专利名称：门冬酰胺酶冻干粉针剂及其制备方法以及门冬酰胺酶溶解液的制作方法门冬酰胺酶(也有如下别名L-门冬酰胺酶、天冬酰胺酶、天门冬酰胺酶等)是一种 对肿瘤细胞具有选择性抑制作用的药物，尤其对急性淋巴细胞白血病(ALL)的疗效最好，对 急性粒细胞型白血病、急性单核细胞白血病、恶性淋巴瘤也有一定疗效。门冬酰胺酶(以下简称L-ASP)能将血清中的门冬酰胺水解为门冬氨酸和氨，而门 冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必须的氨基酸，正常细胞有自身合成门冬酰胺的功 能，但是急性白血病等肿瘤细胞无此功能；因而当用L-ASP使门冬酰胺急剧缺失时，肿瘤细 胞因既不能从血液中获取足够的门冬酰胺，亦不能自身合成，就会出现蛋白质合成受障碍， 增殖受抑制的情况，由此肿瘤细胞就会大量破坏而不能生长存活。另外，L-ASP亦能干扰细 胞DNA、RNA的合成，可能作用于细胞Gl增殖周期中，是抑制该期细胞分裂的细胞周期特异 性药。目前，国内临床使用的注射用门冬酰胺酶均采用冻干粉针剂型，主要由日本协和 发酵工业株式会社、美国默克等公司生产，以每支5000单位或10000单位的规格为主。该 注射用门冬酰胺酶冻干粉针剂由门冬酰胺酶和甘露醇组成。注射用无菌粉末使用前应采用 适宜溶剂进行溶解，溶解后应为澄清、透明的溶液。门冬酰胺酶使用时一般采用氯化钠注射 液或葡萄糖注射液溶解。但在临床使用中发现，当门冬酰胺酶稀释液加入到氯化钠或葡萄 糖注射液中时会有微粒析出，且多为Imm以上的细小蛋白质絮状物或蛋白质颗粒，导致可 见异物超标，增加输液对人体的刺激性，对病人生命安全造成威胁。在2006年06期的《海峡药学》第18至19页公开的文献“L-门冬酰胺酶的稳定 性研究”中，对相关问题进行了研究，说明为何L-ASP与含盐输液混合会发生盐析，同时考 虑到10%葡萄糖注射液(GS)含糖量过高，临床应用并不广泛，故选择5%的GS作为L-ASP 的最佳溶媒，具体配置方法如下在每IOOm的1 5%的葡萄糖注射液中加入0. 19mL的5%的 碳酸氢钠溶液以调整溶媒PH值为7. 5，以调整好pH值的葡萄糖注射液作为溶媒与冻干粉针 剂配制L-ASP静脉滴注液，配置好的输液应在4小时内使用完毕，未能及时使用的输液应 低温避光保存。但是由于生产的5%葡萄糖注射液的pH值不确定，且“每IOOml的GS (5% )加入 0. 19mL的5%的NaHCO3，调整溶媒pH值为7.5”的溶媒配置操作繁琐，并不利于实际操作。 同时我们通过实际试验发现，上述单纯靠NaHCO3调节输液的pH值的方法，还是不能解决门 冬酰胺酶在输液中的析出问题。中国专利文献CN100502944C (申请号2005101(^992. X)公开了一种天门冬酰胺酶 注射液，其主要组成是10-80mg的天门冬酰胺酶、2-30mmol/L的L-半胱氨酸、10-30mmol/L磷酸缓冲液、0. 5-5mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和0. 5%-2%的氯化钠；但是注射液 的形式不方便贮存和运输，并且组成中的L-半胱氨酸性质不稳定，而且注射液的保质时间 短，故而该种配方的注射液存在缺陷。
本发明所要解决的是门冬酰胺酶稀释液加入到氯化钠或葡萄糖注射液中时，微细 可见异物超标的问题，为此本发明的第一目的是提供一种临床使用方便、复溶迅速、稳定性 好的门冬酰胺酶冻干粉针剂及其制备方法，本发明的第二目的是提供一种临床使用方便、 复溶迅速、稳定性好的门冬酰胺酶溶解溶剂。实现本发明第一目的的技术方案是本发明的门冬酰胺酶冻干粉针剂包括门冬酰 胺酶和甘露醇，还包括缓冲剂、表面活性剂，其中表面活性剂是非离子型表面活性剂；在制 备所述的门冬酰胺酶冻干粉针剂的过程中具有用作溶剂并最终少于加入量的5%的注射用 水。相对于上述门冬酰胺酶冻干粉针剂中的10000单位门冬酰胺酶来计算，甘露醇为 40 lOOmg，缓冲剂为3 15mg，非离子型表面活性剂为2 8mg ；制备过程中用作溶剂的 注射用水为0. 8 2. 4g。在制备上述门冬酰胺酶冻干粉针剂的过程中，冻干前溶液的PH值为7. 1 7. 5。上述门冬酰胺酶冻干粉针剂所包括的缓冲剂为碳酸氢钠、甘氨酸盐、组氨酸盐或 TRIS-HC1，或者是磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲体系。上述门冬酰胺酶冻干粉针剂所包括的非离子型表面活性剂为泊洛沙姆188、聚氧 乙烯醚(35)蓖麻油、聚乙二醇硬脂酸酯15、吐温20或吐温80。相对于上述门冬酰胺酶冻干粉针剂中的10000单位门冬酰胺酶来计算，甘露醇为 40 80mg，其余成分的加入量为缓冲剂4 6mg，非离子型表面活性剂4 6mg ；制备过程 中用作溶剂的注射用水1. 4 2. 4g。上述门冬酰胺酶冻干粉针剂的制备方法具有以下步骤①将按照处方量 准确称取的甘露醇、缓冲剂、非离子型表面活性剂加入预冷至10°c以下的注射用水 中溶解，再加入氢氧化钠调节溶液PH值为7. 1 7.5 ；②向步骤①得到的溶液中 加入处方量的门冬酰胺酶，混合均勻，用氢氧化钠溶液或盐酸调节PH值为7. 1 7. 5;③向步骤②得到的溶液中加水至处方规定，加水后的溶液用孔径为0. 22 μηι的微孔滤膜过滤除菌而得到滤液；④按每瓶10000单位门冬酰胺酶将步骤③得到的滤液 分装于管制瓶中，半加塞后置于冷冻干燥机中冻干，待干燥后真空压塞，轧盖，贴标签，即得 冻干粉针剂，保存在2 8°C温度下。上述门冬酰胺酶冻干粉针剂的制备方法的步骤④中，滤液分装于相应管制瓶中 半加塞后冻干时，预冻至-25 °C后，保持120min，抽真空，在660min内升华至0 °C，保温 270min,并在150min内升温至25°C，保温MOmin，至门冬酰胺酶冻干粉针剂的水分在5%以 内，从而完成冻干程序。实现本发明第二目的的技术方案是本发明的门冬酰胺酶溶解液的溶剂为注射用 水，溶质包括缓冲剂和非离子型表面活性剂；所述的缓冲剂为碳酸氢钠、甘氨酸盐、组氨酸 盐或TRIS-HC1，或者是磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲体系；所述的非离子型4表面活性剂为泊洛沙姆188、聚氧乙烯醚(35)蓖麻油、聚乙二醇硬脂酸酯15、吐温20或吐 温80。上述门冬酰胺酶溶解液使用时，相对于每10000单位待溶解的门冬酰胺酶冻干粉 针剂，所用门冬酰胺酶溶解液中的缓冲剂为3 15mg，非离子型表面活性剂为2 8mg，溶 剂水为1 15g。本发明具有积极的效果(1)本发明的冻干粉针剂包括在处方中加入的缓冲剂和 非离子型表面活性剂，因而在将少量氯化钠注射液或葡萄糖注射液注入该门冬酰胺酶冻干 粉针剂中而得到含有门冬酰胺酶的混合体系后，再将该混合体系转移到氯化钠或葡萄糖注 射液中时，不会出现微细可见异物超标的情况；使用时减小了对人体的刺激性，提高了临床 用药安全性。(2)本发明的门冬酰胺酶冻干粉针剂临床使用方便、复溶迅速、稳定性好。(3) 本发明制备门冬酰胺酶冻干粉针的工艺简单，生产成本低，适合工业化大生产。(4)本发明 的门冬酰胺酶溶解液，用于已有的门冬酰胺酶冻干粉针剂，先将处方量的本发明的门冬酰 胺酶溶解液注入该已有的冻干粉针剂中，使得其中的门冬酰胺酶溶解在其中后，再转移至 氯化钠或葡萄糖注射液中时，同样不会出现微细可见异物超标的情况。图1为本发明冻干粉针剂的形态图。图2为对照组制成冻干粉针剂后的形态图，其中(a)图为对照组1制成冻干粉针 剂后的形态图，(b)图为对照组2制成冻干粉针剂后的形态图。
本实施例门冬酰胺酶冻干粉针剂的处方如下
门冬酰胺酶1000万单位，泊洛沙姆188 (F68) 4. Og,甘露醇(20%w/v) 300g, 二水合磷 酸二氢钠6. M克，0. lmol/L的NaOH水溶液(适量调节体系的pH为7. 5士0.2)，注射用水 加至2000g，共制成1000支。本实施例门冬酰胺酶冻干粉针剂的制备方法如下
将按照上述处方量准确称取的二水合磷酸二氢钠、泊洛沙姆188 (F68) (CAS号 9003-11-6)、甘露醇(20%w/v)加入300g预冷至10°C以下的注射用水中溶解后，用0. lmol/L 的NaOH调节溶液pH值为7. 3 7. 5 ；再向上述溶液中加入处方量的门冬酰胺酶混合均勻， 用0. lmol/L的NaOH溶液或0. 1 mol/L的HCl调节pH值为7. 3 士 0. 2 (本实施例为7. 5)； 加水至2000g，溶液用0. 22 μηι微孔滤膜过滤除菌；按每瓶2. Og将滤液分装于管制瓶中， 半加塞后置于冷冻干燥机中冻干，待干燥后真空压塞，轧盖，贴标签，即得冻干粉针剂1000 支，保存在2 8°C温度下，并作为样品Si。见图1，所示为按照本实施例处方制得的随机抽取的五支冻干粉针剂，肉眼观察性 状为白色冻干块状物，符合2010年版《中国药典》二部注射用门冬酰胺酶项下其外观为白 色冻干块状物或粉末的规定。所制得的门冬酰胺酶冻干粉使用时，采用如下方式进行溶解
临床使用时，每支门冬酰胺酶冻干粉先用3 5mL灭菌注射用水溶解，然后转移至500mL葡萄糖注射液或氯化钠注射液中，按正常方式使用。上述2. Og滤液分装于相应管制瓶中半加塞后冻干时，预冻至-25°C后，保持 120min，抽真空，在660min内升华至0°C，保温270min，并在150min内升温至25°C，保温 MOmin，至门冬酰胺酶冻干粉针剂的水分在5%以内，从而完成冻干程序。上述门冬酰胺酶冻干粉针剂处方中的缓冲剂除磷酸氢二钠和磷酸二氢钠外(本实 施例的磷酸氢二钠是经磷酸二氢钠和氢氧化钠反应得到；也可以直接在处方中包括磷酸氢 二钠和磷酸二氢钠)，还可以由碳酸氢钠、甘氨酸盐、组氨酸盐或TRIS-HCl代替；处方中的 表面活性剂除泊洛沙姆188外也可以是聚氧乙烯醚(35)蓖麻油(CAS号61791-12-6)、聚 乙二醇硬脂酸酯15 (Solutol HS15，CAS号9004-99-3)、吐温20或吐温80等其他非离子 型表面活性剂；大量的正交试验表明，上述辅料对注射用门冬酰胺酶有很好的稳定作用。上述门冬酰胺酶冻干粉针剂的制备方法的各步骤的一些参数是可以适当调整的， 如溶解活性物质和辅料的注射用水在本实施例规定量的40% 120%之间都是允许的；滤液 灌装的规定量也可以根据分装的门冬酰胺酶的单位进行变化，比如每瓶中灌装Ig滤液，则 每瓶中包含门冬酰胺酶5000单位。本实施例制备的冻干粉针剂，在成品中不包含配置过程中的注射用水，或者说成 品中只有少量的注射用水残留，因为由于本实施例的制备方法的特殊性，作为溶媒的注射 用水在冻干过程中已经除去了 ；但是由于终产品的性能与溶媒及其用量密切相关，因此制 备过程中用作溶剂并最终除去的注射用水的量需控制在一定的范围内。本实施例制备时处方中的磷酸氢二钠溶解于注射用水，再与氢氧化钠反应后形成 磷酸盐缓冲体系，使加水至2000g前溶液pH值在7. 1 7. 5之间，加水至2000g后限定冻干 前溶液的PH值为7 8 ；当然可以理解的是，只有在终产品中加入与配置过程中使用的同 样量的注射用水，溶解后溶液的PH值才与冻干前溶液pH值一致或接近；但是冻干前溶液的 PH值影响冻干后成品重新用注射用水溶解的稳定性，而处方中的缓冲剂及其用量则保证了 冻干后成品重新用注射用水溶解的稳定性。本实施例根据处方，所用的门冬酰胺酶来源于常州千红生化制药股份有限公司； 二水合磷酸二氢钠、氢氧化钠来源于国药集团上海化学试剂公司；甘露醇注射液规格为 50g:250mL，来源于江苏四环生物股份有限公司；泊洛沙姆188 (F68)来源于巴斯夫(中国) 有限公司。(实施例2至实施例5、门冬酰胺酶冻干粉针剂) 实施例2至实施例5门冬酰胺酶冻干粉针剂的处方见下表1。表

本发明公开了一种门冬酰胺酶冻干粉针剂，包括门冬酰胺酶、缓冲剂、表面活性剂、药用辅料以及在制备过程中用作溶剂并最终少于加入量的5%的注射用水，其中表面活性剂是非离子型表面活性剂；通过在处方中加入缓冲剂和非离子型表面活性剂，使得门冬酰胺酶溶解后转移到注射液中时，不会出现微细可见异物超标的情况。本发明还公开了一种门冬酰胺酶溶解专用溶液，所述溶液溶剂为注射用水，溶质包括缓冲剂、表面活性剂；在不改变已有冻干粉针剂处方的情况下，将冻干粉先溶解在上述溶液中，再转移至氯化钠或葡萄糖注射液中时，同样不会出现微细可见异物超标的情况，使用时减小了对人体的刺激性，提高了临床用药安全性。