专利名称：带afp启动子的腺病毒载体介导的il-24在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用的制作方法带AFP启动子的腺病毒载体介导的IL-24在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用技术 领域本发明涉及一种将基因治疗方法应用于肝癌治疗中，特别是一种带AFP启动子的腺病毒载体介导的IL-24在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用。肝癌起病隐匿、进展快、侵袭性强、易转移、发病率和死亡率高，在我国居恶性肿瘤的首位，且传统的手术、化疗及放疗效果均不理想，为此，国内外都在寻找和开展肝癌治疗的新方法。随着分子生物学的发展，特别是重组DNA技术的建立，使得各种病毒用作载体成为可能。其中，腺病毒载体在基因治疗、基因免疫等方面应用开发得较早的一种基因载体，已经发展成为基因免疫和基因治疗的转移载体。因为腺病毒载体安全和转导效率高， 所以成为肿瘤基因治疗最常用的载体。基因治疗作为恶性肿瘤治疗的一部分，为改善肿瘤患者预后提供了一条新的解决途径和方案。在基因治疗的适应证中，肿瘤位居第一，占 66. 2%。在我国已有两个肿瘤基因治疗用腺病毒载体被SFDA批准上市。目前以腺病毒为载体介导外源基因用于癌症治疗的并且获得批文的仅Ad_P53， 其外源基因为P53蛋白，启动子为CMV，CMV是一个高强表达的没有组织特异性的启动子， 因此，所有感染此缺陷病毒的细胞中均有P53表达，没有组织特异性，并且Ad-P53也仅对因 P53突变而引发的癌症有效，因此具有P53依赖性。腺病毒载体具有许多独特的优点腺病毒粒子相对稳定；安全性较好，在人类的肿瘤细胞中尚未发现有腺病毒的整合，未发现其与人类肿瘤的发生有直接关系；腺病毒基因组较大(36 kb)，插入大片段外源性基因的潜力大；细胞及动物实验表明，腺病毒载体很容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白；腺病毒基因组较易操作。同时，宿主细胞较为广泛，除了可在肠道和呼吸道繁殖以外，还可以感染肝细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和神经胶质细胞等多种人体细胞，腺病毒载体感染的非组织特异性的优点在于可作为多种癌症的治疗载体，但是带来另一个负面效应是腺病毒载体介导的外源基因也会癌细胞外的正常组织细胞中表达，带来一些不可预测的副面效应.黑色素瘤分化相关基因7 (mda-7/IL-24)是利用减数杂交技术，从人的黑色素瘤细胞株HO-I中克隆的新基因。它属于IL-10家簇成员之一，因此重新被命名为IL-24. IL-24是一个具备理想的肿瘤抑制基因特点的基因①选择性只在癌细胞中促进增长抑制和凋亡， 而且抑癌具有广谱性；②能引导强烈的旁路抗肿瘤效应(从而抵消低转导效应)；③协同其他的治疗方案(放疗，化疗)；④放大免疫过程(进一步强烈提高对肿瘤细胞的损伤)；⑤ 抗血管生成的作用(抑制肿瘤的血液供应)。II期临床研究也证明其有效性与安全性，因此在抑癌方面具有极大的临床抗肿瘤应用价值，癌症基因治疗可能就此打开一片全新的窗AFP是甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)，其启动子仅在胎盘中表达，绝大部分肝细胞癌组织具有恢复AFP表达的特性，蛋白质的表达由其启动子的组织特异性决定，因此，在AFP启动子的介导下使抑癌基因IL-M仅在肝癌细胞中表达，在其它组织来源的细胞与正常肝细胞中不表达。因此，发明开发针对某一特定组织来源的癌细胞的治疗性腺病毒载体就成为目的最重要的任务。
本发明提供的是一种带AFP (人源与鼠源甲胎蛋白alpha-fetoprotein，AFP)启动子的腺病毒载体介导的IL-M在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用，即以肝癌特异性启动子AFP来介导外源基因IL-M只有在肝癌细胞中才表达并诱导相应的癌细胞凋亡， 即使同样是肝细胞，在正常肝细胞中IL14也不表达，因此具有高度的选择性，减少可能的副作用，增强靶向性。1、带AFP启动子的腺病毒载体介导的IL-M在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用，其中AFP为甲胎蛋白(alpha-fetoprotein)，AFP启动子包括人源或鼠源两种。2、带AFP启动子的腺病毒载体介导的IL-M在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用，其中=IL-M是利用减数杂交技术，从人的黑色素瘤细胞株HO-I中克隆的新基因，其基因包含一个信号肽系列，系列如下1 ATGAATTTTC AACAGAGGCT GCAAAGCCTG TGGACTTTAG CCAGCAGACC51CTTCTGCCCTCCTTTGCTGGCGACAGCCTCTCAAATGCAGATGGTTGTGC101TCCCTTGCCTGGGTTTTACCCTGCTTCTCTGGAGCCAGGTATCAGGGGCC151CAGGGCCAAGAATTCCACTTTGGGCCCTGCCAAGTGAAGGGGGTTGTTCC201CCAGAAACTGTGGGAAGCCTTCTGGGCTGTGAAAGACACTATGCAAGCTC251AGGATAACATCACGAGTGCCCGGCTGCTGCAGCAGGAGGTTCTGCAGAAC301GTCTCGGATGCTGAGAGCTGTTACCTTGTCCACACCCTGCTGGAGTTCTA351CTTGAAAACTGTTTTCAAAAACTACCACAATAGAACAGTTGAAGTCAGGA401CTCTGAAGTCATTCTCTACTCTGGCCAACAACTTTGTTCTCATCGTGTCA451CAACTGCAACCCAGTCAAGAAAATGAGATGTTTTCCATCAGAGACAGTGC501ACACAGGCGGTTTCTGCTATTCCGGAGAGCATTCAAACAGTTGGACGTAG551AAGCAGCTCTGACCAAAGCCCTTGGGGAAGTGGACATTCTTCTGACCTGG601ATGCAGAAATTCTACAAGCTCTGA3、带AFP启动子的腺病毒载体介导的IL-M在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用，其中用人源或鼠源AFP启动子取代腺病毒载体中CMV启动子，并将IL-M基因克隆到 AFP启动子下游，使IL-M基因的表达受AFP启动子的控制.腺病毒载体作为外源基因表达载体携带IL-M基因进入肝癌细胞，IL-24在组织特异性启动子AFP的控制下特异性表达，即仅在肝癌细胞中表达，在正常肝细胞及其它组织来源的细胞中不表达，从而诱实施例1、带鼠源AFP启动子的腺病毒载体介导的IL14在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用，其中腺病毒载体中CMV启动子被鼠源AFP启动子所取代，IL-24位于AFP启动子下游。
1 试剂材料核酸内切酶为！^erments公司产品，腺病毒质粒pDC315、 pPGHloxPAE3购自深圳市百恩维生物科技有限公司，H印!3B、!fepG II、SMMC27721、正常肝细胞系L02、Hela为本实验室保存，293购自武汉大学CCTCC。
2 引物
HAFPl AAGCTTTAGAAAATCCTGGTGCHAFP2 TGTTATTGGCAGTGGTGGAMAFPlGGATACTGTGAGCAGTMAFP2:GGATATTTTACTTGAIL2401 ATGAATTTTCAACAGAGGCTGCA,IL2402 CAAAGTGAAACTCTTGGCCCTGGGTIL2403 GCCCAGGGCCAAGAGTTTCACTTTIL2404 TCAGAGCTTGTAGAATTTCTGCATCCAIL2405 ATG GGGGCCCAGGGCCAAGALUC-f ATGGAAGACGCCAAAAACATALUC-R TTACACGGCGATCTTTCCeGFP-F:ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGeGFP-R:TCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG
以上引物均为上海生物工程有限公司合成。3 方法
3. 1鼠源与人源AFP启动子的扩增基本方法参照《分子克隆》，取AFP阳性的鼠肝癌组织参照TataRa Blood Goneme DNA Extraction KIT的操作说明提取基因组DNA。以MAFPl 与MAFP2为引物扩增鼠源AFP启动子，以HAFPl与HAFP2为引物从IfepG II基因组中克隆人源AFP启动子，胶回收片段，双酶切插入质粒PDC315相应位点，替代pDC315中原有的 CMV启动子，构建AFP控制的表达载体AdMAFP与AdHAFP。结果1 从鼠中扩增的AFP启动子大小为991bp，经双酶切鉴定后测序，所测定的序列如下
GGATACTGTGAGCAGTAGCGCTGAAGTTCTTTTATATCCTTTTTAAGTGATGTCTGTTAACTAGTAACCTTC AGTGGGCAAACATGTTACTTTTTTTCCTTATGTTGAAGTTAGGCAATTTGCCAATAATTAACAGCACAGGGGTCACT TCTATCTTATGTTCAAGGACAAAGACCACTTCAGAGTGGAAAAAAAAAAACAAAACCTTGCAAATGCTGCAAATGTT CTCTGCCAACTAAACTCTTCCAATAGAAAGTATCTCCTAAGCTGAAGAAAGATTTATTTATTTCAATGTAAAACATT GATACAGCCATAAAGAAAATATAGCAGGCTTACTATGTAGCTCCAAATGCATTAATTCTTTTTTTAAAAAAAATAGT AAAATGCATGTTGCATGCTAGGCGCTGAACGTATGTCTGAGTCATTCAGACTCTTCATCAGTGGGTGTATTTCTTAA TTATCCAGTTGTTATTTAGCTCAAAACCATTGGTCAAGGGGGTGTATTTAATTTTGTGTTTCGTGTCTGGTTTAACA TAGAAAACTTACAGCACAAAGCCTGATGAACGAGTTCCCATTCTAATGTCGTGTGCCAAAGGCTATTCTGCATGTAT GTCACAGATGCATGGGTTAGCTACAGCACCCTCTCAGGCCCTTGGGATGATGATGCTAACACTAACTAACGAGCACT GATATACTCTGACCCTGGGCAGGCTTCATCTCATACCTTCACCCTCGGTGTCCCGGAGTCTGTGACAGTTTCTTTAG TTCTCTACACATCAGAGAGATGCAAACTTGTAAAGAAAAATTCCCAGTGCGCATCTAAACTATACTCGGACTTTTTC TTTTTATGTGCTCAGAGTTTGATGCATATGTGCATCTGTTCTGCAAGGTCAGAAGAGGCAATGGAATCCGGGATCAG CTTTGTTATCAGACGTATCTGGCCGGGGGGATCTTACTTCAGTGGCTGACATGTGGCTCAAGTAAAATATCC
结果2 从H印G II中扩增的AFP启动子大小为981bp，经双酶切鉴定后测序，所测定的序列如下aagctttagaaaatcctggtgcctgggtctcaactccacagattctgatttaactggtctgggttacagact aggcattgggaattcaaaaagttcccccagtgattctaatgtgtagccaagatcgggaacccttgtagacagggatg ataggaggtgagccactcttagcatccatcatttagtattaacatcatcatcttgagttgctaagtgaatgatgcac ctgacccactttataaagacacatgtgcaaataaaattattataggacttggtttattagggcttgtgctctaagtt ttctatgttaagccatacatcgcatattaaatactttaaaatgtaccttattgacatacatattaagtgaaaagtgt ttctgagctaaacaatgacaacataattatcaagcaatgataatttgaaatgaatttattattctgcaacttaggga caagtcatctctctgaattttttgtactttgagagtatttgttatatttgcaagatgaagagtctgaatcggtcaga caatctcttgtgtgcctggcatatgataggcatttaatagttttaaagaattaatgtatttagatgaattgcatacc aaatctgctgtcttttctttatggcttcattaacttaatttgagagaaattaattattctgcaacttagggacaagt catctctttgaatattctgtagtttgaggagaatatttgttatatttgcaaaataaaataagtttgcaagttttttt tttctgccccaaagagctctgtgtccttgaacataaaatacaaataaccgctatgctgttaattattggcaaatgtc ccattttcaacctaaggaaataccataaagtaacagatataccaacaaaaggttactagttaacaggcattgcctga aaagagtataaaagaatttcagcatgattttccatattgtgcttccaccactgccaataaca
3.2 IL-24基因的克隆IL-24基因购自武汉三鹰公司，分别选择引物IL2403与 IL2402先对IL-24基因进行定点突变，再用引物IL2401与IL2404克隆包含1_49位氨基酸的信号序列全长IL-24，该基因命名为SIL-24，所合成的蛋白能外分泌表达，用引物 IL2405与IL2404扩增一个不包含1_49位氨基酸的信号序列，命名为NSIL-24，所合成的蛋白不能分泌表达。同时分别用引物LUC-F与LUC-R扩增Iuciferase酶基因，用eGFP-R 与eGFP-F扩增GFP基因，再将这些基因分别构建到AdMAFP与AdHAFP中，最后的质粒分另命名为 AdMAFP-SIL-24，AdMAFP-NSIL-24, AdMAFP-LUC, AdMAFP-GFP, AdHAFP-SIL-24, AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC, AdHAFP-GFP,其中 AdMAFP-GFP 与 AdHAFP-GFP 主要用于病毒包装指示用，AdMAFP-LUC与AdHAFP-LUC主要用于阴性对照。3.3 腺病毒的重组按腺病毒载体操作手册将质粒AdMAFP-SIL-24， AdMAFP-NSIL-24, AdMAFP-LUC, AdMAFP-GFP, AdHAFP-SIL-24, AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC, AdHAFP-GFP 分别与 pBGHloxp Δ E3 通过 Lipo2fectamine2000 共转染至 293 细胞。共转染后15天左右出现病毒空斑，经过3-5次病毒空斑纯化，kakaRa试剂盒提取重组腺病毒DNA，再分别用2中的引物进行PCR鉴定，以确定重组腺病毒DNA中成功克隆了 AFP启动子、IL-24基因、LUC基因与GFP基因，将鉴定正确的增殖缺陷型腺病毒命名分别命名为 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdHAFP-LUCV, AdHAFP-GFPV 进行大量扩增、纯化与滴度测定。结果腺病毒AdM AFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdHAFP-LUCV, AdHAFP-GFPV 在 293 细胞内反复扩增，CsCl超速离心纯化，获得高度浓缩的病毒液。经TCID50测定，AdMAFP-SIL-24V， AdMAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdHAFP-LUCV，AdHAFP-GFPV 病毒滴度分别是达 6. 1 XlOlOpfu /ml,5. OX IOlOpfu /ml、 5. 3X IOlOpfu /ml、5. 1 XlOlOpfu /ml,5. 6 XlOlOpfu /ml、5. OX IOlOpfu /ml、4. 2 XlOlOpfu /ml, 5. 1 XlOlOpfu /ml。3.4 IL-24定向表达的测定测定所用的细胞系分别为肝癌细胞系H印G II、正常肝细胞系L02与Hela，分别用六孔板按5X104细胞数/孔接种上述细胞，在培养24h后，分别按 M0I=5 的感染复数接种 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V缺陷型腺病毒，先轻摇2h然后吸除上清，再换用2%血清培养液，培养 48h,收集细胞，以不加病毒的细胞同步培养作为对照，用AdMAFP-GFPV与AdMAFP-GFPV实验组在荧光显微镜下观察指示病毒包装，用测定Iuciferase酶活性来判定人源与鼠源AFP 启动子的活性，按TataRa公司Protein and RNA Extraction Kit试剂盒的说明分别提取 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL_24V 组的细胞提取液，并以提取液进行 SDS-Page 电泳，用 Western Blotting 分析 IL-24 在 AdMAFP-SIL-24V， AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-SIL-24V，AdHAFP-NSIL-24V 中的表达，其中 IL-24 与 IL-24 单克隆抗体购自SANTA公司，WB方法为常规方法。用常规Iuciferase酶法测定Iuciferase的活性。结果表明，AFP启动子能介导外源基因在肝癌细胞中特异性表达，在正常的肝细胞及非肝癌组织来源的细胞中不表达，同时腺病毒介导的IL-24在肝癌中表达时有高度的糖基化。LUCIFERASE酶活测定结果AFP启动子在肝癌细胞中有较强的表达活性。3. 5 AdMAFP-SIL-24V, AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 诱导肝癌细胞凋亡的效果。用流式细胞仪测定AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdHAFP-LUCV，对肝癌细胞凋亡的影响。肝癌细胞系和正常肝细胞系培养条件为含10%小牛血清、100 mg/L链霉素以及100 mU/L青霉素的RPMI 1640培养基、37 ！及5% C02。细胞培养至至对数生长期，消化，稀释，计数，转种至24孔板中培养，105细胞数/孔，培养24h;去除培养液，每孔加入约Iml无血清培养液，以MO I =50分别加入上述病毒，对照组为AdHAFP-LUCV，孵育 90min,加入含 5% FBS 的培养液。AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdHAFP-LUCV，处理 24 h 后，离心收集细胞并用冷的 PBS 洗两次，然后用75%酒精重悬，-20°C冰箱固定过夜，固定过的细胞用600g离心力离心回收，再用冰预冷的PBS洗涤两次，然后用溶于PBS的100 ug/ml RNase A在37 °C处理lh， 最后在黑暗中4 °C冰箱PI (20 ug/ml)处理30 min，最后上机测定。实验结果表明AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V能明显诱导肝癌凋亡，而对正常肝细胞及Hela细胞没有明显影响，而对照组AdMAFP-LUCV，AdHAFP-LUCV则诱导肝癌凋亡效率较低，表明AdMAFP-SIL-24V， AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 对肝癌凋亡的诱导作用主要是IL-24本身，并且AFP能启动外源基因在肝癌细胞中特异性表达，同时结果还显示 AdMAFP-SIL-24V, AdHAFP-SIL-24V 的效果要比 AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-NSIL-24V 高， 这可能与IL-24的外分泌对肝癌凋亡有放大作用，能引导强烈的旁路抗肿瘤效应。表明 AdMAFP-SIL-24V, AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 都具有开发成特异性抗肝癌基因治疗新药，其中优以AdMAFP-SIL-24V与AdHAFP-SIL-24V为最佳，具有天发抗肝癌基因治疗药物的潜力。黑色素瘤分化相关基因7(mda-7/IL-24)是利用减数杂交技术，从人的黑色素瘤细胞株HO-I中克隆的新基因。它属于IL-10家簇成员之一，因此重新被命名为IL-24. IL-24 是一个具备理想的肿瘤抑制基因特点的基因①选择性只在癌细胞中促进增长抑制和凋亡，而且抑癌具有广谱性；②能引导强烈的旁路抗肿瘤效应(从而抵消低转导效应)；③协同其他的治疗方案(放疗，化疗)；④放大免疫过程(进一步强烈提高对肿瘤细胞的损伤)； ⑤抗血管生成的作用(抑制肿瘤的血液供应)。II期临床研究也证明其有效性与安全性， 因此在抑癌方面具有极大的临床抗肿瘤应用价值，癌症基因治疗可能就此打开一片全新的窗口。AFP是甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)，其启动子仅在胎盘中表达，绝大部分肝细胞癌组织具有恢复AFP表达的特性，蛋白质的表达由其启动子的组织特异性决定，因此，在AFP启动子的 介导下使抑癌基因IL-24仅在肝癌细胞中表达，在其它组织来源的细胞与正常肝细胞中不表达。本发明的优点在于高效的基因传递载体充分利用腺病毒载体安全和转导效率高的特点；治疗基因表达的调控利用肝癌特异性表达的AFP启动子能介导外源目的基因能在肝癌细胞中特异性定向表达的特性，实现靶向性治疗肝癌的目的；有效的治疗基因 IL-24具有广谱性、旁路效应以及协同性的特点，构建能在肝癌细胞中特异性定向表达的能高效诱导癌细胞凋亡的治疗性腺病毒栽体，实现其对肝癌的靶向治疗作用，从而提高基因表达产物在肿瘤局部的浓度，并通过IL-24的旁路效应放大其治疗效果，同时与放疗与化疗等其它药物协同作用提高治疗效率。实现将治疗基因、高效的基因传递载体、治疗基因表达的调控有效综合利用。本发明的另一个优点在于它是以肝癌特异性启动子AFP来介导外源基因IL-24， 只有在肝癌细胞中外源基因才表达并诱导相应的癌细胞凋亡，即使同样是肝细胞，在正常肝细胞中IL-24也不表达，因此具有高度的选择性，减少可能的副作用，增强靶向性。另外， IL-24具有广谱的抗癌性，不依赖于P53蛋白，也不依赖于Rb蛋白等。本发明治疗肝癌的方法与放疗、化疗与手术法相比还有三个突出的优点，一是副作用小，放疗与化疗对人的上皮细胞等血细胞特别是免疫细胞均有较强的副作用，没有选择性，而本发明的治疗方法仅针对肝癌细胞有诱导凋亡作用，对其它组织来源细胞与正常的肝细胞均无副作用，二是IL-24 不但不能损伤免疫系统，还能增强免疫系统的功能，与放疗与化疗联合使用增强放疗与化疗的效果，三是手术主要针对未扩散的肝癌，对已扩散的肝癌细胞无能为力，而本治疗载体对扩散或未扩散肝癌细胞均有治疗效果，因为对已扩散的癌细胞同样具有同样的感染能力并诱导其凋亡，因此能明显提高肝癌晚期病人的生存能力。


图1为本发明的效果实施例图；Lo2正常肝细胞，Hela卵巢癌细胞，其它均是肝癌细胞。

实施例1、带鼠源AFP启动子的腺病毒载体介导的IL-24在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用，其中腺病毒载体中CMV启动子被鼠源AFP启动子所取代，IL-24位于AFP启动子下游。1 试剂材料核酸内切酶为Ferments公司产品，腺病毒质粒pDC315、 pPGHloxPAE3购自深圳市百恩维生物科技有限公司，H印3B、!fepG II、SMMC27721、正常肝细胞系L02、Hela为本实验室保存，293购自武汉大学CCTCC。
2 引物
MAFPl GGATACTGTGAGCAGT MAFP2 GGATATTTTACTTGA IL2401 ATGAATTTTCAACAGAGGCTGCA, IL2402 CAAAGTGAAACTCTTGGCCCTGGGT IL2403 GCCCAGGGCCAAGAGTTTCACTTT IL2404 TCAGAGCTTGTAGAATTTCTGCATCCA IL2405 ATG GGGGCCCAGGGCCAAGA LUC-f ATGGAAGACGCCAAAAACATA LUC-R TTACACGGCGATCTTTCC eGFP-F: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG eGFP-R TCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG 以上引物均为上海生物工程有限公司合成。3 方法
3. 1鼠源AFP启动子的扩增基本方法参照《分子克隆》，取AFP阳性的鼠肝癌组织参照 TataRa Blood Goneme DNA Extraction KIT 的操作说明提取基因组 DNA。以 MAFPl 与 MAFP2为引物扩增鼠源AFP启动子，切胶回收片段，双酶切插入质粒pDC315相应位点， 替代pDC315中原有的CMV启动子，构建AFP控制的表达载体AdAFP。结果从鼠中扩增的AFP启动子大小为991bp，经双酶切鉴定后测序，所测定的序列如下
GGATACTGTGAGCAGTAGCGCTGAAGTTCTTTTATATCCTTTTTAAGTGATGTCTGTTAACTAGTAACCTTC AGTGGGCAAACATGTTACTTTTTTTCCTTATGTTGAAGTTAGGCAATTTGCCAATAATTAACAGCACAGGGGTCACT TCTATCTTATGTTCAAGGACAAAGACCACTTCAGAGTGGAAAAAAAAAAACAAAACCTTGCAAATGCTGCAAATGTT CTCTGCCAACTAAACTCTTCCAATAGAAAGTATCTCCTAAGCTGAAGAAAGATTTATTTATTTCAATGTAAAACATT GATACAGCCATAAAGAAAATATAGCAGGCTTACTATGTAGCTCCAAATGCATTAATTCTTTTTTTAAAAAAAATAGT AAAATGCATGTTGCATGCTAGGCGCTGAACGTATGTCTGAGTCATTCAGACTCTTCATCAGTGGGTGTATTTCTTAA TTATCCAGTTGTTATTTAGCTCAAAACCATTGGTCAAGGGGGTGTATTTAATTTTGTGTTTCGTGTCTGGTTTAACA TAGAAAACTTACAGCACAAAGCCTGATGAACGAGTTCCCATTCTAATGTCGTGTGCCAAAGGCTATTCTGCATGTAT GTCACAGATGCATGGGTTAGCTACAGCACCCTCTCAGGCCCTTGGGATGATGATGCTAACACTAACTAACGAGCACT GATATACTCTGACCCTGGGCAGGCTTCATCTCATACCTTCACCCTCGGTGTCCCGGAGTCTGTGACAGTTTCTTTAG TTCTCTACACATCAGAGAGATGCAAACTTGTAAAGAAAAATTCCCAGTGCGCATCTAAACTATACTCGGACTTTTTC TTTTTATGTGCTCAGAGTTTGATGCATATGTGCATCTGTTCTGCAAGGTCAGAAGAGGCAATGGAATCCGGGATCAG CTTTGTTATCAGACGTATCTGGCCGGGGGGATCTTACTTCAGTGGCTGACATGTGGCTCAAGTAAAATATCC
3.2 IL-24基因的克隆 IL-24基因购自武汉三鹰公司，选择引物IL2403与IL2402 先对IL-24基因进行扩增与定点突变，再用引物IL2401与IL2404最后获得的IL-24基因一个包含1-49位氨基酸的信号序列，该基因命名为SIL-24，所合成的蛋白能外分泌表达， 用引物IL2405与IL2404扩增一个不包含1_49位氨基酸的信号序列，命名为NSIL-24，所合成的蛋白不能分泌表达。同时分别用引物LUC-F与LUC-R从质粒载体上扩增Iuciferase 酶基因，用eGFP-F与eGFP-R从质粒载体上扩增GFP基因。这些基因经双酶切后，分别 构建到 AdMAFP 中，最后的质粒分另命名为 AdMAFP-SIL-24，AdMAFP-NSIL-24, AdMAFP-LUC, AdMAFP-GFP。其中AdMAFP-GFP主要用于病毒包装指示用，AdMAFP-LUC主要用于阴性对照。
结果，各组基因克隆图片可参考见说明书附图中的图1
3.3 腺病毒的重组按腺病毒载体操作手册将质粒AdMAFP-SIL-24， AdMAFP-NS I L-24, AdMAFP-LUC, AdMAFP-GFP 分另Ij 与 pBGHloxp Δ Ε3 通过 L ipo2fectamine2000共转染至293细胞。共转染后15天左右出现病毒空斑，经过3_5次病毒空斑纯化，kakaRa试剂盒提取重组腺病毒DNA，再分别用2中的引物进行PCR鉴定， 以确定重组腺病毒DNA中成功克隆了 AFP启动子、IL-24基因、Iuciferase酶基因与GFP基因。将鉴定正确的增殖缺陷型腺病毒命名分别命名为AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V， AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV进行大量扩增、纯化与滴度测定。结果腺病毒AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V，AdMAFP-LUCV，AdMAFP-GFPV 在 293细胞内反复扩增，CsCl超速离心纯化，获得高度浓缩的病毒液。经TCID50测定， AdMAFP-SIL-24V, AdMAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV 病毒滴度分别是达 6. 1 XlOlOpfu /ml、5. OX IOlOpfu /ml >5. 3X IOlOpfu /ml、5. 1 XlOlOpfu /ml。3.4 IL-24定向表达的测定测定所用的细胞系分别为肝癌细胞系H印G II、 H印3B以及对照细胞系(正常肝细胞系L02与Hela)，分别用六孔板按5X104细胞数/孔接种上述细胞，在培养24h后，分别按M0I=5的感染复数接种AdMAFP-SIL-24V， AdMAFP-NSIL-24V缺陷型腺病毒，先轻摇2h然后吸除上清，再换用2%血清培养液，培养 48h,收集细胞，以不加病毒的细胞同步培养作为对照，用AdMAFP-GFPV实验组在荧光显微镜下观察指示病毒包装，用测定Iuciferase酶活性来判定鼠源AFP启动子的活性，按 TataRa 公司 Protein and RNA Extraction Kit 试剂盒的说明分别提取 AdMAFP-SIL_24V， AdMAFP-NSIL-24V组的细胞提取液，并以提取液进行SDS-Page电泳，用Western Blotting 分析 IL-24 在 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V 中的表达，其中 IL-24 与 IL-24 单克隆抗体购自SANTA公司，WB方法为常规方法。用常规LUCIFERASE酶法测定Iuciferase的活性。表达片段可以参考见说明书附图中的图2
结果表明，AFP启动子能介导外源基因在肝癌细胞中特异性高效表达，在正常的肝细胞及非肝癌组织来源的细胞中不表达，同时腺病毒介导的IL-24在肝癌中表达时有高度的糖基化。LUCIFERASE酶活测定结果与IL-24的WB检测结果相一致。实施例2、人源AFP启动子替换CMV启动子的腺病毒载体介导的IL-24在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用，其中腺病毒载体中CMV启动子被人源AFP启动子所取代， IL-24位于AFP启动子下游。1 试剂材料核酸内切酶为Ferments公司产品，腺病毒质粒pDC315、 pPGHloxPAE3购自深圳市百恩维生物科技有限公司，H印3B、!fepG II、SMMC27721、正常肝细胞系L02、Hela为本实验室保存，293购自武汉大学CCTCC。2 引物
HAFPl AAGCTTTAGAAAATCCTGGTGC HAFP2 TGTTATTGGCAGTGGTGGA IL2401 ATGAATTTTCAACAGAGGCTGCA,IL2402 CAAAGTGAAACTCTTGGCCCTGGGT IL2403 GCCCAGGGCCAAGAGTTTCACTTT IL2404 TCAGAGCTTGTAGAATTTCTGCATCCA IL2405 ATG GGGGCCCAGGGCCAAGA LUC-f ATGGAAGACGCCAAAAACATA LUC-R TTACACGGCGATCTTTCC eGFP-F: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG eGFP-R TCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG 以上引物均为上海生物工程有限公司合成。3 方法
3. 1人源AFP启动子的扩增基本方法参照《分子克隆》，取H印G II细胞参照TataRa Blood Goneme DNA Extraction KIT(D9081)的操作说明提取基因组DNA。以 HAFPl 与 HAFP2 为引物从H印G II基因组中克隆人源AFP启动子，切胶回收片段，双酶切插入质粒PDC315 相应位点，替代PDC315中原有的CMV启动子，构建AFP控制的表达载体AdHAFP。结果从H印G II中扩增的AFP启动子大小为981bp，经双酶切鉴定后测序，所测定的序列如下
aagctttagaaaatcctggtgcctgggtctcaactccacagattctgatttaactggtctgggttacagact aggcattgggaattcaaaaagttcccccagtgattctaatgtgtagccaagatcgggaacccttgtagacagggatg ataggaggtgagccactcttagcatccatcatttagtattaacatcatcatcttgagttgctaagtgaatgatgcac ctgacccactttataaagacacatgtgcaaataaaattattataggacttggtttattagggcttgtgctctaagtt ttctatgttaagccatacatcgcatattaaatactttaaaatgtaccttattgacatacatattaagtgaaaagtgt ttctgagctaaacaatgacaacataattatcaagcaatgataatttgaaatgaatttattattctgcaacttaggga caagtcatctctctgaattttttgtactttgagagtatttgttatatttgcaagatgaagagtctgaatcggtcaga caatctcttgtgtgcctggcatatgataggcatttaatagttttaaagaattaatgtatttagatgaattgcatacc aaatctgctgtcttttctttatggcttcattaacttaatttgagagaaattaattattctgcaacttagggacaagt catctctttgaatattctgtagtttgaggagaatatttgttatatttgcaaaataaaataagtttgcaagttttttt tttctgccccaaagagctctgtgtccttgaacataaaatacaaataaccgctatgctgttaattattggcaaatgtc ccattttcaacctaaggaaataccataaagtaacagatataccaacaaaaggttactagttaacaggcattgcctga aaagagtataaaagaatttcagcatgattttccatattgtgcttccaccactgccaataaca
3.2 IL-24基因的克隆IL-24基因购自武汉三鹰公司，分别按下图的方式LUC、 SIL-24与NSIL-24基因克隆方法与实施例1相同，这些基因经双酶切后，分别构建到 AdHAFP 中，最后的质粒分另命名为 AdHAFP-SIL-24，AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC， AdHAFP-GFP。其中AdHAFP-GFP主要用于病毒包装指示用，AdHAFP-LUC主要用于阴性对照。 3.3腺病毒的重组按腺病毒载体操作手册进行，具体方法参照实施例1， 将鉴定正确的增殖缺陷型腺病毒命名分别命名为AdHAFP-SIL-24，AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC, AdHAFP-GFP。进行大量扩增、纯化与滴度测定。结果腺病毒AdHAFP-SIL-24，AdHAFP-NSIL-24，AdHAFP-LUC，AdHAFP-GFP。在 293细胞内反复扩增，CsCl超速离心纯化，获得高度浓缩的病毒液。经TCID50测定，AdHAFP-S IL-24，AdHAFP-NS I L-24, AdHAFP-LUC, AdHAFP-GFP。病毒滴度分别是达 5. 6XlOlOpfu /ml、5. OX IOlOpfu /ml、4. 2 XlOlOpfu /ml, 5. 1 XlOlOpfu /ml。3.4 IL-24定向表达的测定测定所用的细胞系分别为肝癌细胞系H印3B、 IfepG II以及对照细胞系(正常肝细胞系L02与Hela)，分别用六孔板按5X104细胞数/孔接种上述细胞，在培养24h 后，分别按M0I=5的感染复数接种AdHAFP-SIL-24， AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC，AdHAFP-GFP。缺陷型腺病毒，先轻摇2h然后吸除上清， 再换用2%血清培养液，培养48h，收集细胞，以不加病毒的细胞同步培养作为对照，用 AdHAFP-GFPV实验组在荧光显微镜下观察指示病毒包装，用测定Iuciferase酶活性来判定人源与鼠源AFP启动子的活性，按TataRa公司Protein and RNA Extraction Kit试剂盒的说明分别提取AdHAFP-SIL-24V与AdHAFP-NSIL-24V组的细胞提取液，并以提取液进行 SDS-Page 电泳，用 Western Blotting 分析 IL-24 在 AdHAFP-SIL-24V 与 AdHAFP-NSIL-24V 中的表达，其中IL-24与IL-24单克隆抗体购自SANTA公司，WB方法为常规方法。用常规 LUCIFERASE酶法测定Iuciferase的活性。结果表明，AFP启动子能介导外源基因在肝癌细胞中特异性表达，在正常的肝细胞及非肝癌组织来源的细胞中不表达。实施例3 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 诱导肝癌细胞凋亡的效果。用流式细胞仪测定AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdHAFP-LUCV，对肝癌细胞凋亡的影响。肝癌细胞系和正常肝细胞系培养条件为含10%小牛血清、100 mg/L链霉素以及100 mU/L青霉素的RPMI 1640培养基、37 ！及5% C02。细胞培养至至对数生长期，消化，稀释，计数，转种至24孔板中培养，105细胞数/孔，培养24h;去除培养液，每孔加入约Iml无血清培养液，以MO I =50分别加入上述病毒，对照组为AdHAFP-LUCV，孵育 90min,加入含 5% FBS 的培养液。AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdHAFP-LUCV，处理 24 h 后，离心收集细胞并用冷的 PBS 洗两次，然后用75%酒精重悬，-20°C冰箱固定过夜，固定过的细胞用600g离心力离心回收，再用冰预冷的PBS洗涤两次，然后用溶于PBS的100 ug/ml RNase A在37 °C处理lh， 最后在黑暗中4 °C冰箱PI (20 ug/ml)处理30 min，最后上机测定。实验结果显示图可以参考见说明书附图中的图3
实验结果表明 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 能明显诱导肝癌凋亡，而对正常肝细胞及Hela细胞没有明显影响，而对照组AdMAFP-LUCV， AdHAFP-LUCV 则诱导肝癌凋亡效率较低，表明 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V对肝癌凋亡的诱导作用主要是IL-24本身，并且AFP能启动外源基因在肝癌细胞中特异性表达，同时结果还显示AdMAFP-SIL-24V， AdHAFP-SIL-24V 的效果要比 AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-NSIL-24V 高，这可能与 IL-24 的外分泌对肝癌凋亡有放大作用，能引导强烈的旁路抗肿瘤效应。表明AdMAFP-SIL-24V， AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 都具有开发成特异性抗肝癌基因治疗新药，其中优以AdMAFP-SIL-24V与AdHAFP-SIL-24V为最佳。


本发明提供的是一种带人源或鼠源AFP启动子的腺病毒载体介导的IL-24在制备肝癌靶向性基因治疗药物中的应用，即用人源或鼠源AFP启动子取代腺病毒载体中CMV启动子,并将IL-24基因克隆到AFP启动子下游,使IL-24在组织特异性启动子AFP的控制下特异性表达,即仅在肝癌细胞中表达,在正常肝细胞及其它组织来源的细胞中不表达,从而诱导肝癌细胞凋亡,达到靶向性治疗肝癌的目的。本发明的优点在于1.实现将治疗基因、高效的基因传递载体、治疗基因表达的调控有效综合利用实现对肝癌的靶向治疗作用；2.副作用低；3.与放疗和化疗联合使用可以增强其效果；4.对已扩散的癌细胞具有较好的治疗作用。