使用包胶在脂质体中的顺铂和其他药物或基因治疗人类癌症制作方法

脂质体 包胶 使用 其他

本发明涉及用脂质体包胶的药物及给药系统，特别是脂质体包胶的顺铂该药物可在静脉内注射后用于杀死各种人恶性肿瘤中的癌细胞顺-二胺二氯合铂(II)，cis-[Pt(NH3)2Cl2]2+，简称为顺铂或者cis-DDP，是最广泛使用的抗肿瘤药物之一，用于治疗睾丸癌、卵巢癌以及对抗头和颈部的癌症超过90％的睾丸癌是用顺铂治疗最严重的副作用是肾毒性、骨髓毒性和胃肠道刺激作用(Oliver和Mead，1993)在用160mg/m2顺铂和640mg/m2卡铂治疗的卵巢癌患者中观察到双侧视神经病(Caraceni等人，1997)口服六甲基蜜胺治疗一组61名对顺铂或卡铂产生耐受性(在治疗结束后6个月内复发)的上皮卵巢癌患者时，表明具有14％的客观反应率(Vergote等人，1992)阳离子性胆固醇衍生物已被用于给药治疗剂例如，它们与磷脂酰乙醇胺混合，然后进行超声处理，形成小的单层囊泡，该囊泡可与NDA复合并介导由内体腔进入细胞溶胶其中一种脂质体制剂是DC-Chol脂质体，其已被用于对抗黑素瘤的基因治疗临床试验中人免疫缺损病毒-1反式激活蛋白基因与报道基因在控制HIV-1的情况下共同给药，顺铂治疗失败的患者对于阳离子性脂质体是高度转染的这些结果提示出用顺铂和基因疗法来治疗恶性肿瘤的一系列治疗方案(Farhood等人，1994)由2-氨基-甲基吡咯烷衍生物作为载体配位体制备的各种铂复合物已在小鼠中测试了它们在皮下和/或腹膜内注射时对结肠26癌和P388白血病的抗肿瘤活性证明2-氨基甲基吡咯烷在其胺衍生物中是最有效的载体配位体(Morikawa等人，1990)通过正交试验确定了用乳液加热稳定法制备顺铂白蛋白微球(Cis-DDP-AMS)(平均大小为148微米)的最佳方法在相对于顺铂用Cis-DDP-AMS进行肝动脉化学栓塞形成(chemoembolization)后，铂的分布和消除分别延长了3.36倍和1.23倍(Zhang等人，1995)对具有更高治疗性质的铂(II)基化合物进行研究，促进设计并合成了一类新的水溶性、连接在尿嘧啶和尿苷上的第三代顺-二胺二氯合铂(II)复合物但是，所合成的化合物中没有一个对所治疗的三种细胞系显示出任何显著的细胞毒性作用(Kim等人，1998)发现最近研制的生物还原剂4-[3-(2-硝基咪唑基)-丙基氨基]-7-氯喹啉盐酸盐(NLCQ-1)可增强化学治疗剂美法伦(L-PAM)、顺铂(cisDDP)和环磷酰胺(CPM)的抗肿瘤作用，但没有同时增强骨髓毒性该增强作用是严格的程序依赖性的，而且在cisDDP之前45分钟给药NLCQ-1可观察到最佳的作用(1.5-2个log超过可加性的杀死作用(killing beyond additivity))这些结果支持基于临床研究将NLCQ-1化分为化学致敏剂(Papadopoulou等人，1998)在患有非小细胞肺癌(NSCLC)并已用顺铂进行首次治疗的患者中，紫杉醇与顺铂组合作为二线药物，在14名患者中产生了部分反应(40％)(Stathopoulos等人，1999)Abra等人(1999年8月31日授权的第5,945,122号美国专利)描述了一种脂质体组合物，其包含包封在大多数为中性的脂质中的非电荷性顺铂但是，在本专利申请中是用于包封顺铂因此，虽然现有报道表明脂质体调节顺铂和其他治疗剂的给药是有可能的，但是治疗效力受限于顺铂的低水溶解度和低稳定性治疗效力还受限于该药物的高毒性因此，仍需要减少处理含顺铂的药物时所涉及的困难以及降低在治疗使用时顺铂的高毒性本发明满足该需求并提供相关的优点图2显示了在3-4次注射包胶顺铂后在SCID小鼠中MCF-7肿瘤的缩小图3显示了在经或未经顺铂处理的SCID小鼠中肿瘤的组织学图3A显示了SCID小鼠中发育的未经处理的MCF-7肿瘤，放大40倍注意肿瘤组织的结构特征的同源性图3B显示了经顺铂处理的小鼠(4次注射)细胞是凋亡性的，有许多组细胞进入结构中，而且核染色更大、更暗，这是凋亡细胞的特征图3C显示了未经处理的动物中的肿瘤，表明侵入到肌肉中，放大20倍图3D显示经顺铂处理的小鼠未发现侵入放大20倍图4显示了在用包胶顺铂处理的动物(A)和未经处理的动物(B)之间肿瘤尺寸的宏观(可视)差异实施本发明的方式除非另有说明，本发明的实施将使用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA中的常规技术这些方法描述在以下出版物中例如参考分子克隆实验室指南(MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL)，第2版，(1989)；分子生物学中流行方案(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.Ausubel等人编辑(1987))；酶学中的方法(METHODS INENZYMOLOGY)(Academic Press，Inc.)；PCR实用方法(PCRAPRACTICAL APPROACH)(M.MacPherson等人，IRL Press at OxfordUniversity Press(1991))；PCR 2实用方法(PCR 2A PRACTICALAPPROACH)(M.J.MacPherson，B.D.Hammes和G.R.Taylors编辑(1995))；抗体，实验室指南(ANTIBODIES，A LABORATORYMANUAL)(Harlow和Lane编辑(1988))；以及动物细胞培养(ANIMALCEL CULTURE)(R.I.Freshney编辑(1987))在说明书及权利要求书中，“一种”、“该”以及“所述”等单数形式，除非另有说明，包括表示复数例如“一种细胞”包括多个细胞，包括它们的混合物术语“包括”或“包含”是指组合物和方法包括所述的组成部分，但不排除其他部分当用于限定组合物及方法时，“基本上由……组成”表示除对于组合而言显著必须的部分外不包括其他部分因此，组合物基本上由方法中的部分以及药物学上可接受的载体如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等组成“由……组成”是指不包括其他成分或者给药本发明组合物的实质步骤的其他部分术语“多核苷酸”和“核酸分子”可相互交换地使用，并指任何长度的聚合物形式的核苷酸多核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物核苷酸可具有三维结构，并可具有任何已知或未知的功能术语“多核苷酸”包括例如单链、双链和三螺旋分子、基因或基因片段、外显子、内显子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针、和引物核酸分子还可包括经修饰的核酸分子“基因”是指包含至少一个开放阅读框的多核苷酸，其在转录和翻译后能够编码特定的多肽或蛋白“组合物”是指活性物质与惰性(例如可检测的物质或标记或药物学上可接受的载体)或活性(如辅剂)的其他化合物或组分的组合“药物组合物”是指活性物质与惰性或活性载体的组合，使组合物适合于体外、体内、或活体外诊断或治疗用在此所用术语“药物学上可接受的载体”包括任何标准的药物学载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、和乳液，如油/水或水/油乳液，以及各种类型的湿润剂组合物还可包含稳定剂和防腐剂载体、稳定剂和辅剂的例子可参见Martin，REMINGTON′S PHARM.SCI.，第15版(MackPubl.Co.，Easton(1975))“有效量”是指足以实现有益或所希望的结果的量有效量可在一次或多次给药、一个或多个剂型中给药“哺乳动物”是指脊椎、优选哺乳动物，更优选为人哺乳动物包括但不限于鼠、猿猴、人、农用动物、运动用动物和宠物“对照”是在试验中用于对比目的的其他受试者或样品对照可以是“阳性的”或“阴性的”例如，如果试验的目的是测定基因的变化表达水平与具体癌症类型之间的相关关系，通常优选使用阳性对照(从携带所述变化并表现该疾病的综合症特征的受试者中选出的受试者或样品)和阴性对照(从缺乏已发生变化的表达以及该疾病的临床综合症的受试者中选出的受试者或样品)“基因转运载体”定义为可将插入的多核苷酸携带入宿主细胞中的任何分子基因转运载体的例子是脂质体，阳离子性脂质体，病毒如杆状病毒、腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒，噬菌体，粘粒，质粒，真菌载体以及本领域中通常使用并用于在各种真核及原核宿主中表达、用于基因治疗以及简单蛋白表达的其他重组载体“病毒载体”定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含在体内、活体外或体外待转运至宿主细胞中的多核苷酸病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等如果基因转移是通过逆转录病毒载体介导的，载体构建是指包含逆转录病毒基因组或其部分以及插入的多核苷酸的多核苷酸在此所用术语“逆转录病毒介导的基因转移”或者“逆转录病毒转导”具有相同的定义，并指其中基因或者核酸序列通过病毒进入细胞以及将其基因组整合在宿主细胞基因组中而被稳定地转移至宿主细胞中的过程通过其正常感染机理或者修饰为可结合不同宿主细胞表面受体或配体而进入细胞中，由此病毒可进入宿主细胞中在此所用术语“逆转录病毒载体”是指能够通过病毒或者病毒样进入机理将外源性核酸引入细胞中的病毒颗粒逆转录病毒以RNA的形式携带它们的遗传信息，但是一旦病毒感染细胞，RNA则反转录为DNA形式，其整合入被感染细胞的基因组DNA中经整合的DNA形式称为原病毒腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)、载体构建是指包含病毒基因组或其部分以及待插入的多核苷酸的多核苷酸腺病毒(Ad)是一组相对好表征的同源性病毒，包括50种以上的血清类型(参见例如WO95/27071)Ad容易生长，而且不需要整合入宿主细胞基因组中重组Ad衍生的载体，特别是那些降低野生型病毒重组和产生的潜力的载体，也已被构建(参见例如WO 95/00655；WO 95/11984)野生型AAV具有高的感染性以及整合入宿主细胞基因组中的特异性(Hermonat和Muzyczka(1984)PNAS USA 816466-6470；Lebkowski等人(1988)Mol.Cell Biol.83988-3996)包含启动子以及其中可操作性地连接多核苷酸的克隆位点的载体，在本领域中是众所周知的此等载体能够在体外或体内转录RNA，而且可由例如Stratagene(La Jolla，CA)或者Promega Biotech(Madison，WI)商购得到为使表达和/或体外转录最佳化，有可能需要除去、添加或改变克隆中5′和/或3′未翻译部分，以消除额外的、潜在非适当的、可替换的翻译启动密码子或者可在转录或翻译阶段干扰或降低表达的其他序列或者，共有核糖体结合位点可紧邻启动密码子的5′处插入，以增强表达基因转运载体还包括几种非病毒载体，包括DNA/脂质体复合物、以及靶病毒蛋白DNA复合物也可包含靶向抗体或其片段的脂质体可用于本发明的方法中为增强向细胞的转运，本发明的核酸或蛋白可与抗体或其结合片段缀合，所述结合片段结合细胞表面抗原，如TCR、CD3或CD4多核苷酸可使用本领域已知的方法插入在载体基因组中例如，在合适的条件下使插入片段和载体DNA与限制酶接触，以在可相互配对并可通过连接酶连接在一起的各分子上产生互补端或者，合成的核酸连接体可连接在限制性多核苷酸的端部这些合成的连接体包含相应于载体DNA中的特定限制性位点的核酸序列另外，包含终端编码子及合适的限制性位点的寡核苷酸是可选择的标记物基因，如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染物的新霉素基因；用于高水平转录的由人CMV的立即早期基因中选择的增强子/启动子基因；用于mRNA稳定性的由SV40中选择的转录终端和RNA处理信号；用于复制的SV40多形瘤起点以及用于合适的附加型复制的ColE1；多用途多克隆位点；在插入的多核苷酸中稳定成分3′，以及用于体外转录有意义RNA及反义RNA的T7和SP6 RNA启动子其他方式在本领域中是已知的而且都可以使用“宿主细胞”是指任何可以是或者已经作为载体或者插入外源性多核苷酸、多核苷和/或蛋白的受体的单个细胞或者细胞培养物其还包括单个细胞的后代，而且所述后代由于天然、偶然或者有意的突变对于原始母细胞而言并不必须是完全相同的(在形态或者基因组或者总DNA互补方面)细胞可以是原核细胞或者真核细胞，而且包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞、以及哺乳动物细胞，如鼠、猿猴或者人在此所用术语“赘生物细胞”、“赘生”、“肿瘤”、“肿瘤细胞”、“癌”、以及“癌细胞”(可相互交换地使用)是指能够相对自动生长的细胞，使它们具有异常生长表型，其特征是显著丧失对细胞增殖作用的控制(即、不可调节的细胞分裂)赘生细胞可以是恶性或良性的“抑制”肿瘤生长表示与对照细胞相比生长状态被降低肿瘤细胞生长可用本领域已知的任何方法来评估，包括但不限于测量肿瘤大小，使用3H-胸腺嘧啶插入分析测定肿瘤细胞是否增殖，或者计数肿瘤细胞“抑制”肿瘤细胞生长代表以下状态中的任何一种或者全部使肿瘤生长减缓、延迟、和停止，以及肿瘤缩小本发明的实施方案胶束、脂质体以及得到它们的方法本发明所要保护的是用于将顺铂包封在脂质中的方法，其可增加单位体积中的顺铂含量，降低其毒性，能够在静脉注射后靶向原位肿瘤以及它们的转移肿瘤，而且可以使肿瘤缩小，完全治疗携带人肿瘤的SCID小鼠顺铂是重金属络合物，其在顺位包含两个氯原子和两个氨基，它们都连接在一个二价过渡金属铂原子上其是双官能烷基化剂以及抑制DNA合成的DNA嵌入剂在一个形式中，顺铂是分子量为300.1的黄色粉末，而且在水中的有限溶解度为1mg/ml其广泛用于治疗癌症患者，特别是那些睾丸癌、淋巴瘤、子宫内膜癌、膀胱癌、卵巢癌、头和颈部鳞状细胞癌、乳腺癌、以及许多其他恶性肿瘤的患者，通常与阿霉素、长春碱、博来霉素、泼尼松、长春新碱、紫杉醇和其他抗肿瘤药物以及放射疗法联合使用我们在此是要降低患者治疗所需要的总顺铂体积，这是因为增加了脂质包封形式的顺铂的溶解度静脉注射时使用的体积通常较大(每个成年患者为约180ml或者约20-120mg/m2)，通过24小时输液进行给药其从血浆中清除分为25-80分钟的快速期以及随后58-73小时的缓慢期其与血浆蛋白结合，并通过肾排泄(这就是在治疗患者中产生严重肾毒性的原因)剂量相关的肾毒性可通过剧烈的水合化、甘露醇、呋塞米和其他药物来部分地克服顺铂产生的其他毒性包括耳毒性、恶心和呕吐、贫血、以及中等骨髓抑制(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy)本发明克服了现有方法和组合物中的局限性因此，在一个方面中，本发明提供制备顺铂胶束的方法，其中以1∶1-1∶2.1的比例混合顺铂和磷脂酰甘油脂质衍生物(PGL衍生物)，形成顺铂混合物在另一个实施方案中，顺铂与PGL衍生物的比例为1∶1.2，或1∶1.4，或1∶1.5，或1∶1.6，或1∶1.8，或1∶1.9，或1∶2.0，或1∶2.1所述混合物然后与有效量的至少20％的有机溶胶混合，所述有机溶胶例如是乙醇溶液，形成顺铂胶束任何能够形成胶束并具有带净负电荷的头部基团的脂质衍生物这包括但不限于二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、和二癸酰基磷脂酰甘油在一个方面中，带有含10-28个碳原子的碳链而且具有不饱和脂族侧链的磷脂酰基衍生物也在本发明的范围内顺铂与带负电荷的磷脂酰甘油脂质按照不同的摩尔比形成复合物，形成带净正电(1∶1)、中性(1∶2)或者略带负电荷(1∶2.1)的颗粒，将使得在给药后靶向不同的组织但是，已表明顺铂与带负电荷的PGL复合可增加顺铂的溶解度，降低有效抗肿瘤治疗时所需要的药物体积另外，顺铂与带负电荷的PGL复合可产生非常高的包胶效率，使得制备过程中的药物损失最小化这些复合物都是稳定的，不形成沉淀，而且在4℃下储存至少4个月仍保持治疗效力在此所用术语“顺铂”包括类似物其例子包括卡铂、ormaplatin、oxaplatin、2-氨基甲基吡咯烷(1，1一环丁烷二甲酸合)铂、lobaplatin、1-环丁烷-二甲酸合(2-)-(2-甲基-1，4-丁烷二胺-N，N′)铂、zeniplatin、enloplatin、254-S nedaplatin和JM-216(二-乙酸合-胺-二氯-环己基胺-铂(IV))还可以理解的是，虽然并没有总是清楚地说明，但可用其他带正电荷的药物替代顺铂，这些药物包括但不限于抗肿瘤药物阿霉素或者，其他类型的中性药物在用带正电荷的基团衍生化而转化为带正电荷的药物后，也可以使用将中性或者带负电荷的抗癌药物或者其他类型的药物转化为带正电荷的分子，可通过有机合成领域中已知的许多方法来完成这些方法例如包括用氨基替换药物中的羟基，或者用三甲基氨基替换，由此在化合物中引入正电荷在1998年11月17日授予Wang等人的第5,837,868号美国专利中讨论了用氨基替换环羟基上述方法不需要按照上述顺序进行所述步骤例如，该方法可如下实施使顺铂与有效量的至少20％的有机溶剂溶液混合，形成溶液该溶液与PGL衍生物混合，形成胶束如上所述，顺铂与PGL衍生物的比例为1∶1.2，或1∶1.4，或1∶1.5，或1∶1.6，或1∶1.8，或1∶1.9，或1∶2.0，或1∶2.1在本发明的方法中，可以使用任何不形成两相体系的有机溶剂或者乙醇溶液，或者在20％醇中混溶的其他有机溶剂(如氯仿)例如，醇溶液可以是至少30％、35％、40％、45％直至90％溶液中的任何一种，包括它们之间的任何一种优选的是，对于DPPG，醇溶液为30％乙醇溶液，而对于其他脂质，最佳的百分比可以是不同的在一个实施方案中，用带净负电荷的肽替换部分DPPG分子，形成具有融合性质的顺铂复合物，其能够跨越靶细胞膜融合肽也可共价地连接在PEG的游离端，以更好地暴露添加少量的阳离子性脂质替换最终顺铂/DPPG复合物中的含水顺铂的正电荷，也可使该复合物具有融合性质，用阳离子性脂质(如DDAB二甲基双十八烷基溴化铵；DMRIEN-[1-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基]-N，N-二甲基-N-(2-羟基乙基)溴化铵；DMTAP1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷；DOGS双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺；DOTAPN-(1-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵；DPTAP1，2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷；DSTAP1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷)替换的正电荷百分比是较小的，这是因为阳离子性脂质的毒性一些制剂在胶束中包含一定量的融合性两亲脂质DOPE在另一个方面中，顺铂胶束被包胶在囊泡形成性脂质中，例如用于药物转运脂质包胶的顺铂在消除各种人实体瘤方面具有高的治疗效力，所述实体瘤包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、多形成胶质细胞瘤、非小细胞肺癌、胰腺癌、头和颈部鳞状细胞癌和T细胞淋巴瘤因此，根据另一个方面，本发明提供使用包胶在脂质体中的顺铂或者其他带正电荷的抗肿瘤药物治疗各种人恶性肿瘤的方法，该脂质体在其内层和外层膜的两个层之间具有不同的组成脂质体包胶的药物在静脉注射给动物和人后能够达到原位肿瘤及其转移瘤抗肿瘤药物比单独的顺铂具有具有更高的治疗效力经包胶的顺铂与多种抗癌药物组合，例如包胶在类似类型的脂质体中的p53、IL-2、IL-12、制管张素和制癌蛋白，以及经包胶的顺铂与HSV-tk加上经包胶的更昔洛韦组合物，在消除癌症方面也具有更高的治疗效力在另一个方面中，本发明提供经包胶的顺铂与以下基因的组合(i)在控制CMV、β-肌动蛋白或者其他启动子的情况下的野生型(wt)p53 cDNA表达载体，以及能够维持长期p53基因表达的人复制起点；病毒复制起点，其需要病毒复制起始密码子蛋白如T抗原，用于它们的活化，该起始密码子蛋白对于转移p53基因也是不合适的，因为p53蛋白强烈地与T抗原相互作用(ii)PAX5 cDNA表达载体，其是唯一已知的p53基因抑制剂(wt和突变p53基因)，与p53基因的内显子1中的短(10个核苷酸)调节区域相互作用p53基因治疗的主要缺陷是内源性突变形式的p53使wtp53蛋白失活，而内源性突变形式的p53在肿瘤中过度表达，而且能够与p53蛋白四聚化；内源性p53基因被Pax5的表达所抑制，后者是p53基因的强效转录阻抑物wt p53 cDNA载体缺乏内显子1，并由此缺乏抑制性PAX5结合区域重要的是抑制内源性突变p53基因表达，并从癌细胞中消除突变p53，以增强凋亡诱导和肿瘤抑制作用(iii)单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)自杀基因也包括在p53和Pax5基因的组合中，在用更昔洛韦(GCV)治疗动物模型和人类患者后导致DNA合成的中断；期望增加癌细胞中的链断裂，并增强已知与链断裂物以及损坏的DNA位点结合的p53肿瘤抑制剂功能在另一个实施方案中，更昔洛韦组合并包胶在脂质体中基因治疗是生物医学的一个学纪元，其主要针对在患者的体细胞中引入治疗性基因(综述见Boulikas，1998a；Martin和Boulikas，1998)两个主要的障碍限制了体细胞基因转移的成功应用(1)由体内注射起3-7天后治疗性基因第一个问题源自于(i)不能转运携带基因的载体到达目标细胞表面(绝大多数的脂质体-DNA复合物从血液循环中快速消除)；(ii)难以渗透细胞膜；(iii)在被细胞内在化(internalization)后难以由内体释放DNA；以及(iv)不能有效地转运至核酸中其他人使用了秘密(stealth)脂质体(Martin和Boulikas，1998a)，其在循环中持续数天，并浓集于肿瘤中但是，典型的秘密脂质体不被癌细胞摄入在此公开的策略是用于增强脂质体的内在化(融合肽)第二个问题的起因是由核酸酶降解导致的核中质粒的丢失，不能自动复制，使得它们在细胞增殖期间在后代细胞中被稀释，或者是由于在整合入宿主细胞的染色体后使外源DNA失活但是，使用能够长期维持质粒的染色体外复制的人序列(参见Teni Boulikas的第5,894,060号美国专利，其题目是“用于捕获人复制起点的克隆方法(Cloning methodfor trapping human origins ofreplication)”)将克服该限制在此还要求保护的是使肿瘤消退并降低动物模型和人类中乳腺癌、前列腺癌和其他癌症的肿瘤体积，其是给药经包胶的顺铂(LipoplatinTM)或者经包胶的阿霉素，以及这些药物与基因(包括但不限于p53、PAX5和HSV-tk)的组合/包胶的更昔洛韦、IL-2、IL-12、GM-CSF、制管张素、IL-4、IL-7、IFN-γ、TNF-α、RB、BRCA1、E1A、胞嘧啶脱氨酶与包胶的5-氟胞嘧啶、bc1-2、MDR-1、p21、p16、bax、bcl-xs、E2F、IGF-I VEGF、TGF-β基因等组合因此，本发明还提供向细胞中转运顺铂或其他治疗剂的方法，其中使所述细胞与经包胶的药物或者可用本发明的方法得到的其他中间体相接触本发明还提供抑制患者中肿瘤生长的方法，其包括向所述患者给药有效量的用本发明的方法得到的包胶药物这些方法可在体外、活体外或者体内实施因此，本发明还提供使用包胶药物和多核苷酸的组合治疗方法在此所用术语“多核苷酸”包括但不限于基因组合基因治疗方法在消除癌症方面要比单独的基因治疗更为有效，这是因为两个机理不同，并可产生协同作用例如，p53蛋白结合损坏的DNA区域以及DNA的游离端的性质是已知的，而且还触发严重损坏的细胞中凋亡的机理(综述见Boulikas，1998a)癌细胞中DNA的游离端预期是在被顺铂损坏后产生的，通过转移wt p53的表达增强这些细胞中凋亡通路的诱导(许多肿瘤具有突变的p53，而且有可能不能有效地诱导该通路)治疗性多核苷酸也可在掺入胶束之前插入在基因转移载体中在众多的研究中，野生型p53基因的转移已成功地用于在体内以及细胞培养物中减慢肿瘤细胞的增殖在最近的临床试验中表明，使用腺病毒/p53载体在肿瘤内注射可有效对抗肺肿瘤(Roth等人，1996)，以及对抗动物模型中的前列腺肿瘤(综述见Boulikas，1998a)但是，肿瘤内注射法不能应用于通常与癌症晚期有关的转移瘤中全身性给药p53基因以及包胶的顺铂并靶向身体任何区域中的肿瘤，对于癌症治疗都是有效的我们在此要求保护缓解或者部分克服成功的体细胞基因转移中的四种主要障碍，其中向动物模型中以及待临床测试的患者中的各种人癌使用脂质体转运p53、pax5、HSV-tk、GM-CSF、IL-12、IL-2、IL-4、IL-7、IFN-γ、TNF-α、RB、BRCA1、E1A、胞嘧啶脱氨酶与包胶的5-氟胞嘧啶、bcl-2、MDR-1、p21、p16、bax、bcl-xs、E2F、IGF-I VEGF、TGF-β、制管张素以及其他基因的组合，并组合包胶的顺铂和其他药物这些包括(i)在脂质体中浓缩并包胶药物和基因子弹，降低它们的毒性；(ii)用聚乙二醇(PEG)、透明质酸或其他聚合物包敷复合物的表面，靶向实体瘤和转移瘤；(iii)利用阳离子性脂质的融合性质或者小含量，增强癌细胞对药物和质粒的吸收；以及(iv)使用能够维持治疗基因的表型复制或者长期表达治疗性基因以及高水平表达的人复制起点(ORI)维持基因的表达在另一个实施方案中，多核苷酸或基因进一步包括能够在几个月而不是几天的时间中维持基因表达的调节性DNA序列该强的治疗效果，这是因为高水平的抗癌基因表达；在控制弱的调节性DNA时设置的相同基因是无效的在使用p53基因给药系统时已设计出几种用于癌症治疗的试验性方法我们的新方法包括，使用PAX5表达载体抑制内源性突变p53形式，该形式在一半以上的人前列腺恶性肿瘤、特别是那些晚期前列腺癌中过度表达突变形式的p53主要是在它们的DNA结合域中具有氨基酸取代，但仍能够与wt p53形式四聚合化；p53以四聚物的形式起作用，而且在人癌细胞中存在高水平的内源性突变p53会干扰所给药的wt p53的肿瘤抑制剂作用PAX5是同源域蛋白，其在发育期间决定身体结构；PAX5是在哺乳动物发育的早期以及造血干细胞分化期间的成人中表达；p53基因表达在发育的早期被PAX5抑制剂蛋白消除，使细胞在发育胚胎中快速倍增PAX5在成年的整个阶段中于后期被关闭，使p53被表达，并发挥其肿瘤抑制功能，特别是在造血细胞系中调节凋亡在体细胞基因转移中使用了多种给药系统，都各有优缺点重组腺病毒不能有效复制；重组鼠逆转录病毒随机整合，而且被染色质包围物失活；重组AAV随机整合，而且对于临床应用不能达到高的效价因为包装限制，它们都有最大3.5-7.5kb的外源蛋白容量裸DNA在全身给药后快速分解(半衰期为5分钟)阳离子性脂质体是毒性的，在循环中的存在时间不超过一次心跳，并主要靶向肺、肝和心的内皮目前，已证明仅有“秘密”脂质体能够浓集在肿瘤部位(还有肝和脾中)，而且在血液循环中保留更长的时间(例如1天，而非秘密中性脂质体为数分钟，阳离子性脂质体为几秒)但是，秘密脂质体不容易被肿瘤细胞吸收，仍存留在细胞外的空间中，在该空间中在溶胞作用后在数天的时间内释放负载的药物(MartinBoulikas，1998)然而，本发明以下描述的方面用融合肽或者通过在其内侧双层中提供部分阳离子性脂质体组合物或DOPE对秘密脂质体进行了改进，该双层用秘密脂质体已在动物的实体瘤中浓集并吸收药物和基因子弹，第二步对于我们的药物及基因靶向方法是有效的在M.D.AndersonCancer Center中进行的人临床试验在患有非小细胞肺癌的患者中使用了野生型p53基因的转移，而且在与顺铂组合时于肿瘤部位处使用局部注射Ad5/CMV/p53重组腺病毒表明在它们的肿瘤中具有p53突变该临床试验的第一个结果在肿瘤内注射p53后是令人鼓舞的(Roth等人，1996；综述见Boulikas，1998a)但是，局部注射不适用于通常与恶性肿瘤晚期有关的转移瘤；特别是前列腺癌在骨中产生转移瘤，其机理涉及胰岛素样生长因子I(IGF-I)刺激前列腺肿瘤的增殖，而所述胰岛素样生长因子I特别是由骨细胞分泌的因此，在此提出的给药系统能够在全身注射后浓集于肿瘤细胞质中，这样就有可能不仅治疗原位肿瘤，而且还可治疗转移瘤所建议的顺铂脂质体主要靶向肿瘤，这是因为我们给药系统的性质在组合治疗方法中的基因将主要靶向分裂细胞，这是因为使用了掺入在复制DNA中的HSV-tk以及更昔洛韦，而且主要是靶向血管化细胞，这是因为秘密脂质体因此，将不会杀死秘密脂质体也能到达的肝和脾细胞在另一个实施方案中，在此描述的经脂质体包胶的药物还包括有效量的融合肽融合肽是一类螺旋两亲肽，其特征是沿长的螺旋轴具有疏水性梯度该疏水性梯度使得肽斜插入膜中，由此使脂质芯不稳定，并增强膜融合(Decout等人，1999)血凝素(HA)是流感病毒的同源三体表面糖蛋白在感染中，其在低pH下诱导病毒和内体膜之间的膜融合各单体组成受体结合HA1域以及膜相互作用HA2域HA2域的NH2端区域(氨基酸1-127)，所谓的“融合肽”，插入目标膜中，并在触发病毒和内体膜之间的融合方面起着关键性的作用基于区域5-14中8个氨基酸被半胱氨酸取代以及旋转标记电子顺磁共振，其由磷酸酯基起算该膜的水平面具有最大15埃的深度(Macosko等人，1997)使用由流感病毒血凝素HA-2中得到的融合肽大大增强了细胞对运铁蛋白-聚赖氨酸-DNA复合物的吸收效力；在此情况下，肽连接在聚赖氨酸上，而且复合物是用运铁蛋白受体介导的胞吞作用来转运的(综述见Boulikas，1998a)该肽具有以下序列GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGYC(SEQ ID NO1)，而且能够诱导荧光染料calcem由脂质体中的释放，其是用蛋黄磷脂酰胆碱制备的，在酸性pH条件时更高；在0.1-1mM的浓度下，在使用培养基中的CEM-SS淋巴细胞时，该肽还能够将反义寡核苷酸抗HIV效力增加至10倍该肽在内体略微更酸性的环境中改变构象，使内体膜不稳定并断裂内体膜(综述见Boulikas，1998a)在膜中存在带负电荷的脂质对于证明一些肽的融合性而不是其他肽的融合性是重要的；肽的融合作用代表生育素(fertilin)的推测融合域，该生育素是精-卵融合中涉及的精子表面蛋白，该融合作用依赖于带负电荷的脂质的存在但是，HIV2肽的融合作用却不是(Martin和Boulikas，1997)例如，为分析流感病毒血凝素HA的融合肽上的两个域，HA嵌合体设计成HA的胞质尾区和/或跨膜域被Sendai病毒的融合糖蛋白的相应域替换HA构建成其中胞质尾区被人神经纤维瘤蛋白1型(NF1)(残基1441-1518)或者c-Raf-1(残基51-131)替换使用痘苗病毒-T7聚合酶瞬时表达体系在CV-1细胞中表达构建物CV-1细胞与结合的人红细胞(RBC)之间由母或者嵌合HA蛋白介导的膜融合表明，在降低pH后，含水荧光团calcein开始由预先负载的RBC流入表达蛋白的CV-1细胞的胞浆中这说明膜融合涉及脂质双层的小叶并导致含水融合孔的形成(Schroth-Diez等人，1998)显著的发现是HIV的TAT蛋白能够跨过细胞膜(Green和Loewenstein，1988)，而且TAT的36个氨基酸域在化学交联至异源蛋白时，产生转导入细胞中的能力(SEQ ID NO2)是核仁定位信号(见Boulikas，1998b)糖蛋白gp41是HIV的另一种蛋白，包含融合肽衍生于gp41胞外域的近膜区域的线性肽具有用作抗HIV剂的潜力，并通过采用螺旋构象抑制感染性(Judice等人，1997)HIV-1 gp41的23个氨基酸残基N端肽具有使带负电荷的大单层囊泡不稳定的能力在缺乏阳离子时，主结构是成孔性α-螺旋，而存在Ca2+时，构象打开为融合性、主要是延伸的β-型结构HIV(ala)的融合活性(携带R22(A取代)降低70％，而在包括第二个取代(V2(E)时融合性完全消除，表明其不是α-螺旋，而且由HIV-1融合肽采用的延伸结构，所述HIV-1融合肽积极地使包含胆固醇的电中性膜不稳定(Pereira等人，1997)朊病毒蛋白(PrP)是一种功能未知的糖蛋白，正常情况下存在于神经元和神经胶质细胞的表面处其涉及以下疾病如疯牛病以及人中的Creutzfeldt-Jakob病，其中PrP转化为变更形式(称为PrPSc)根据计算机模型计算，PrP的120-133以及118-135域是与倾斜脂质有关的肽，以倾斜的方式插入在脂质双层中，而且能够与脂质体相互作用，诱导包胶calcein的泄漏(Pillot等人，1997b)Alzheimer淀粉样肽的C端片段(氨基酸20-40和29-42)具有与病毒蛋白的融合肽体外诱导脂质体融合有关的性质这些性质可介导淀粉样肽与细胞膜的直接相互作用，而且是淀粉样肽的细胞毒性的部分原因鉴于Alzheimer病的病理学与载脂蛋白E(apoE)多态性之间的流行病学及生物化学联系，检查三种普通的apoE同工型与淀粉样肽的C端片段之间的潜在相互作用，表明仅apoE2和apoE3是淀粉样肽融合及聚集性质的强效抑制剂，而apoE4不是ApoE对淀粉样聚集物形成的保护作用被认为是通过形成稳定的apoE/淀粉样肽复合物来介导的(Pillot等人，1997a；Lins等人，1999)当肽锚定在脂质体膜上时，11个氨基酸残基被强烈促进；肽的融合活性似乎不依赖于pH及膜合并，而且目标膜需要正电荷，该正电荷是通过掺入偶联赖氨酸的磷脂酰乙醇胺(PE-K)来提供的如果偶联肽可通过与PE-K的非特异性静电相互作用导致囊泡聚集，则游离肽不能诱导PE-K囊泡的聚集(Pecheur等人，1997)众多研究表明在插入细胞膜或脂质体的脂质双层中后，α-螺旋二级结构的稳定作用是肽的膜融合性质的原因；Zn2+增强肽的融合活性，因为其稳定α-螺旋结构例如，唾液杀菌肽的HEXXH域位于histatin-5的C端功能域中，是已识别的锌结合基元，为类螺旋构象(Martin等人，1999；Melino等人，1999；Curtain等人，1999)融合肽与DNA质粒配制在一起，以产生以肽为基础的基因给药系统用于将质粒缩合为40-200nm微小颗粒的YKAKnWK肽与GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ ID NO3)两亲肽(其是pH敏感的溶解剂，有利于从内体中释放质粒)的组合增强包含β-半乳糖苷酶报道基因的表达体系(Duguid等人，1998)DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)是融合脂质，弹性酶断裂N-甲氧基-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-DOPE，将该衍生物转化为DOPE(总体带正电荷)，以将包胶的荧光探针calcein转运入细胞胞浆中(Pak等人，1999)与β-内啡肽mRNA的区域互补的30个碱基的寡脱氧核酸序列表明，在用小的单层囊泡(50nm)包胶后，该囊泡包含二棕榈酰基-DL-α-磷脂酰-L-丝氨酸，赋予融合性质，在细胞培养物中浓度依赖性地抑制β-内啡肽的产生(Fresta等人，1998)本发明中所用的其他融合肽描述在下表1中在形成胶束后，与有效量的囊泡形成脂质混合，以形成包含药物的脂质体本发明有用的脂质包括预先制备的中性脂质体，粉末状的脂质，PEG-DSPE或者氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)囊泡形成脂质的选择应使提供外层的脂质组成的最终复合物具有特定程度的流动性或刚性磷脂，如磷脂酰胆碱(PC)或者磷脂酰乙醇胺(PE)，其中碳链长度为14-22，并具有一个或多个双键C＝C本发明中优选使用的脂质是胆固醇(1-60％)、40-90％的氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、以及1-7％的衍生化囊泡形成脂质PEG-DSPE脂质体提供外脂质双层表面，其包敷有亲水性聚合物PEGPEG链具有1000-5000道尔顿的分子量其他亲水性聚合物包括透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、DSPE、羟乙基纤维素、和聚天冬酰胺PEG-DSPC和PEG-HSPC可由Syngena商购得到在与囊泡形成脂质混合前，可通过本领域已知的方法除去乙醇或者其他有机溶剂，例如由渗透膜中透析胶束诊断和治疗方法我们要求保护患者如哺乳动物例如小鼠、大鼠、猿猴和人的治疗方法，这些患者患有人癌，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫颈癌、头和颈部鳞状细胞癌在一个方面中，本发明还要求保护静脉注射包胶在脂质体中的顺铂，以及经包胶的顺铂与阿霉素、氟脱氧尿嘧啶核苷、博来霉素、长春碱、泼尼松、长春新碱、紫杉醇组合，或者与放射疗法联合使用，或者与包胶的寡核苷酸、具有抗癌性质的核酶以及多种抗肿瘤基因组合，所述基因包括但不限于p53/Pax5/HSV-tk基因我们的方法由两个主要部分组成(i)能够靶向癌细胞，(ii)杀死癌细胞的有效性因此，本发明还提供向细胞中转运顺铂或者其他治疗剂的方法，包括使细胞与通过本发明的方法得到的包胶药物相接触本发明还提供抑制患者中肿瘤生长的方法，其包括向所述患者给药有效量的通过本发明的方法得到的包胶药物根据脂质/胶束制剂的组成，本发明还要求保护通过静脉给药有效量的包胶药物靶向实体瘤和转移瘤的方法以及渗透细胞的方法包胶药物，其中胶束包含游离的融合肽或者融合肽-脂质缀合物上述方法可在体外、活体外或体内实施体外实施所述方法涉及除去肿瘤活体组织或者培养包含肿瘤细胞的细胞样品最终脂质体复合物或者在顺铂包胶期间产生的任何中间产物(如图lA所示的胶束)在适合细胞内掺入药物的条件下与细胞培养物接触体外方法可用作确定个体患者的最佳药物治疗的筛选方法抑制细胞生长或者增殖表明细胞或者肿瘤适合用该治疗方法处理各治疗中有效量的药物随待治疗的肿瘤以及待治疗的患者而变化本领域普通技术人员可经验性地确定有效量当给药于动物时，本发明的方法用于进一步证实药物或者治疗方法对各肿瘤类型的效力以合适的动物模型为例，多组SCID小鼠或者无毛鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)可皮下接种约105-109个癌细胞或者靶细胞当肿瘤确立后，给药脂质体在此所用术语“给药、转运”是指包括任何最终向肿瘤提供药物/脂质体复合物的方法其例子包括但不限于局部给药、静脉给药、非胃肠道给药、或者在肿瘤周围皮下注射测定肿瘤尺寸减小的肿瘤测量是使用venier夹(caplier)在两个方向上一周测量两次来进行对于体内给药，药物组合物优选通过非胃肠道途径给药，例如静脉、腹膜内、皮下、鞘内、注射入脊髓中、肌肉内、动脉内、门静脉注射或者肿瘤内更优选的是，药物组合物以团块注射剂通过静脉或者肿瘤内途径给药在另一个方法中，药物组合物可通过直接将制剂施用在组织上而与目标组织接触给药可通过局部“开放”或者“封闭”方法进行对于“局部”而言，其是指药物制剂直接施用在暴露于环境中的组织上，如皮肤、鼻咽道、外耳道、眼睛其包括切开患者的皮肤，并直接肉眼观察施用药物制剂的下层组织这通常是通过手术法来实现的，例如接近肺部的胸廓切开术、接近腹部内脏的剖腹术、或者接近目标组织的其他直接手术法“封闭”法是侵入方法，其中不直接肉眼观察内部目标组织，而是经过皮肤中的小伤口插入仪器例如，可通过冲洗针向腹膜给药制剂同样，可在腰部穿刺期间通过输液向脑膜或者脊髓给药药物制剂，然后如脊柱麻醉或者脊髓metrazamide成像那样对患者进行定位或者，制剂可通过内镜装置给药体内给药可在治疗过程中连续或者间断地以一个剂量进行确定最有效的给药装置和剂量的方法对于本领域技术人员而言是众所周知的，而且可根据治疗所用的组合物、治疗目的、待治疗的靶细胞、以及待治疗的患者而变化可根据治疗医生所选择的剂量水平和方案进行单次或多次给药本领域技术人员可经验性地确定给药的合适剂型及方法本发明的药物及组合物可用于制备药物或者根据常规方法进行给药用于治疗人和其他动物，例如在药物组合物中的活性成分理想的情况是，药物/脂质制剂的给药应在疾病部位产生峰值浓度的活性化合物这可例如通过静脉注射药物/脂质制剂来实现所希望的血药浓度可通过连续输液来维持，以在疾病组织中提供治疗量的活性成分使用可操作性的组合也在本发明的范围内，以使组合治疗所需要的各组分的总剂量低于各单个治疗化合物或者药物单独使用时的总剂量，并由此降低副作用虽然可单独给药药物/脂质制剂，但优选以包含至少一种活性成分、以及任选其他治疗剂的药物制剂进行给药各载体在与制剂的其他成分相容而且对或者没有损害性方面必须是“可接受的”设计第三代向实体瘤转运抗癌药物和基因的载体是由于在5个方面对现有技术进行了改进的结果(1)在无菌稳定的脂质体中包胶抗癌药物成倍地降低了它们的毒性预期这可结束进行化疗的癌症患者的梦魇目前使用的大多数抗癌药物具有严重的副作用，如头发脱落、呕吐、体重减轻、导致梗塞，而且对肾、脑、肝和所有其他活组织产生损坏作用在此所述的抗癌药物隐藏在脂质双层的腔中，对于大多数组织是不可见的，并浓集在目标肿瘤中，而不是在身体的各个组织中在被实体瘤吸收后，它们对癌细胞发挥具体的细胞毒性作用，不损坏正常细胞(2)靶向整个身体中的实体瘤以及它们的转移瘤超过95％的癌症患者死于与转移瘤有关的并发症，而不是死于原位癌我们的基因及药物给药系统被设计成在静脉内给药基因和药物子弹后侵入免疫系统中，不仅到达动物和人体中的原位瘤，而且还到达各转移瘤，无论肿瘤的大小其是基于携带药物和基因的载体具有长的循环时间，并从肿瘤的血管上皮外渗，这是因为在初始形成阶段(生长肿瘤中血管形成)的不完善和泄漏，而且还因为正在生长的实体瘤与正常身体组织之间存在静压差本发明的脂质体在内脂质层和外脂质层之间具有不同的组成，使得可有效包胶并靶向肿瘤(3)癌细胞吸收脂质体子弹脂质体子弹能够促进与细胞膜的融合另外研制的类似的“秘密”子弹不能跨越癌细胞的膜屏障(4)对于抗癌药物、寡核苷酸和基因达到接近100％的脂质体包胶率，这是主要的进步其意味着在有效使用药物和基因时仅有最小的损失和成本这也代表在制备抗癌子弹时具有更简单的步骤(5)序列在抗癌子弹中保持基因表达数个月，而不是几天这意味着癌症患者可进行更少的治疗，仅有更少的痛苦其还发挥强的治疗作用，这是因为具有更高水平的抗癌基因表达；在控制弱调节性DNA的情况下设置的相同基因是无效的以下实施例将用于说明而不是限制本发明实施例制备胶束以及脂质包胶的顺铂包胶方法包括以下步骤(A)在至少30％乙醇、0.1M Tris HCl pH7.5中以1∶1-1∶2的摩尔比混合顺铂(粉末或者其他形状)和DPPG(二棕榈酰基磷脂酰甘油)或者其他带负电荷的脂质分子，形成约5mg/ml的最终顺铂浓度顺铂与DPPG之间的摩尔比变化对于靶向不同的组织也是具有治疗价值的(B)在50℃下加热步骤A和B期间，将会产生黄色顺铂粉末沉淀的初始粉末悬浮体转化为凝胶(胶体)形式；在步骤A和B期间顺铂转化为水合形式(水解氯原子，并被结合在铂上的水分子取代)，该形式的顺铂带正电荷，而且是顺铂的活性形式，赋予抗癌活性；在30％的乙醇中，水合顺铂同时与带负电荷的脂质复合为胶束该顺铂-DPPG静电复合物在消除肿瘤方面比游离顺铂具有更好的性质(C)复合物(或者以下步骤D后的最终制剂)在到达目标后由肿瘤细胞膜中通过的性质通过添加使复合物具有该性质的肽和其他分子而进一步提高(D)顺铂-DPPG胶束复合物转化为包胶顺铂-DPPG单层的脂质体(