优化的siRNA阳离子脂质体的处方组成制作方法_朱家壁,李颖寰专利（脂质体,siRNA,阳离子）-早鸽网

一种优化的siRNA阳离子脂质体的处方组成制作方法

专利名称

一种优化的siRNA阳离子脂质体的处方组成制作方法
发明者

朱家壁, 李颖寰
公开日

2011年8月10日
申请日期

2011年3月31日
优先权日

2011年3月31日
申请人

中国药科大学
文档编号

A61K9/127GK102144973SQ201110079879
关键字

脂质体 siRNA 阳离子优化
权利要求

1.一种SiRNA阳离子脂质体的处方组成，其特征是含有25%-51% (相当于摩尔含量 20% -40% )的1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)和(相当于摩尔含量 0% -1 % )的N-羧基-聚乙二醇2000-1，2- 二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(cPEG-DSPE)2.权利要求1的siRNA是指化学合成的811 ^、修饰的siRNA、通过Dicer酶降解产生的 siRNA3.权利要求1的处方组成中siRNA与DOTAP的摩尔比例是1 70 1 185，优选的比例是1 150 1 1854.权利要求1的处方组成中可进一步加入1，2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，含量为10% -30% (相当于摩尔含量8% -20% )5.权利要求1的处方组成中cPEG-DSPE的结构式为6.权利要求1的处方组成中cPEG-DSPE可替换为N-甲氧基-聚乙二醇2000-1，2-硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)，其结构式为
技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及siRNA阳离子脂质体的处方构成中含有特定比例的1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)和N-羧基-聚乙二醇2000-1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(cPEG-DSPE)，得到一种能有效转运siRNA至细胞质的脂质体处方
背景技术
具体实施例方式

下列实施例用于进一步说明本发明实施例1取DOTAP 7. 55mg、DPPC 3. 97mg、DOPE 8. 04mg、胆固醇 10. 45mg，溶于氯仿或乙醇后，旋转蒸发或液氮挥干成膜，真空下干燥过夜加入3ml的10%蔗糖水溶液，水合lh，探头超声30min，室温下静置冷却得到终浓度为10mg/ml的IOOnm左右的空白脂质体混悬液选择无酯酶水或siRNA专用缓冲液稀释得到2 μ M的非靶向siRNA溶液，取50 μ 1的空白脂质体与1000 μ 1的非靶向siRNA溶液室温下混勻，静置20min，即得实施例2取DOTAP 7. 28mg、DPPC 3. 44mg、D0PE 7. 25mg、mPEG_DSPE(或 cPEG-DSPE)1. 46mg、胆固醇10. 07mg，溶于氯仿或乙醇后，旋转蒸发或液氮挥干成膜，真空下干燥过夜加入3ml 的10%蔗糖水溶液，水合lh，探头超声30min，室温下静置冷却得到终浓度为10mg/ml的1OOnm左右的空白脂质体混悬液选择无酯酶水或siRNA专用缓冲液稀释得到2 μ M的非靶向siRNA溶液，取50μ 1的空白脂质体与ΙΟΟΟμ 1的非靶向siRNA溶液室温下混勻，静置 20min,即得实施例3取DOTAP 7. 02mg、DPPC 2. 95mg、D0PE 7. 48mg、mPEG_DSPE(或 cPEG-DSPE)2. 82mg、胆固醇9. 72mg，溶于氯仿或乙醇后，旋转蒸发或液氮挥干成膜，真空下干燥过夜加入3ml 的10%蔗糖水溶液，水合lh，探头超声30min，室温下静置冷却得到终浓度为10mg/ml的 IOOnm左右的空白脂质体混悬液选择无酯酶水或siRNA专用缓冲液稀释得到2 μ M的非靶向siRNA溶液，取50μ 1的空白脂质体与ΙΟΟΟμ 1的非靶向siRNA溶液室温下混勻，静置 20min,即得实施例4取DOTAP 6. 36mg、DPPC 1. 67mg、D0PE 6. 78mg、mPEG_DSPE(或 cPEG-DSPE)6. 39mg、胆固醇8. 80mg，溶于氯仿或乙醇后，旋转蒸发或液氮挥干成膜，真空下干燥过夜加入3ml 的10%蔗糖水溶液，水合lh，探头超声30min，室温下静置冷却得到终浓度为10mg/ml的 IOOnm左右的空白脂质体混悬液选择无酯酶水或siRNA专用缓冲液稀释得到2 μ M的非靶向siRNA溶液，取50μ 1的空白脂质体与1000μ 1的非靶向siRNA溶液室温下混勻，静置 20min,即得实施例5将实施例1中非靶向siRNA换为生存素siRNA，其余方法相同实施例6将实施例2中非靶向siRNA换为生存素siRNA，其余方法相同实施例7将实施例3中非靶向siRNA换为生存素siRNA，其余方法相同实施例8将实施例4中非靶向siRNA换为生存素siRNA，其余方法相同实施例9取DOTAP 15. 32mg、DOPE 4. 08mg、胆固醇10. 60mg，溶于氯仿或乙醇后，旋转蒸发或液氮挥干成膜，真空下干燥过夜加入3ml的10%蔗糖水溶液，水合lh，过IOOnm的聚碳酸酯膜11次，得到终浓度为10mg/ml的空白脂质体混悬液选择无酯酶水或siRNA专用缓冲液稀释得到2 μ M的非靶向siRNA溶液，取50 μ 1的空白脂质体与1000 μ 1的非靶向siRNA 溶液室温下混勻，静置20min，即得实施例10取DOTAP 14.76mg、D0PE 3. 54mg、mPEG-DSPE (或 cPEG-DSPE) 1. 48mg、胆固醇 10. 22mg，溶于氯仿或乙醇后，旋转蒸发或液氮挥干成膜，真空下干燥过夜加入3ml的10% 蔗糖水溶液，水合lh，过IOOnm的聚碳酸酯膜11次，得到终浓度为10mg/ml的空白脂质体混悬液选择无酯酶水或siRNA专用缓冲液稀释得到2μ M的非靶向siRNA溶液，取50μ 1的空白脂质体与ΙΟΟΟμ 1的非靶向siRNA溶液室温下混勻，静置20min，即得实施例11取DOTAP 14.25mg、D0PE 3. 03mg、mPEG-DSPE (或 cPEG-DSPE) 2. 86mg、胆固醇9. 86mg，溶于氯仿或乙醇后，旋转蒸发或液氮挥干成膜，真空下干燥过夜加入3ml的10% 蔗糖水溶液，水合lh，过IOOnm的聚碳酸酯膜11次，得到终浓度为10mg/ml的空白脂质体混悬液选择无酯酶水或siRNA专用缓冲液稀释得到2 μ M的非靶向siRNA溶液，取50 μ 1的空白脂质体与1000 μ 1的非靶向siRNA溶液室温下混勻，静置20min，即得实施例12取DOTAP 12.89mg、D0PE 1. 72mg、mPEG-DSPE (或 cPEG-DSPE) 6. 47mg、胆固醇 8. 92mg，溶于氯仿或乙醇后，旋转蒸发或液氮挥干成膜，真空下干燥过夜加入3ml的10% 蔗糖水溶液，水合lh，过IOOnm的聚碳酸酯膜11次，得到终浓度为10mg/ml的空白脂质体混悬液选择无酯酶水或siRNA专用缓冲液稀释得到2 μ M的非靶向siRNA溶液，取50 μ 1的空白脂质体与1000 μ 1的非靶向siRNA溶液室温下混勻，静置20min，即得实施例13将实施例9中非靶向siRNA换为生存素siRNA，其余方法相同实施例14将实施例10中非靶向siRNA换为生存素siRNA，其余方法相同实施例15将实施例11中非靶向siRNA换为生存素siRNA，其余方法相同实施例16将实施例12中非靶向siRNA换为生存素siRNA，其余方法相同实施例17取DOTAP 19. 3Img和胆固醇10. 69mg，溶于氯仿或乙醇后，旋转蒸发或液氮挥干成膜，真空下干燥过夜加入3ml的10%蔗糖水溶液，水合lh，过IOOnm的聚碳酸酯膜11次，得到终浓度为10mg/ml的空白脂质体混悬液选择无酯酶水或siRNA专用缓冲液稀释得到 2 μ M的非靶向siRNA溶液，取50 μ 1的空白脂质体与1000 μ 1的非靶向siRNA溶液室温下混勻，静置20min，即得于IOOmm培养皿中种植人胰腺癌HS-766T细胞株，待细胞密度达50%时，将实施例1 16得到的脂质体用无血清DMEM培养液稀释至siRNA浓度为ΙΟΟηΜ，在37°C下作用于细胞单层他后，换成正常细胞培养液培养48h，收集细胞提取蛋白，取含有20 μ g总蛋白的细胞裂解产物进行10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳后在90mA恒定电流下将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)印迹膜用含脱脂奶粉的TBST(Tris缓冲盐中加入0.05%吐温20)溶液封闭PVDF膜Ih后，加入专用一抗和二抗(均为1 1000 稀释)，在室温下摇床上结合2h，TBST洗膜4次，每次lOmin，ECL显影，暗室曝光比较不同的载siRNA脂质体对于细胞内生存素蛋白的表达差异结果表明，实施例17得到的脂质体在作用于细胞单层池后即开始有细胞从培养皿底部脱落，他后有超过60%的细胞脱落或萎缩，显示了较高的细胞毒性；而实施例1和实施例9得到的脂质体作用于细胞单层他后，细胞仍保持良好的贴壁性能和较好的完整性，表明处方中加入25 % -51 %的DOTAP是相对安全的Western blot结果显示实施例5、13和14成功将生存素siRNA转移至细胞质，其它实施例均无效与对照组(仅siRNA缓冲液)产生的蛋白表达量相比，实施例5和14 产生的蛋白表达有显著性差异(P < 0. 05)；实施例13产生的蛋白表达有极显著性差异(ρ< 0. 01)

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专利名称：一种优化的siRNA阳离子脂质体的处方组成的制作方法RNA干扰(RNAi)是指双链RNA对基因表达的阻断作用，双链RNA经dicer酶切后会形成很多小片段，称为siRNA(小段干扰RNA)，这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”(不能表达功能)。siRNA可经由多种不同转染技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的敲弱效果，因此可利用经过适当剪裁的siRNA之互补性，来沉默肿瘤细胞内相应的基因蛋白质。目前限制siRNA应用的主要问题是如何把siRNA转运至细胞质，裸核酸分子具有分子量大、亲水性及表面电荷呈负性等性质，使其易于被网状内皮系统(REQ所清除，难以进入细胞。阳离子脂质体通过电荷作用可以有效地使带负电的siRNA与脂质体结合，保护siRNA免受核酶降解，并且易于与带负电的细胞表面结合，触发细胞内吞摄取。生存素(survivin)蛋白是凋亡抑制蛋白成员之一，具有强大的抗细胞凋亡作用，并在维持细胞有丝分裂及血管形成调控过程中起重要作用，是致癌过程的重要因素。因此可利用生存素siRNA干扰技术沉默生存素基因，通过阳离子脂质体介导将生存素siRNA转染入肿瘤细胞的细胞质，抑制生存素蛋白的表达。CN200710072417. 9公开了一种siRNA脂质体的制备方法，选用鱼精蛋白与siRNA 先结合形成复合物包埋在中性脂质体中，提高了脂质体的稳定性和包封率，降低了细胞毒性，但并未描述该中性脂质体是否成功将siRNA转运至细胞质。具有高表面电荷的阳离子脂质体通常会有一定的细胞毒性，因此需要控制阳离子脂质材料在脂质体中的用量；众所周知，聚乙二醇(PEG)修饰阳离子脂质体表面，降低了脂质体被RES清除的几率，提高了脂质体在血液系统的循环时间，从而使更多的脂质体通过增强的透过和滞留(EPR)作用进入肿瘤组织；另一方面，PEG增加了脂质体表面的亲水性，从而降低了脂质体在肿瘤间质中的转运和细胞摄取量；因此有必要研究阳离子脂质体中优化的PEG含量，同时兼顾EI3R作用和细胞内生物利用度。摩尔含量为5%的PEG被广泛使用在各种脂质体制剂中，然而我们并不知道其是否能成功从内涵体逃逸，将siRNA转运至细胞质。
本发明的目的是为了得到一种能有效转运SiRNA至细胞质的阳离子脂质体处方组成。本发明siRNA脂质体的原辅料包括1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷(D0TAP)、胆固醇、1，2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕榈酰基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、N-羧基-聚乙二醇2000-1，2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(cPEG-DSPE)或N-甲氧基-聚乙二醇2000-1，2- 二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)。考虑到阳离子脂质体的细胞毒性，首先筛选出安全的DOTAP用量范围；然后进一步筛选出成功转运siRNA至细胞质的处方组成。选择肿瘤细胞内生存素蛋白的表达量作为研究对象，选择siRNA专用缓冲液作为阴性对照，标志细胞质内生存素蛋白表达的正常量；将不同处方的载生存素siRNA脂质体作用于细胞，选择相应的载非靶向siRNA脂质体作为阳性对照，证明细胞质内生存素蛋白表达的下调仅与生存素siRNA相关，与其他siRNA无关；筛选有效的载siRNA阳离子脂质体处方组成。本发明首先采用本领域技术人员所熟知的脂质体制备方法(如薄膜分散法、液氮挥发法、逆相蒸发法、乙醇注入法、熔融法、超声法、聚碳酸酯膜挤出法等)制备空白阳离子脂质体，然后将空白脂质体与含siRNA的缓冲液按4 1+/-电荷比混勻，放置适当时间后即得siRNA阳离子脂质体。本发明通过下列步骤来描述siRNA阳离子脂质体的制备1、采用本领域技术人员所熟知的脂质体制备方法制成空白阳离子脂质体。其中含有25%-51% (相当于摩尔含量20%-40% )的DOTAP和0%-5% (相当于摩尔含量 0% -1% )的 cPEG-DSPE 或 mPEG-DSPE。2、将空白脂质体与含siRNA的缓冲液按一定比例混勻，放置适当时间后即得 siRNA阳离子脂质体。siRNA与DOTAP的摩尔比例是1 70 1 185，优选的比例是 1 150 1 185。图1是实施例1、9、17得到的脂质体作用于细胞单层他后的显微镜照片。图2是实施例1 8western blot实验结果(n = 3)，其中对照组(Ctrl)为siRNA 专用缓冲液；采用图形处理软件测定蛋白印迹的像素，转换成柱状图。*P<0. 05#p<0.01图3是实施例9 16western blot实验结果(η = 3)，其中对照组(Ctrl)为siRNA 专用缓冲液。采用图形处理软件测定蛋白印迹的像素，转换成柱状图。*P<0. 05#p<0.0
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种siRNA阳离子脂质体的处方组成中含有25％-51％(相当于摩尔含量20％-40％)的1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)和0％-5％(相当于摩尔含量0％-1％)的N-羧基-聚乙二醇2000-1，2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(cPEG-DSPE)或N-甲氧基-聚乙二醇2000-1，2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)，可成功将siRNA转运至细胞质。

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