专利名称：紫杉醇隐形脂质体的制作方法紫杉醇(paclitaxel，商品名Tacxol)是来源于红豆杉植物树皮或化学合成的一种广谱抗癌新药。由于紫杉醇不溶于水，现行制剂配方中是以无水乙醇和聚氧乙烯蓖麻油作为助溶载体，后者可以引起组织胺释放，导致严重的过敏反应，因而限制了该制剂的临床应用。脂质体(liposome)是一种新的药物释放系统。传统脂质体由于粒径较大(在1μm以上)、包封率低、稳定性差、易渗漏、融合，特别是容易被网状内皮系统(RES)的吞噬细胞将其从血液循环中清除，从而减少了到达肿瘤组织部位的药量。1998年起，美国FDA相继批准了4个脂质体制剂上市，这些脂质体的粒径小于100nm(也称为″脂质纳米粒″)，包封率达到90％以上，提高了稳定性，不发生融合和渗漏。由于它的粒径很小，在体内可以躲过网状内皮系统的捕获，因而被称为″隐形脂质体″(stealthliposomes)。本项目标的为紫杉醇隐形脂质体，是一种新型的缓释、靶向制剂。紫杉醇是目前世界上公认的疗效最好的一种抗癌药物，具有广泛的临床应用前景。开发紫杉醇的新缓释靶向制剂是紫杉醇广泛应用的关键，它必将取代现行的制剂。创新性及特征 我们采用两亲性聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)修饰脂质体膜，使包封抗癌药物紫杉醇的隐形脂质体的粒径小于100nm，包封率≥98％。PEG-DSPE是隐形脂质体膜材的关键成分，由于PEG-DSPE含有亲水基团，可使脂质体表面高度修饰，交错重叠覆盖于脂质体表面，形成致密的构象云。这种立体位阻保护脂质体不被血液中的调理素识别、摄取，从而降低了与MPS的亲和力，使脂质体的清除速度减慢。在血液中的驻留时间明显延长，有利于肿瘤组织及病理部位的吸收。另外，脂质体膜材中引入聚乙二醇衍生物可使脂质体的粒径做到小于100nm，使之成为脂质纳米粒，并大大加强了脂质体的稳定性。动物试验结果表明，iv24h后，紫杉醇隐形脂质体在血液中驻留35％以上，在肝脾网状内皮系统中摄取不足10％。证明紫杉醇隐形脂质体延长了在血液循环中的时间(缓释)并减少了网状内皮系统的吞噬，血液AUC隐形脂质体约为传统脂质体的2倍。紫杉醇隐形脂质体抗肿瘤作用的研究，与目前临床使用的泰素或紫素相比较，表明紫杉醇隐形脂质体比泰素或紫杉醇传统脂质体抑瘤作用提高了2倍，生存率提高了1倍。实施例1、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)的合成聚乙二醇-2000溶于干燥的苯，加入1，1’-羰基二咪唑，使终摩尔比为1∶1.1，通氮密封加热至75℃，至少16h。静置冷却至室温，直到产生的聚乙二醇-羰基咪唑衍生物溶液变清，真空干燥。将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶于氯仿，加入聚乙二醇羰基咪唑衍生物，使摩尔比为1∶2，蒸出氯仿，加入溶于苯的三乙胺，使三乙胺与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的摩尔比1∶1。密封加热95℃，6h。冷却至室温，真空干燥。溶于乙醇-水(4∶1)，上硅胶-60色谱柱纯化，得到PEG-DSPE。2、紫杉醇隐形脂质体的制备将PEG-DSPE，氢化大豆磷脂，胆固醇，α-生育酚和紫杉醇以15∶185∶100∶1.85∶5.2摩尔比精确称重后溶于氯仿，置梨形瓶内，在氮气流下旋转蒸发，减压出去溶媒。真空干燥2～3d，得恒重薄膜。加0.02mol·L-1Tris-HCL缓冲液(PH7.0，含0.15mol·L-1NaCl)，旋转摇动梨形瓶，得到脂质体悬液。用氮气冲洗后，封口室温下平衡1d，探针超声处理15min，然后在500kPa操作压力下通过微流态化器混合室，经60～80冲程的微流态化处理，使脂质体粒径逐渐减小。最后对5.4％葡萄糖溶液透析除盐，得紫杉醇隐形脂质体。再经冷冻干燥制成冻干制剂。3、粒径和包封率测定粒径及分布测定取脂质体样品适量，用20mmol·L-1磷酸盐缓冲液(PH7.0)稀释至脂质体浓度为0.1mg·mL-1，进样量1.0mL，用粒径测定仪经乱反射测定脂质体粒径及分布。包封率测定 分离效果考察精确称取脂质体10mg，加入20mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH7.0)10mL，于2795×g离心10min，取沉淀，真空干燥，溶于甲醇并定容一定体积，依文献(阎家麒等，紫杉醇原料药纯度的RP-HPLC测定，中国医药工业杂志，1996，27(10)455)采用RP-HPLC法测定游离紫杉醇量。色谱条件五氟苯基柱(4.6mm×250mm)，乙腈-水(70∶30)为流动相，流速2.0mL·min-1，进样量10μL，检测波长227nm。以磷酸盐缓冲液作空白。用共沉淀-微流态化法制备紫杉醇隐形脂质体，其平均粒径为80.0±18.2nm，≤100nm，包封率≥98％，隐形脂质体的粒径显著小于传统脂质体(＞1000nm)，包封率前者高于后者(后者为89.40％±3.42％)。4、稳定性考察 取紫杉醇隐形脂质体样品适量，用生理盐水水化，配制成1.0mg·mL-1的溶液。于室温下放置150d，重新测定粒径和包封率，考察其稳定性。紫杉醇隐形脂质体水化后，室温下存放150d，粒径和包封率无明显变化，未发生融合与渗漏。5脂质体在小鼠体内的组织分布泰素浓缩注射液，紫杉醇传统脂质体和紫杉醇隐形脂质体均周生理盐水稀释至紫杉醇剂量0.5mg·mL-1，给药量5mg·kg-1尾静脉注射。每种制剂均分为肝，脾和血浆3组，随机分为每组12只小鼠。给药后于1，3，6，12，24和48h将小鼠断颈活杀，取血用肝素抗凝，离心分离血浆。分别摘取肝，脾，清除脏器周围结缔组织后，用蒸馏水洗净，滤纸吸干，精确称量，-20℃保存备用。取脏器组织标本置于匀浆器内，加入磷酸盐缓冲液(pH7.0)1mL，3000r·min-1匀浆1min。于组织匀浆(或血浆)内加入内标物(1.2μg·mL-1地西泮水溶液)和乙腈-氯丁烷(1∶4)3mL，震荡混合5min后移至离心管，4000×g离心5min。用吸管将有机相移至另一洁净试管内，60℃下用氮气吹干。残留物溶于120μL流动相，吸取20μL进样，进行RP-HPLC测定。色谱条件五氟苯基柱(4.6mm×250mm)，流动相甲醇-乙腈-水(25∶40∶39)，流速1.2mL·min-1，检测波长227nm，室温下操作，检测灵敏度0.0005AUFS。数据处理方法小鼠体内组织分布的血药浓度数据用中国药理学会数学药理委员会编制的3P87药动学程序进行处理。药时曲线下面积(AUC0～8)分别由梯形法(AUC0～tz)和ctz/λ(AUCtz～∞)之和求得，并经过对数转换后进行方差分析。
血液药时曲线下面积(AUC)数值表明，隐形脂质体约为传统脂质体的2.0倍，Blod/RES比值前者iv隐形脂质体24h后，其中的35％以上剂量驻留在血液中，富含网状内皮细胞的肝脾组织只摄取不到10％；而不含PEG-DSPE的传统脂质体在血液中驻留不足10％，肝脾组织摄取了50％以上。
6、紫杉醇隐形脂质体的抗肿瘤作用抗肿瘤作用试验以colon 26 carcinoma荷瘤BALB/c小鼠为实验动物，接种瘤细胞后约8d，当肿瘤直径达到8mm时开始治疗。以6mg/kg和12.5mg/kg剂量静注，记录肿瘤增长和生存率。肿瘤抑制率的比较，治疗7d，在6mg/kg剂量组显示紫杉醇隐形脂质体比紫杉醇传统脂质体和泰素高1倍。在12.5mg/kg组，治疗14d时，紫杉醇隐形脂质体为后两组的2倍。生存率比较结果表明，在12.5mg/kg剂量组，紫杉醇隐形脂质体的生存率比紫杉醇传统脂质体和泰素提高了1倍。


采用共沉淀和微流态化两步法制备紫杉醇隐形脂质体，用两亲性聚乙二醇－二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG－DSPE)修饰脂质体膜。使脂质体的粒径小于100nm，药物包封率≥98％。紫杉醇隐形脂质体在体内可以躲过肝脾网状内皮系统的捕捉吞噬，延长了在血液内循环时间。抗肿瘤作用显示，紫杉醇隐形脂质体较传统紫杉醇脂质体和泰素对肿瘤的抑制作用提高了2倍，生存率提高了1倍。