生包括HBsAg在内的四种病毒蛋白。病毒基因以其中的一条cccDNA为模板转录形成前基因组mRNA之后，前基因组DNA逆转录形成负链DNA，复制出正链，最后再装配到一起形成新的双链乙型肝炎病毒DNA，其中一部分双链DNA会在核里重新形成cccDNA。每个细胞核中大约15-20个拷贝的cccDNA可能会在易错的病毒复制多聚酶的作用下发生病毒的变异，造成抗药性。[0004]目前，治疗乙型肝炎的药物主要包括核苷酸类似物和干扰素等，其中以核苷酸类似物临床应用最广泛。核苷酸类似物可以阻断病毒RNA和新的病毒DNA的产生，但是对于已经存在的病毒cccDNA却没有作用。随着HBV耐药突变株的不断出现，使得现有的抗HBV药物难以达到理想的治疗效果。此外，HBV cccDNA还可能是病毒产生抗药性的关键原因，因此，即使是部分失活HBV cccDNA都具有重要的治疗价值，这样，特异性靶向HBV cccDNA引起了人们的广泛关注。[0005]2010 年，Engineered zinc finger nucleases (ZFNs)被成功的应用于 HBVcccDNA 的敲除，效率大约为 26%。2013 年，Engineered transcription activator-likeeffectors (TALEs)也被用于突变HBV cccDNA，效率大约为35%，相应地，HBsAg降低了大约20%。很明显，现有的技术还很难满足需要，人们期待找到更高效的HBV cccDNA的敲除策略。[0006]规律成族间隔短回文重复系统(clusteredregularly interspaced shortpalindromic repeat; CRISPR-associated, CRISPR_Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strandbreaks, DSB),在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non_homologous endjoining, NHEJ),造成移码突变(frameshift mutation),导致基因敲除。这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，在2012年开始像爆炸一般流行开来。由于其容易操作、可以同时靶向多个基因、可以高通量制备、造价低等优势，Cas9已经成为一种发展最快的技术(Pennisi, 2013)。正是由于其优越性,这一技术在 Nature 推荐的 2013 十大进展中位列第一(http://www.nature, com/news/365-days-nature-s-10-1.14367),在 Science 推荐的 2013 十大进展中位列第二位(http://news.sciencemag.0rg/breakthrough-of-the-year_2013)。Cas9 祀向切割 DNA 是通过两种小RNA—crRNA (CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)和祀序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链,简称sgRNA(single guide RNA)。[0007]与ZFN、TALEN相比，CRISPR_Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。为高效靶向敲除HBV cccDNA，实现乙型肝炎及其相关疾病的治疗提供了一种可能的选择。本发明的目的就是要验证利用CRISPR-Cas9高效靶向敲除HBV cccDNA，提供相应的技术方案，达到特异性敲除HBV cccDNA的目的。

[0008]针对现有靶向HBV cccDNA存在的问题:(I)效率低，只能少量敲除HBV cccDNA ；(2)只能稍微降低HBsAg表达，等。本发明设计了利用CRISPR-Cas9特异性敲除HBV cccDNA的策略。设计和合成特异性靶向HBV cccDNA的sgRNA，将该sgRNA与线性的pGL3-U6_sgRNA质粒连接成 PGL3-U6-HBV Sg 质粒，将 pGL3_U6_HBV Sg 质粒与 pST1374_NLS_f lag_Cas9_ZF质粒及带有1.2个HBV基因组 拷贝的质粒paywl.2 一起成功转染IfepG2细胞即可实现HBVcccDNA的敲除。本申请提供了一种利用Cas9/sgRNA快速、简便、高效、特异性敲除HBVcccDNA的方法。有效解决了特异性敲除HBV cccDNA存在的问题:(I)效率高，HBV cccDNA敲除效率达到70%以上；(2)降低HBsAg表达达到96% ；(3)可以多靶点同时敲除。
[0009]本申请的技术方案如下:
一、靶向HBV cccDNA的sgRNA寡核苷酸的设计和选择
因为没有使用体外转录，只是构建普通载体的方式制作。所以如无特殊说明，文中的sgRNA序列指的是sgRNA对应DNA序列。
[0010]1、在 HBV cccDNA 上选择 5’-GGN(19)GG 的序列，如果没有 5，-GGN(19)GG 的序列，5’ -GN(20)GG 或者 5’ -N(21)GG 也可以。
[0011]2、sgRNA在HBV cccDNA的靶向位点位于S蛋白的0RF。
[0012]3、在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一。
[0013]4、如果在用两个sgRNA来实现靶向HBV cccDNA，选择相隔一定距离(10~30 bp)成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。
[0014]二、构建sgRNA的寡聚核苷酸双链
根据选择的sgRNAs,在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(如果序列本身在5’端已经有I或者2个G，那么就对应的省略I或者2个G);根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火,退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链,如下: