专利名称：鱼腥草冻干粉针剂的制备方法鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的全草，始载于《名医别录》。味辛、性凉，具清热解毒，削痈排脓、利尿通淋等功效。因具有抗菌、抗病毒、抗炎止痛、利尿等作用，而广范应用于临床，现代药理学研究表明，鱼腥草的作用为1.呼吸系统疾病的应用；2.消化道系统疾病的应用；3.泌尿系统疾病的应用；4.妇科、五官科、肿瘤及其他疾病的应用。鱼腥草有效成分主要为挥发油中的鱼腥草素，其易于聚合失效，常被制成亚硫酸钠加成物，但鱼腥草素水溶液易浑浊，甚至出现油状物，其在水中溶解性能较差，且不稳定。而辅料2-羟丙基-β-环糊精能与多种化合物形成包合物，可增强药物的稳定性，提高溶解度及溶出度，降低药物挥发性，掩盖不良气味。与β-环糊精相比，2-羟丙基-β-环糊精的水溶性高，热稳定性好，溶血作用降低。因此，采用2-羟丙基-β-环糊精对鱼腥草挥发油进行包合较为理想。申请号为200410046098.0的专利公开了一种鱼腥草冻干粉针剂的制备方法从中药鱼腥草提取的挥发油，用2-羟丙基-β-环糊精进行一次包合，再与药用辅料混合制成冻干粉针剂。采用该工艺方法制备的冻干粉针剂，具有一定的效果，但由于采用环糊精进行一次包合的方法，所以其稳定性相对较差，有效成分含量还需提高，药理作用有待进一步加强。
本发明的目的在于提供一种鱼腥草冻干粉针剂的制备方法，本发明在现有技术的基础上，用2一羟丙基-β-环糊精对鱼腥草挥发油及芳香水进行两次包合，将制备工艺进行了优化，以提高该制剂的有效成分含量，增加其稳定性、溶解度、溶出度及生物利用度，并加强其药理作用。本发明鱼腥草冻干粉针剂的制备方法为它包括以下步骤(1)取新鲜的鱼腥草全草，净选，除去腐叶、杂草、异物、泥沙、将其剪碎，用水蒸气蒸馏法提取，收集初蒸馏液；(2)称取2-羟丙基-β-环糊精，以10ml/g～100ml/g的比例加入注射用水，加热使其溶解，冷却至室温，初蒸馏液体积与2-羟丙基-β-环糊精按1ml∶1g～1ml∶20g的比例加入超声波洗涤器超声20～240分钟，得到含有鱼腥草提取物与2-羟丙基-β-环糊精的包合物溶液；冷却至室温，冷藏，静置过夜；经高速离心机离心，过滤，得滤液； (3)将所得的滤液进行重蒸馏，收集重蒸馏液；(4)称取2-羟丙基-β-环糊精，以10ml/g～100ml/g的比例加入注射用水，加热使其溶解，冷却至室温，重蒸馏液体积与2-羟丙基-β-环糊精按1ml∶1g～1ml∶10g的比例加入超声波洗涤器超声20～90分钟，得到重蒸馏液与2-羟丙基-β-环糊精的包合物溶液；冷却至室温，冷藏，静置过夜；经高速离心机离心，过滤，得滤液；(5)所得滤液加入适量的赋形剂和等渗剂，并加入注射用水溶解完全，用PH值调节剂将PH调至4～9，再用0.25μm的滤芯过滤，滤液注入西林瓶中，经冷冻干燥，得到鱼腥草冻干粉针剂。其中，冷冻干燥过程为将西林瓶置于低温冰箱中预冻至-30～-40℃，速转入冷冻干燥箱内，待制品温度达到-20℃时保持1～2小时，开启真空泵；当真空度达7.0～10Pa时开始对搁板加热升温，在-15℃保持2～3小时，在-10℃保持1～2小时，待肉眼看不见包合物冰晶存在时，将搁板升温至30℃，保持2～3小时；冻干结束后，出箱封口，即得鱼腥草冻干粉针剂。所用的赋形剂为甘露醇、乳糖、葡萄糖、木醇糖或葡聚糖，用量为50～100g/100ml溶液。
所用的等渗剂为氯化钠、葡萄糖、木醇糖、葡聚糖、甘露醇和乳糖中的一种或几种，用量为0.9～30g/100ml溶液。
所用的PH值调节剂为稀盐酸、碳酸氢钠、枸橼酸或氢氧化钠溶液。
由于鱼腥草在蒸馏时只有一部分的挥发油从初蒸馏液中蒸馏出来，剩余的部分留在蒸馏液中，对挥发油进行一次包合则不能对蒸馏液中的挥发油进行充分、完全的包合，容易造成不必要的挥发油损失，因而本发明对鱼腥草挥发油及芳香水进行二次包合，其目的在于挥发油有少量溶解在水中，对挥发油及芳香水(初蒸馏液)进行第一次包合是先对挥发油和芳香水进行大部分的包合，得到的包合物进行滤过，未包合的挥发油及芳香水再次进行包合，从而提高制剂中挥发油含量，增强其稳定性和制剂的临床疗效。
本申请人进行了一系列的实验研究，以证明本发明制备方法的科学性、合理性和优越性。
一、检测分析1.试药和试剂本发明的鱼腥草冻干粉针剂，用2-羟丙基-β-环糊精一次包合的鱼腥草冻干粉针剂和市售鱼腥草注射液(江西银涛药业有限公司生产，生产批号为20050417)，其他试剂均为分析纯。仪器Agilent6890(美国安捷伦公司)，电子分析天平，挥发油提取器，试剂甲基正壬酮(中国药品生物制品检定提供)，其他试剂均为分析纯。
2.检测方法将本发明的鱼腥草冻干粉针剂与2-羟丙基-β-环糊精一次包合的鱼腥草冻干粉针剂直接用注射用水溶解成和市售鱼腥草注射液密度相同的溶液，再按照标准编号WS3-B-3264-98鱼腥草射液中的检测分析项进行检测分析。即色谱条件与系统适用性试验以硅酮(OV-17)为固定相，涂布浓度为9％；柱温为150℃，用氢火焰离子化检测器检测，正十五烷为内标，理论塔板数按甲基正壬酮峰计算应不低于1000；甲基正壬酮峰与内标物质峰的分离度应大于2.5。
校正因子测定取正十五烷适量，用正己烷溶解并稀释成每1ml含20μg的溶液，摇匀，作为内标溶液。另取甲基正壬酮对照品适量，精密称定，用正己烷溶解并稀释成每1ml含20μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。精密量取用碳酸氢钠饱和的蒸馏水100ml置分液漏斗中，精密加入对照品溶液和内标溶液各5ml，密塞，振摇5分钟，静置待分层，分取有机层，缓缓滴加无水乙醇5滴以破乳，取上清液5μl注入气相色谱仪，计算校正因子。
测定法取本品150ml加碳酸氢钠使饱和，精密量取上清液100ml，置250ml分液漏斗中，精密加入正己烷5ml、内标溶液5ml，密塞，振摇5分钟，静置使分层，分取有机层，缓慢滴加无水乙醇5滴以破乳，取上清液5μl注入气相色谱仪，测定，计算，即得。
本品每1ml含甲基正壬酮(C11H22O)不得少于0.8μg。
3.结果按照上述方法进行检测分析，计算结果见表1

结论通过上述检测分析实验可知，本发明鱼腥草冻干粉针剂的有效成分含量明显提高，充分说明本发明工艺方法具有实际意义。
二、定性实验1.仪器、试药和试剂(1)仪器Agilent6890(美国安捷伦公司)、电子分析天平、挥发油提取器(2)试剂甲基正壬酮(中国药品生物制品检定提供)，其他试剂均为分析纯。
(3)试药本发明鱼腥草冻干粉针剂，市售鱼腥草注射液(江西银涛药业有限公司)，2-羟丙基-β环糊精一次包合的鱼腥草冻干粉针剂。
2.实验方法采用加速实验方法进行，将市售鱼腥草注射液和本发明鱼腥草冻干粉针剂放置在室温37℃，相对湿度为75％的条件下保存，每月进行一次检测分析，连续3个月。
3.实验结果见表2表2 各组制剂的含量变化

结论通过上述稳定性实验可知，本发明鱼腥草冻干粉针剂的含量在3个月内变化较小，市售鱼腥草注射液的含量变化较大，而其他方法用2-羟丙基-β-环糊精一次包合的鱼腥草冻干粉针剂含量变化次之，说明本发明鱼腥草冻干粉针剂的稳定性较好。
三、本发明鱼腥草提取物的包合方法和2-羟丙基-β-环糊精一次包合的包合率、包结率的比较实验方法(1)取用本发明工艺2-羟丙基-β-环糊精包合的鱼腥草包合物置圆底烧瓶中，加入蒸馏水150ml及少许沸石蒸馏4h，用挥发油测定器提取挥发油，待冷却30min后测定挥发油体积，进行三次实验。
(2)取本发明工艺的鱼腥草提取物，将其按本发明包合工艺与其他方法用2-羟丙基-β-环糊精包合后按照方法(1)进行实验。
Δ包结率＝(回收的挥发油体积/加入的挥发油体积×空白回收率)×100％[空白回收率分别为(1)92.3％(2)92.4％]Δ包合率＝[包合物的重量/(2-羟丙基-β-环糊精的重量+加入的挥发油的重量)]×100％。根据公式计算，见表3表3 包合物包合率、包结率的比较

结论本发明工艺制备的2-羟丙基-β-环糊精包合物与其他方法用2-羟丙基-β-环糊精包合物比较，其包合率和包结率均有明显提高，充分说明本发明工艺具有实际意义。
四、药理作用抑菌作用研究1.实验药物本发明鱼腥草冻干粉针剂、市售鱼腥草注射液(江西银涛药业有限公司)2.实验菌种金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)大肠杆菌(Escherichiacoli)枯草杆菌(Bacillussubitilis)青霉素(Penicilliumsp)黑曲霉(Aspergillusniger)啤酒酵母菌(Saccaromycescervisiae)上述菌种均由北京大学微生物教研室提供。
3.实验方法(1)滤纸片法测定抑菌作用取直径6mm的滤纸片，放入药物中浸泡16h，120℃下湿热灭菌备用。将上述供试菌液各取0.5ml与相应固体培养基，在超净工作台内制成含菌平板，取含浸出汁的滤纸片贴在含菌平板上，每皿贴5片，每菌做3次重复，细菌置37℃、霉菌及酵母菌置27℃的生化培养箱内培养48h，测定24h、48h后滤纸片的抑菌圈大小，比较抑菌效果。结果见表4。
(2)最低抑菌浓度(Mic)测定配制上述菌种分别所需的培养基，准确量取9ml分装试管，准确加入8％、4％、2％、1％、0.5％、0.25％药物系列浓度溶液1ml，配成系列培养基，120℃高压湿热灭菌，冷却后，每系列接种一个菌种，每系列做3次重复，细菌置37℃、霉菌及酵母菌置27℃的生化培养箱内培养48h，观察菌种生长情况，以完全没有菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度，见表5。
表4 对供试菌种的抑制效果

表5 最低抑制浓度

结论通过上述药理实验表明，本发明鱼腥草冻干粉针剂与市售鱼腥草注射液及其他方法用2-羟丙基-β-环糊精一次包合的鱼腥草冻干粉针剂比较具有更好的药理作用。
与现有技术相比，本发明所提供的制备方法用2-羟丙基-β-环糊精对鱼腥草挥发油及芳香水进行两次包合，实现了对鱼腥草挥发油充分、完全的包合，避免了不必要的挥发油损失，将制备工艺进行了优化，从而提高了挥发油含量和该制剂的稳定性、溶解度、溶出度及生物利用度，具有更好的药理作用和临床疗效。

本发明的实施例2(1)称取新鲜鱼腥草全草100kg，净选，除去腐叶、杂草、异物、泥沙、将其剪碎，用水蒸气蒸馏法提取，收集初蒸馏液；(2)称取2-羟丙基-β-环糊精，以30ml/g的比例加入注射用水，加热使其溶解，冷却至室温，初蒸馏液体积与2-羟丙基-β-环糊精按1ml∶5g的比例加入超声波洗涤器超声60分钟，得到含有鱼腥草提取物与2-羟丙基-β-环糊精的包合物溶液；冷却至室温，冷藏，静置过夜；经高速离心机离心(2500转/分钟)，过滤，得滤液；(3)将所得的滤液进行重蒸馏，收集重蒸馏液；(4)称取2-羟丙基-β-环糊精，以30ml/g的比例加入注射用水，加热使其溶解，冷却至室温，重蒸馏液体积与2-羟丙基-β-环糊精按1ml∶3g的比例加入超声波洗涤器超声40分钟，得到重蒸馏液与2-羟丙基-β-环糊精的包合物溶液；冷却至室温，冷藏，静置过夜；经高速离心机离心(2500转/分钟)，过滤，得滤液；(5)所得滤液加入赋形剂(乳糖)70g/100ml和等渗剂(氯化钠)15g/100ml，并加入注射用水溶解完全，用稀盐酸将PH调至6.0，再用0.25μm的滤芯过滤；(6)滤液灌装于西林瓶中，置于低温冰箱中预冻至-33℃，速转入冷冻干燥箱内，在温度达到-20℃保持1.5小时，开启真空泵；当真空度达8.0Pa时开始对搁板加热升温，在-15℃保持2.5小时，在-10℃保持1.5小时，待肉眼看不见包合物冰晶存在时，将搁板升温至30℃，约保持2.5小时；冻干结束后，出箱封口，即得鱼腥草冻干粉针剂。
本发明的实施例3(1)称取新鲜鱼腥草全草150kg，净选，除去腐叶、杂草、异物、泥沙、将其剪碎，用水蒸气蒸馏法提取，收集初蒸馏液；(2)称取2-羟丙基-β-环糊精，以50ml/g的比例加入注射用水，加热使其溶解，冷却至室温，初蒸馏液体积与2-羟丙基-β-环糊精按1ml∶10g的比例加入超声波洗涤器超声120分钟，得到含有鱼腥草提取物与2-羟丙基-β-环糊精的包合物溶液；冷却至室温，冷藏，静置过夜；经高速离心机离心(3000转/分钟)，过滤，得滤液；(3)将所得的滤液进行重蒸馏，收集重蒸馏液；(4)称取2-羟丙基-β-环糊精，以50ml/g的比例加入注射用水，加热使其溶解，冷却至室温，重蒸馏液体积与2-羟丙基-β-环糊精按1ml∶5g的比例加入超声波洗涤器超声60分钟，得到重蒸馏液与2-羟丙基-β-环糊精的包合物溶液；冷却至室温，冷藏，静置过夜；经高速离心机离心(3000转/分钟)，过滤，得滤液；(5)所得滤液加入赋形剂(木醇糖)80g/100ml和等渗剂(葡萄糖)20g/100ml，并加入注射用水溶解完全，用枸橼酸将PH调至7.0，再用0.25μm的滤芯过滤；(6)滤液灌装于西林瓶中，置于低温冰箱中预冻至-35℃，速转入冷冻干燥箱内，在温度达到-20℃保持1.5小时，开启真空泵；当真空度达8.5Pa时开始对搁板加热升温，在-15℃保持2.5小时，在-10℃保持1.5小时，待肉眼看不见包合物冰晶存在时，将搁板升温至30℃，约保持2.5小时；冻干结束后，出箱封口，即得鱼腥草冻干粉针剂。
本发明的实施例4(1)称取新鲜鱼腥草全草200kg，净选，除去腐叶、杂草、异物、泥沙、将其剪碎，用水蒸气蒸馏法提取，收集初蒸馏液；(2)称取2-羟丙基-β-环糊精，以80ml/g的比例加入注射用水，加热使其溶解，冷却至室温，初蒸馏液体积与2-羟丙基-β-环糊精按1ml∶15g的比例加入超声波洗涤器超声180分钟，得到含有鱼腥草提取物与2-羟丙基-β-环糊精的包合物溶液；冷却至室温，冷藏，静置过夜；经高速离心机离心(3500转/分钟)，过滤，得滤液；(3)将所得的滤液进行重蒸馏，收集重蒸馏液；(4)称取2-羟丙基-β-环糊精，以80ml/g的比例加入注射用水，加热使其溶解，冷却至室温，重蒸馏液体积与2-羟丙基-β-环糊精按1ml∶7g的比例加入超声波洗涤器超声80分钟，得到重蒸馏液与2-羟丙基-β-环糊精的包合物溶液；冷却至室温，冷藏，静置过夜；经高速离心机离心(3500转/分钟)，过滤，得滤液；(5)所得滤液加入赋形剂(甘露醇)90g/100ml和等渗剂(木醇糖)25g/100ml，并加入注射用水溶解完全，用碳酸氢钠溶液将PH调至8.0，再用0.25μm的滤芯过滤；(6)滤液灌装于西林瓶中，置于低温冰箱中预冻至-38℃，速转入冷冻干燥箱内，在温度达到-20℃保持2小时，开启真空泵；当真空度达9.0Pa时开始对搁板加热升温，在-15℃保持3小时，在-10℃保持2小时，待肉眼看不见包合物冰晶存在时，将搁板升温至30℃，约保持3小时；冻干结束后，出箱封口，即得鱼腥草冻干粉针剂。
本发明的实施例5(1)称取新鲜鱼腥草全草300kg，净选，除去腐叶、杂草、异物、泥沙、将其剪碎，用水蒸气蒸馏法提取，收集初蒸馏液；(2)称取2-羟丙基-β-环糊精，以100ml/g的比例加入注射用水，加热使其溶解，冷却至室温，初蒸馏液体积与2-羟丙基-β-环糊精按1ml∶20g的比例加入超声波洗涤器超声240分钟，得到含有鱼腥草提取物与2-羟丙基-β-环糊精的包合物溶液；冷却至室温，冷藏，静置过夜；经高速离心机离心(4000转/分钟)，过滤，得滤液；(3)将所得的滤液进行重蒸馏，收集重蒸馏液；(4)称取2-羟丙基-β-环糊精，以100ml/g的比例加入注射用水，加热使其溶解，冷却至室温，重蒸馏液体积与2-羟丙基-β-环糊精按1ml∶10g的比例加入超声波洗涤器超声90分钟，得到重蒸馏液与2-羟丙基-β-环糊精的包合物溶液；冷却至室温，冷藏，静置过夜；经高速离心机离心(4000转/分钟)，过滤，得滤液；(5)所得滤液加入赋形剂(葡聚糖)100g/100ml和等渗剂(葡聚糖和乳糖)30g/100ml，并加入注射用水溶解完全，用氢氧化钠溶液将PH调至9.0，再用0.25μm的滤芯过滤；(6)滤液灌装于西林瓶中，置于低温冰箱中预冻至-40℃，速转入冷冻干燥箱内，在温度达到-20℃保持2小时，开启真空泵；当真空度达10.0Pa时开始对搁板加热升温，在-15℃保持3小时，在-10℃保持2小时，待肉眼看不见包合物冰晶存在时，将搁板升温至30℃，约保持3小时；冻干结束后，出箱封口，即得鱼腥草冻干粉针剂。


本发明提供了一种鱼腥草冻干粉针剂的制备方法，从新鲜的中药鱼腥草中提取的挥发油及芳香水，用2－羟丙基－β－环糊精进行两次包合，再与药用辅料混合制备成冻干粉针剂；与现有技术相比，本发明所提供的制备方法实现了对鱼腥草挥发油充分、完全的包合，避免了不必要的挥发油损失，将制备工艺进行了优化，从而提高了挥发油含量和该制剂的稳定性、溶解度、溶出度及生物利用度，具有更好的药理作用和临床疗效。