专利名称：一种流感病毒裂解疫苗及其制备方法流感是由流感病毒引起的全球流行的呼吸道传播疾病，接种流感疫苗是预防流感 的有效手段。传统的流感病毒疫苗包括流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗和流感亚单位 疫苗，这些疫苗均采用肌肉注射方法，不含佐剂。CpG ODN(oligodeoxynucleotides，0DN)是一种含有非甲基化 CpG 二核苷酸序 列的单链寡核苷酸，CpG ODN可以被免疫细胞上I10Il样受体9 (Toll-like receptor 9， TLR-9)所识别，并增强免疫反应。美国Dynavax公司以CpG ODN为佐剂的重组乙肝疫苗在 三期临床研究中显示了优于普通乙肝疫苗的免疫效果，接种两针后抗体阳转率达到95%， 而普通乙肝疫苗接种三针后阳转率为81%。铝佐剂于1拟6年研制成功并普遍应用至今。由于铝佐剂可以吸附抗原，对抗原起 到缓释作用，被普遍应用于蛋白类疫苗的生产。其作用主要是刺激Th2有关抗体产生，增强 体液免疫应答，但近年研究结果表明铝佐剂对于增强细胞免疫应答的作用不是很明显。传统的流感病毒疫苗为流感病毒灭活全病毒疫苗或流感病毒裂解疫苗，成人剂量 是含每型血凝素15微克，儿童剂量是含每型血凝素7. 5微克，由于传统疫苗不含佐剂，而利 用本专利制备的含CpG ODN和铝佐剂的注射型流感病毒裂解疫苗，可以降低抗原用量，增加 疫苗供应能力。以CpG ODN佐剂和铝佐剂制备的流感病毒裂解疫苗目前国内外未见文献报道。
本发明克服了传统流感疫苗的缺陷，提供了一种免疫效果好、可以降低流感病毒 抗原用量的注射型流感病毒裂解疫苗，且可以应付流感大流行。本发明的一种流感病毒裂解疫苗，含有H1NpH3N2和B型流感血凝素、CpG ODN佐剂 和铝佐剂。优选地，所述流感病毒裂解疫苗，每剂含H1Np H3N2和B型流感血凝素各2_10 μ g、 CpG ODN 佐剂 10-100 μ g、铝佐剂 100-1000 μ g。本发明还提供了一种制备上述流感病毒裂解疫苗的方法，包括鸡胚增值流感疫 苗，超滤浓缩，离心纯化，裂解，二次纯化，灭活，稀配分装。更具体地，该制备方法包括下述步骤1)鸡胚增值流感疫苗将H1NpH3N2A型流感病毒工作种子分别接种于10日龄健 康鸡胚尿囊腔中，增值流感病毒；2)超滤浓缩分别收集H1Np H3N2、B型流感病毒尿囊液，用截留分子量为100-300kD的超滤膜进行超滤浓缩；3)离心纯化将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过 280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液为纯化的H1N1. H3N2, B型流感病毒液；4)裂解收集纯化的病毒液，经Triton X-100裂解纯化，得到H1N^ H#2、B型流感 病毒裂解液；5) 二次纯化流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒 峰的病毒液为二次纯化液；6)灭活流感病毒二次纯化液经甲醛灭活，得到ΗΛ、H#2、B型流感病毒原液；7)稀配分装根据H1N1和和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按每剂含 H1N1和H3N2和B型流感血凝素各2-10 μ g、CpG单链脱氧核苷酸佐剂10-100 μ g、铝佐剂 100-1000 μ g的配比，分装到预填充注射器，即获得含CpG ODN佐剂的流感裂解疫苗。其中CpG ODN佐剂含有5，-GACGTT-3 ’和/或5 ’ -GTCGTT-3，的特征序列，其中所 述特征序列5’ -GACGTT-3’和5’ -GTCGTT-3’为非甲基化，并且全硫代修饰。非甲基化是指脱氧胞苷(dC)的第5位碳原子未被甲基化。所述铝佐剂直接购买，也可由本公司自制，其有效成分为氢氧化铝。血凝素浓度根据国家药典标准进行检测。本发明的有益效果是利用CpG ODN和铝的佐剂作用，使得可以在降低流感病毒 抗原用量的同时保持高的免疫效果从而可以扩大流感病毒裂解疫苗的生产量，同时本发明 制备的疫苗不含硫柳汞，使用安全性更高。本发明制备的含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒 裂解疫苗，尤其适宜在全球大流感流行威胁下应急增加流感病毒疫苗生产能力，对于保证 公共卫生安全具有重大意义。附1 不同佐剂流感病毒裂解疫苗免疫原性比较。HA代表H1NpH3R和B型流感血 凝素各6 μ g组；HA+AL代表H1N^H3N2和B型流感血凝素各6 μ g+铝佐剂600 μ g组；HA+CpG 代表H1N1, H3N2和B型流感血凝素各6 μ g+CpG佐剂60 μ g组；HA+AL+CpG代表H1N1、H3N2和 B型流感血凝素各6 μ g+铝佐剂600 μ g+CpG佐剂60 μ g组；AL代表600 μ g铝佐剂对照组； CpG代表60 μ gCpG对照组。将H1Np H3N2, B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔 中，置34°C，将H1NpH讽、B型分别培养48、48和72小时；2)超滤浓缩将鸡胚置于4°C冷库过夜，分别收集H1NpH3Rj型流感病毒尿囊液，共得到流感病 毒液23500毫升，分别将尿囊液经6000rpm离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的 超滤膜浓缩至300毫升；3)离心纯化将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过^Onm紫外监 测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共200毫升；4)裂解分别将纯化的H1Np H讽、B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为 0. 5% (g/ml)，震摇裂解120分钟；5) 二次纯化病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过^Onm紫外监测，收集有病毒峰的 病毒液分别获得H1Np H3N2、B型病毒液为二次纯化液，共250毫升；6)灭活流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50 μ g/ml，灭活M小时，灭活后得氏&、 H3N2, B型病毒原液，共460ml ；7)稀配分装根据H1N1和HW2和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1 和H3N2和B型流感血凝素各2 μ g、CpG ODN佐剂10 μ g、铝佐剂100 μ g的配比，分装到预填 充注射器中，即获得含CpGODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗。实施例21)鸡胚增值流感病毒将H1Np H3N2, B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔 中，置34°C，将H1NpH讽、B型分别培养48、48和72小时；2)超滤浓缩将鸡胚置于4°C冷库过夜，分别收集H1NpH3Rj型流感病毒尿囊液，共得到流感病 毒液23000毫升，分别将尿囊液经6000rpm离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的 超滤膜浓缩至320毫升；3)离心纯化将超滤浓缩浓缩后的流感病毒液经蔗糖密度梯度离心纯化，通过 280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共220毫升；4)裂解分别将纯化H1Np H3N2, B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为 0. 5% (g/ml)，震摇裂解120分钟；5) 二次纯化病毒裂解液经蔗糖密度梯度离心纯化，通过^Onm紫外监测，收集有 病毒峰的病毒液分别获得H1NpH3NyB型病毒液为二次纯化液，共230毫升；6)灭活流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50 μ g/ml，灭活M小时，灭活 后得H1N^ H3N2, B型病毒原液，共450ml ；7)稀配分装根据H1N1和和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各4 μ g、CpG ODN佐剂30 μ g、铝佐剂300 μ g的配比，分装到预填 充注射器中，即获得含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗。实施例31)鸡胚增值流感病毒将H1Np H3N2, B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔 中，置34°C，将H1NpH讽、B型分别培养48、48和72小时；2)超滤浓缩将鸡胚置于4°C冷库过夜，分别收集H1NpH3Rj型流感病毒尿囊液，共得到流感病 毒液22500毫升；分别将尿囊液经6000rpm离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的 超滤膜浓缩至340毫升；3)离心纯化将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过 280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共230毫升；4)裂解分别将纯化的H1Np H讽、B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为 0. 5% (g/ml)，震摇裂解120分钟；5) 二次纯化流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过^Onm紫外监测， 收集有病毒峰的病毒液分别获得H1NpH3N2J型病毒液为二次纯化液，共240毫升；6)灭活流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50 μ g/ml灭活M小时，灭活 后得H1N1, H3N2, B型病毒原液，共380ml ；7)稀配分装根据H1N1和和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1 和H3N2和B型流感血凝素各6 μ g、CpG ODN佐剂60 μ g、铝佐剂600 μ g的配比，分装到预填 充注射器中，即获得含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗。实施例41)鸡胚增值流感病毒将H1Np H3N2, B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔 中，置34°C，将H1NpH讽、B型分别培养48、48和72小时；2)超滤浓缩将鸡胚置于4°C冷库过夜，分别收集HiNpH^^B型流感病毒尿囊液，得到流感病毒 液23000毫升，分别将尿囊液经6000g离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的超滤 膜浓缩至300毫升；3)离心纯化将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过 280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共230毫升；4)裂解分别将纯化的H1Np H讽、B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为 0. 5% (g/ml)，震摇裂解120分钟；5) 二次纯化流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过^Onm紫外监测， 收集有病毒峰的病毒液分别获得H1NpH3N2J型病毒液为二次纯化液，共240毫升；6)灭活流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50 μ g/ml灭活M小时，灭活后 得ΗΛ、H3N2, B型病毒原液，共400ml，将以上步骤分别得到的H1N1, H3N2, B型流感病毒原液 混合；67)稀配分装根据H1N1和和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1 和H3N2和B型流感血凝素各8 μ g、CpG ODN佐剂80 μ g、铝佐剂800 μ g的配比，分装到预填 充注射器中，即获得含CpGODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗。实施例51)鸡胚增值流感病毒将H1N^ H3N2, B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔 中，置34°C，将H1NpH讽、B型分别培养48、48和72小时；2)超滤浓缩将鸡胚置于4°C冷库过夜，分别收集H1NpH3Rj型流感病毒尿囊液，共得到流感病 毒液2观00毫升；分别将尿囊液经6000rpm离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的 超滤膜浓缩至300毫升；3)离心纯化将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过 280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共220毫升；4)裂解分别将纯化的H1Np H讽、B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为 0. 5% (g/ml)，震摇裂解120分钟；5) 二次纯化流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过^Onm紫外监测， 收集有病毒峰的病毒液分别获得H1NpH3NyB型病毒液为二次纯化液，共230毫升；6)灭活流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50 μ g/ml，灭活M小时，灭活 后得H1N1, H3N2, B型病毒原液，共380ml ；7)稀配分装根据H1N1和和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1 和H3N2和B型流感血凝素各10 μ g、CpG ODN佐剂100 μ g、铝佐剂1000 μ g的配比，分装到 预填充注射器中，即获得含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗。实施例6-91)鸡胚增值流感病毒将H1Np H3N2, B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔 中，置34°C，将H1NpH讽、B型分别培养48、48和72小时；2)收获流感病毒，超滤浓缩将鸡胚置于4°C冷库过夜，分别收集H1NpH3Rj型流感病毒尿囊液，共得到流感病 毒液22500毫升；尿囊液经6000rpm离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的超滤膜 浓缩至340毫升；3)离心纯化将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过 280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共230毫升；4)裂解分别将纯化ΗΛ、H3N2, B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为 0. 5% (g/ml)，震摇裂解120分钟；5) 二次纯化流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过^Onm紫外监测， 收集有病毒峰的病毒液分别获得H1NpH3N2J型病毒液为二次纯化液，共240毫升；6)灭活流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50 μ g/ml，灭活M小时，灭活后得H1N1, H3N2, B型病毒原液，共380ml ；7)稀配分装根据H1N1和H3N2和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照下列配比 稀配流感病毒裂解疫苗 ①每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6 μ g ；②每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6 μ g、铝佐剂600 μ g ；③每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6 μ g、CpG ODN佐剂60 μ g ；④每剂含H1N1和HJ2和B型流感血凝素各6 μ g、CpG ODN佐剂60 μ g、铝佐剂 600 μ g。将稀配的样品分装到预填充注射器中，即获得不含或含不同佐剂的流感病毒裂解疫苗。实验例1 免疫原性检测1、流感病毒疫苗的动物免疫原性检测采用SPF级小鼠作为动物模型，对实施例1-5制备的流感病毒裂解疫苗与市售的 流感病毒裂解疫苗进行了小鼠免疫原性比较，试验设计如下实施例1-5制备的流感病毒裂解疫苗与市售的流感病毒裂解疫苗对小鼠采用腹 腔接种的方式，每组10只小鼠，0. 2ml/只接种，于接种后21天采血分离血清，测定小鼠免疫 前免疫后血清中对H1N1、H3N2、B型流感病毒的血凝抑制抗体滴度，计算每只小鼠(免后血 凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)的比值，并计算每组小鼠(免后血凝抑制抗体/免前血 凝抑制抗体)比值的几何平均滴度。表1 流感病毒疫苗小鼠免疫原性结果比较免疫组别(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)几何平均数H1N1 型H3N2 型B型流感病毒裂解疫苗5.375.184.57实施例16.696.325.57实施例28.388.387.92实施例316.7616.0914.98实施例413.0312.311.53实施例513.0212.0711.42结果显示本发明制备的含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗的免疫原性优 于市售的流感病毒裂解疫苗的免疫原性，说明本发明制备的含CpG ODN和铝佐剂的流感病 毒裂解疫苗适宜于预防流行性感冒。2、不同佐剂流感病毒裂解疫苗佐剂作用比较采用SPF级小鼠作为动物模型，对实施例6-9制备的含不同佐剂的流感病毒裂解 疫苗的佐剂作用进行了小鼠免疫原性比较，试验设计如下实施例6-9制备的不同佐剂流感病毒裂解疫苗对小鼠采用腹腔接种的方式，每组 10只小鼠，0. 2ml/只接种，于接种后21天采血分离血清，测定小鼠免疫前免疫后血清中对H1Np H3N2, B型流感病毒的血凝抑制抗体滴度，计算每只小鼠(免后血凝抑制抗体/免前血 凝抑制抗体)的比值，并计算每组小鼠(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)比值的 几何平均滴度，同时设60 μ g CpG ODN佐剂对照组和600 μ g铝佐剂对照组。试验结果显示以CpG ODN和铝佐剂为双佐剂的流感病毒裂解疫苗的免疫原性明 显优于以CpG ODN为佐剂或以铝为佐剂或不加佐剂的流感病毒裂解疫苗的免疫原性。实验例2 流感病毒疫苗的动物安全性检测采用清洁级豚鼠作为动物模型，对实施例1-5制备的流感病毒裂解疫苗进行了豚 鼠安全性检查，试验设计如下(1)实施例1-5制备的流感病毒裂解疫苗、PBS阴性对照和胎牛血清阳性对照对豚 鼠隔日每只每次腹腔注射0. 5ml，共3次，进行致敏，每组6只。(2)首次致敏和激发前称量并记录每只动物体重，然后将其分为2组，每组3只， 分别在首次注射后第14日和第21日，由静脉每只注射供试品Iml进行激发。观察激发后 30分钟内动物有无过敏反应，记录抓鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、抽搐、大小便失常、休克、死
亡等过敏症状。2、流感病毒疫苗豚鼠过敏原性检测结果表2 过敏原性检测实验结果


本发明提供一种流感裂解疫苗及其制备方法，该流感裂解疫苗中每剂含H1N1、H3N2和B型三种流感血凝素、CpG ODN佐剂、铝佐剂。本发明还提供了该流感疫苗的制备方法，包括以下步骤鸡胚增值流感疫苗，超滤浓缩，离心纯化，裂解，二次纯化，灭活，稀配分装。本发明提供的流感病毒裂解疫苗可以降低流感病毒抗原用量、降低流感疫苗生产成本，适宜在全球大流感流行威胁下迅速提高流感疫苗供应能力。