脱精氨酸补体3f（DRC3f）在治疗肝损伤中的应用的制作方法[0002]肝脏疾病是一个巨大的全球性公共卫生问题，它威胁着数十亿人的健康。更严重的是，许多肝脏疾病的发病率正在逐渐升高。移民人数的增加，频繁的旅行和经济全球化都导致了病毒的广泛传播。肥胖引起的脂肪性肝炎也成为了新的健康问题；大量酒精的摄入可以导致脂肪肝，酒精性肝炎，甚至肝硬化。目前全球慢性乙型肝炎感染者已达4亿人口，多达2000万人口有暴露证据，约一亿七千万人口感染丙肝。肝脏的结构和功能都较复杂，作为蛋白质合成和储存的重要器官，为机体运转和调节其他组织器官的稳定提供各种物质，这些因素都暗示肝脏疾病的治疗是十分复杂，充满困难的。[0003]Con A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤模型与人类病毒性肝炎和自身免疫性肝炎的病理学机制相似，经Con A刺激导致小鼠肝细胞坏死和凋亡，伴随血清ALT和AST水平的升高，并且，有大量的T细胞、NKT细胞和Kuffer细胞等淋巴细胞向肝脏浸润。Con A诱导的急性肝损伤模型具有造模周期短，可重复性高，与人类肝炎发病机制类似等优点，已被广泛应用于肝炎治疗方法和机制的研究中。[0004]随着现代人们生活饮食结构的变化，被称为现代“富贵病”的脂肪性肝病(也称脂肪肝)的发病率明显提高，已经成为仅次于病毒性肝炎的第二大高发性肝病，严重威胁着人类健康。脂肪性肝病可由多种诱因引起，病变主要位于肝小叶，是常见的弥漫性肝病之一，以肝细胞内甘油三酯(TG)过量蓄积和弥漫性肝细胞脂肪变性为主要病理特征，可进展为肝纤维化、肝硬化、肝功能衰竭，因此对该病的早期诊断及治疗非常重要。非酒精性脂肪肝的治疗分为非药物治疗和药物治疗，前者仅适用于轻度脂肪肝患者，包括体育锻炼、减轻体重、控制饮食、去除病因等手段。脂肪肝患者血中的胆固醇和甘油三酯水平又往往与膳食中胆固醇和脂肪摄入量密切相关，低热能、低脂、高膳食纤维的平衡膳食可以改善血脂代谢，降低肝脏脂肪的蓄积，并可将肠道中过多的脂肪、毒素等排出体外，从而起到降脂作用；节制饮食可有效降低体重，并能改善肝功能，促进肿大的肝脏回缩及肝内脂肪减少。有效合理的运动，可减少体内脂肪，减轻体重；促进脂肪组织分解，降低血脂，减少内脏脂肪的沉积，从而起到防治脂肪肝的目的。然而，中重度脂肪肝患者无法通过非药物疗法有效清除肝脏脂肪，化学药物治疗主是通过二甲双胍和噻唑烷二酮等胰岛素受体激动剂(胰岛素增敏剂)、奥利司他和西布曲明等减肥药、他汀类和贝特类降血脂药物、维生素E、维生素C等抗氧化剂、肝细胞保护剂和利胆保肝药、细胞因子抑制剂以及CYP抑制剂等药物进行治疗。但是，大多数降脂药物对肝内脂肪消除作用有限，许多降脂药可导致不同程度肝细胞损伤，因此降脂药在脂肪肝 治疗中的作用和地位尚有争论。[0005]DRC3f是补体3f在羧基肽酶-N作用下脱精氨酸的衍生物，由十六个氨基酸组成，序列为 ME-Ser-Ser-Lys-1le-Thr-His-Arg-1le-His-Trp-Glu-Ser-Ala-Ser-Leu-Leu-COOH，分子量为186^^，等电点8.51。补体是炎症和免疫应答的重要调节因子，补体系统中至少有30种糖蛋白具有调节肝脏再生、免疫应答及其他重要生理过程的作用。补体中C3含量最高，在补体激活的过程中，C3活化形成的C3b在补体受体I或H因子作用下分解为灭活的iC3b和17肽C3f，进而生成DRC3f。据报道，DRC3f在系统性硬化病人血清中可以检测到，合成的DRC3f或C3f以及含有DRC3f的血清均可以促进皮肤细胞和肺细胞的微血管内皮细胞的增生，在皮肤细胞中还可以促进TGF-β I的产生，表明DRC3f是血清中小分子生长因子之一。
[0006]本发明的目的是提供一种脱精氨酸补体3f (DRC3f)在治疗肝损伤中的应用，脱精氨酸补体3f (DRC3f)可以显著降低Con A诱导的急性肝损伤中血清ALT、AST水平，抑制肝细胞坏死和/凋亡，可显著提高急性肝损伤小鼠的生存率并延长生存时间，抑制肝损伤中T细胞、NKT细胞向肝组织浸润，促进肝细胞的增殖；在慢性肝损伤中，不仅能够显著降低血清ALT、AST、CHOL, TG水平，而且能抑制肝细胞脂肪变性和脂肪含量上升。[0007]本发明提供脱精氨酸补体3f (DRC3f)在制备预防和/或治疗肝损伤的产品中的应用。
[0008]上述应用中，所述肝损伤为急性肝损伤或慢性肝损伤；
[0009]所述急性肝损伤具体为急性免疫性肝损伤；
[0010]所述慢性肝损伤具体为脂肪肝。
[0011]脱精氨酸补体3f (DRC3f)在制备抑制肝损伤时血清中谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶水平上升的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0012]脱精氨酸补体3f (DRC3f)在制备抑制肝损伤中肝细胞坏死和/或凋亡的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0013]脱精氨酸补体3f (DRC3f)在制备促进肝损伤中肝细胞增殖的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0014]或，
[0015]脱精氨酸补体3f (DRC3f)在制备抑制肝损伤中T细胞和/或NKT细胞向肝组织浸润的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0016]上述任一所述的应用中，所述肝损伤为急性肝损伤；
[0017]所述急性肝损伤具体为急性免疫性肝损伤。
[0018]脱精氨酸补体3f (DRC3f)在制备抑制肝损伤时血清中谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶和/或血清总胆固醇和/或血清甘油三酯水平上升的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019]上述应用中，所述肝损伤为慢性肝损伤；
[0020]所述慢性肝损伤具体为脂肪肝。
[0021]脱精氨酸补体3f (DRC3f)在制备抑制肝细胞脂肪变性的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0022]或，
[0023] 脱精氨酸补体3f (DRC3f)在制备抑制肝组织中游离脂肪的含量上升的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024]上述任一所述的应用中，所述脱精氨酸补体3f (DRC3f)的氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0025]本发明提供的脱精氨酸补体3f (DRC3f)预处理可以减弱Con A诱导的肝损伤，该多肽对Con A诱导肝损伤的保护性作用可能与抑制肝细胞凋亡，促进肝细胞增殖，抑制T细胞、NKT细胞向肝组织浸润有关，Con A刺激后给予DRC3f治疗也可以减轻Con A诱导肝损伤的程度，并且改善生存情况。另外，在脂肪肝的治疗实验中，高剂量的DRC3f能显著降低血清中的ALT、AST、CHOL水平，也能够明显降低肝脏脂肪变性程度及肝脏游离脂肪的含量。因此，本发明为临床肝病的治疗提供了新的可能的方向和具体措施。



[0026]图1急性肝损伤预防实验中给予Con A刺激后12h小鼠血清ALT和AST水平的测定结果和肝组织HE染色结果。
[0027]图2急性肝损伤预防实验中各组小鼠的肝细胞凋亡和细胞周期检测。
[0028]图3急性肝损伤预防实验中流式细胞术测定肝组织各淋巴细胞(T细胞、NK细胞、NKT细胞)浸润比例结果。
[0029]图4急性肝损伤预防实验中各组小鼠注射Con A后72h之内的生存率。
[0030]图5急性肝损伤治疗实验中给予Con A刺激后12h小鼠血清ALT和AST水平的测定结果和肝组织HE染色结果。
[0031]图6急性肝损伤治疗实验中各组小鼠注射Con A后72h之内的生存率。
[0032]图7脂肪肝各组大鼠的血清ALT检测结果。
[0033]图8脂肪肝各组大鼠的血清AST检测结果。
[0034]图9脂肪肝各组大鼠的血清TBIL检测结果。
[0035]图10脂肪肝各组大鼠的血清CHOL检测结果。
[0036]图11脂肪肝各组大鼠的血清TG检测结果。
[0037]图12脂肪肝组织的HE染色结果。
[0038]图13脂肪肝组织冰冻切片的苏丹染色结果。

[0039]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0041]下述实施例中的实验数据以均数土标准差^土S)表示，多组计量资料的比较采用方差分析或Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用LSD检验。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。所有数据均采用SPSS13.0软件进行统计分析，P〈0.05为差异具有统计学意义。
[0042]雄性Balb/c近交系小鼠(6-8周，18_22g)购自河北医科大学实验动物中心。
[0043]脱精氨酸补体3f (DRC3f)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，为NH2-Ser-Ser_Lys-1Ie-Thr-His-Arg-1Ie-His-Trp-Glu-Ser-Ala-Ser-Leu-Leu-COOH,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，经HPLC纯度分析合成含量大于98.17%。[0044]IV型刀豆蛋白A (Con A)购自美国Sigma公司。
[0045]地塞米松注射液购自石药集团欧意药业有限公司。
[0046]0.9%生理盐水购自石家庄四药有限公司。
[0047]小鼠淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司。
[0048]胰酶购自北京索莱宝科技有限公司。
[0049]胎牛血清购自美国Hyclone公司。
[0050]FITC标记抗小鼠⑶3e抗体、PE 标记抗小鼠DX5抗体购自美国BD公司。
[0051]Con A 注射液:
[0052]Con A 冻干粉 IOOmg
[0053]无菌生理盐水 5ml
[0054]用枪头反复吹打直至Con A冻干粉完全溶解，按照每管Iml分装在1.5ml EP管中，-20°C保存。使用前用无菌生理盐水稀释给药。
[0055]DRC3f 注射液:
[0056]DRC3f 冻干粉 5mg
[0057]无菌生理盐水 2ml
[0058]用枪头反复吹打直至DRC3f冻干粉完全溶解后，_20°C保存。按照每管500 μ I分装在1.5ml EP管中，使用前用无菌生理盐水稀释给药。
[0059]4%多聚甲醛溶液的配制:
[0060]多聚甲醛40g
[0061]Na2HPO4.12H20 29g
[0062]NaH2PO4.2H20 2.95g
[0063]双蒸水600ml
[0064]将上述组分在50°C条件下，充分搅拌，直至完全溶解，调pH=7.4，加双蒸水定容至IL0
[0065]雄性SD大鼠(180_200g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0066]复方甘草酸苷购自西安利君制药有限责任公司。
[0067]降脂通络软胶囊购自神威药业集团有限公司。
[0068]橄榄油购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0069]胆酸钠购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0070]胆固醇购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0071]甲基硫氧嘧啶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0072]高脂饲料配制:猪油15%，总胆固醇(Tc) 2.8%，甲基硫氧嘧啶0.28%，胆酸钠0.7%，普通饲料81.2%，%代表质量百分含量。
[0073]普通饲料购自河北医科大学实验动物中心。
[0074]PI染液的配制:生理盐水129.6ml、PI10mg、RNase2mg、体积百分含量1.0%TritonX-1000.5ml、枸橼酸钠200mg、加蒸馏水定容至200ml，调pH至7.2~7.6，置4°C冰箱中避
光保存备用。
[0075]下述实施例中的生理盐水均为无菌生理盐水。
[0076]实施例1中Con A所诱导的急性肝损伤为急性免疫性肝损伤。[0077]实施例1、脱精氨酸补体3f (DRC3f)在治疗急性肝损伤中的应用
[0078]一、预防作用实验
[0079](一)实验分组
[0080]将56只雄性Balb/c近交系小鼠(6_8周，18_22g)随机分为7组，即正常对照组、Con A模型组、地塞米松阳性对照组、DRC3fl、DRC3f2、DRC3f3和DRC3f4组，每组8只。
[0081](二)在对各组小鼠(除正常小鼠组)进行尾静脉注射Con A注射液(Con A12mg/kg体重，体积为0.25ml)前lh，分别给予Con A模型组小鼠尾静脉注射0.25ml生理盐水，地塞米松阳性对照组小鼠地塞米松注射液(地塞米松500 μ g/kg体重，体积为0.25ml),同时分别给予 DRC3fl、DRC3f2、DRC3f3 和 DRC3f4 组小鼠 DRC3f 注射液(DRC3f 分别为 200、400、800、1600 μ g/kg 体重，体积均为 0.25ml)ο
[0082]正常对照组的小鼠给予尾静脉注射0.25ml生理盐水两次，为排除时间影响，两次注射生理盐水时间与上述其他各组相同。
[0083]于Con A注射后12h处死各组小鼠，收集各组小鼠的血液和肝组织进行后续指标测定。
[0084](三)小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平的测定
[0085]血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平是衡量肝功能的指标。
[0086]在给予Con A刺激后12h将小鼠麻醉，心内取血，将血液置于不加抗凝剂的无菌EP管中，并将EP管置于37°C恒温箱中温浴30min，再置于4°C冰箱中Ih ;取出EP管，放入低温离心机内，4°C，3000g离心15min ;小心吸取上层血清放于另一无菌EP管中，沉淀弃去。将分离的血清用无菌生理盐水4倍稀释后，使用丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒和门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒(均购自北京九强生物技术有限公司)检测谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平。
[0087]给予Con A刺激后12h小鼠血清ALT和AST水平的测定结果如图1A和IB所示。
[0088]图1A 和 IB 中，* 代表 Ρ〈0.05，** 代表 P〈0.01,*** 代表 Ρ〈0.001，均表示与 Con A 模型组相比；+代表ρ〈0.05，++Ρ代表〈0.01，+++代表？〈0.001，均表示与地塞米松阳性对照组相比。
[0089]图1A表明，经Con A刺激12h后，Con A模型组小鼠血清ALT和AST水平显著高于正常对照 组(P〈0.001);与Con A模型组小鼠相比，地塞米松阳性对照组小鼠在给予地塞米松预处理的条件下可以显著降低血清中ALT和AST水平(P〈0.001);与ConA模型组小鼠相比，不同剂量的DRC3f预处理组小鼠(DRC3f200、400、800、1600 μ g/kg体重组)也显著降低了血清ALT和AST水平，有剂量反应关系，与Con A模型组相比，差异均具有统计学意义(P〈0.05)，其中，DRC3f3组的作用最为明显，与地塞米松阳性对照组效果相比，差别无统计学意义。
[0090](四)肝组织石蜡包埋及HE染色
[0091]在给予Con A刺激后12h处死小鼠；快速打开腹腔，分离肝脏，切取肝右叶特定位置合适大小的肝组织，置于体积百分含量为4%的多聚甲醛溶液中固定24h ;固定后进行石蜡包埋，分别进行5μ m的连续切片，之后按照以下步骤进行HE染色:
[0092]二甲苯脱腊一梯度酒精脱水一自来水冲洗Imin —苏木精染色5min —自来水冲洗3min —体积百分含量1%的盐酸水溶液30s —自来水冲洗3min —体积百分含量1%的氨水水溶液30s —自来水冲洗4min —伊红染色Imin —酒精梯度脱水一二甲苯透明一中性树胶封片。
[0093]给予Con A刺激后12h小鼠肝组织石蜡包埋及HE染色结果如图1B所示。
[0094]图1B中，a代表正常对照组，b代表Con A模型组，c代表地塞米松阳性对照组，d，e, f, g分别代表DRC3fl、DRC3f2、DRC3f3和DRC3f4组。箭头指示的为坏死区，Scale bar,50 μ m0
[0095]图1B表明，Con A模型组小鼠肝组织可见大面积的肝细胞坏死；与Con A模型组小鼠相比，地塞米松阳性对照组小鼠在给予地塞米松预处理的条件下可以显著改善肝细胞坏死情况；与(:0114模型组小鼠相比，给予不同剂量的01^3?ご?碜?01^3?00、400、800、1600 μ g/kg体重组)小鼠也显著减少了 Con A诱导的肝细胞坏死，DRC3f各剂量组与地塞米松阳性对照组间没有明显差别。说明DRC3f预处理可以显著改善Con A诱导的小鼠肝损伤，改善效果与地塞米松阳性对照组接近。
[0096](五)流式细胞术检测肝细胞凋亡和细胞周期
[0097]1、肝细胞分离
[0098]在给予Con A刺激后12h处死小鼠，打开腹腔和胸腔；左心室进针，用剪刀在右心耳处剪口，用预冷的无菌生理盐水进行心内灌流，冲洗肝脏直至变为灰白色；分离肝脏，移除结缔组织和胆囊，将肝组织剪成小块状，用眼科镊轻搓过200目钢筛，用生理盐水冲洗获得单细胞悬液。将单细胞悬液过300目尼龙网，经1000rpm离心4min,去上清。沉淀用Iml0.5%胰蛋白酶(0.5g胰酶溶解于100mL Hanks液中)重悬，消化2min后加胎牛血清终止消化，以1000rpm,离心4min。去上清,加5ml生理盐水重悬沉淀,沉淀经反复洗2次后重悬于生理盐水中并调整细胞浓度至IXlO6~lXlOVml，得到肝的单细胞悬液。
[0099]2、肝细胞染色及测定
[0100]取步骤I制备的单细胞悬液1ml, 1000rpm离心4min,去上清,得沉淀。取Iml配制好的PI染液，重悬沉淀，4°c避光放置染色30min，转入流式管中，上流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期。
[0101]正常对照组，Con A模型组，地塞米松阳性对照组以及DRC3f各剂量组小鼠的细胞凋亡百分比和细胞周期分别如图2A和2B所示。
[0102]图2中，代表Ρ〈0.001，表示与Con A模型组相比。
[0103]图2Α表明，正常对照组小鼠仅存在(5.32±0.58)%的肝细胞凋亡，而Con A模型组小鼠凋亡的肝细胞比例为(30.25± 1.29)%，与正常对照组相比，Con A模型组小鼠肝细胞凋亡明显增多(Ρ〈0.001);与Con A模型组相比，地塞米松阳性对照组以及DRC3f四个剂量组均能显著改善由Con A诱导的肝细胞凋亡情况(均为P〈0.001)。
[0104]图2B表明，正常对照组小鼠的肝细胞几乎处于静止状态，经Con A刺激后，肝细胞开始分裂，G2/M期细胞百分比增多；不同剂量的DRC3f预处理组小鼠(DRC3fl、DRC3f2、DRC3f3和DRC3f4组)G2/M期肝细胞百分比进一步增多(P〈0.01 )，Gl期细胞百分比下降(P〈0.05)，与ConA模型组相比有统计学差异，S期百分比与ConA模型组相比差异无统计学意义。DRC3fl组与模型组相比各期细胞百分比差别均无统计学意义；与ConA模型组相比，地塞米松阳性对照组Gl期细胞百分比明显增多，S期和G2/M期细胞百分比均下降(Ρ〈0.01)。[0105]图2表明，DRC3f预处理可以抑制肝细胞凋亡，也可促进肝细胞向G2/M分裂期转化，即促进肝细胞增殖。
[0106]3、流式细胞术测定肝组织各淋巴细胞(T细胞、NK细胞、NKT细胞)浸润比例
[0107]I)肝组织淋巴细胞分离
[0108]在给予Con A刺激后12h处死小鼠，肝脏以及肝组织的处理同步骤I的肝细胞分离，再将肝组织剪成小块状，用眼科镊轻搓过200目钢筛，用生理盐水冲洗获得单细胞悬液。将单细胞悬液过300目尼龙网，经1000rpm离心4min,去上清。将沉淀重悬在2ml无菌生理盐水中，小心加在2ml小鼠淋巴细胞分离液液面之上，以2000rpm，离心15min。小心收集管中灰白色中间层至新管中，加入约四倍体积的无菌生理盐水轻轻吹打混匀后以2000rpm，离心20min。去上清，沉淀经无菌生理盐水反复洗2次后重悬于300 μ I生理盐水中，得到淋巴细胞悬液。
[0109]2)淋巴细胞抗体孵育与测定
[0110]将步骤I)得到的淋巴细胞悬液移至流式管中，每个样本两管，在其中一管中加入FITC标记抗小鼠⑶3e抗体和PE标记抗小鼠DX5抗体，另一管中加入对应的同型对照抗体(具体为FITC标记的IgGl同型对照抗体和PE标记的IgM同型对照抗体，均购自美国BD公司)，常温避光孵育30min，根据各淋巴细胞表面所带的抗原与荧光标记的抗体的相互作用得到标记好的待测淋巴细胞，再将其转入流式管，流式细胞仪检测。
[0111]结果如图3所示。
[0112]图3中，#代表P〈0.01，代表P〈0.001，均表示与ConA模型组相比；+代表P〈0.05, ++代表P〈0.01，+++代表P〈0.001，表示与地塞米松阳性对照组相比。
[0113]T细胞和NKT细胞向肝细胞浸润在Con A诱导的肝损伤中发挥着关键的作用，图3表明，正常对照组小鼠肝细胞仅有少量淋巴细胞。与正常对照组小鼠相比，ConA模型组小鼠经Con A刺激后，T细胞和NKT细胞所占百分比增多。DRC3f2、DRC3f3组可以显著减少T细胞和NKT细胞比例(与Con A模型组相比，P均小于0.01)。地塞米松阳性对照组的结果与DRC3f3组的结果相似(与Con模型组相比，Ρ〈0.001)。
[0114](六)生存率实验
[0115]1、实验分组
[0116]将30只雄性Balb/c近交系小鼠(6-8周，18_22g)随机分为3个组，即Con A模型组、地塞米松阳性对照组和DRC3f处理组，每组10只。
[0117]2、在尾静脉注射致死剂量的Con A注射液(Con A25mg/kg体重，体积为0.25ml)前Ih,分别给予Con A模型组、地塞米松阳性对照组和DRC3f处理组小鼠尾静脉注射0.25ml生理盐水、地塞米松注射液(地塞米松500 μ g/kg体重，体积为0.25ml)和DRC3f注射液(DRC3f800 μ g/kg 体重，体积为 0.25ml)。
[0118]观察各组小鼠注射Con A后72h之内的生存情况，每Ih记录一次，然后分别计算各组小鼠的生存率，结果如图4所示。
[0119]图4中，*代表 P〈0.05, #代表P〈0.0I，均表示与Con A模型组相比。
[0120]图4表明，Con A模型组小鼠72h生存率为20%，中位生存时间为Ilh ;而地塞米松阳性对照组和DRC3f处理组分别在进行地塞米松预防性给药和DRC3f预防性给药条件下均能显著改善小鼠的生存情况，生存率分别为80%和70% (分别为P〈0.004和P〈0.01)，中位生存时间均为72h。
[0121]二、治疗作用实验
[0122](一)实验分组
[0123]将32只雄性Balb/c近交系小鼠(6_8周，18_22g)随机分为4组，即正常对照组、Con A模型组、地塞米松阳性对照组和DRC3f3组，每组8只。
[0124](二)给予Con A模型组、地塞米松阳性对照组和DRC3f3组小鼠尾静脉注射ConA注射液(Con A12mg/kg体重,体积为0.25ml) Ih之后,分别给予地塞米松阳性对照组小鼠尾静脉注射地塞米松注射液(地塞米松500 μ g/kg体重，体积为0.25ml)、DRC3f3组小鼠尾静脉注射DRC3f注射液(DRC3f800 μ g/kg体重，体积为0.25ml), Con A模型组小鼠尾静脉注射
0.25ml生理盐水。
[0125]正常对照组:小鼠给 予尾静脉注射0.25ml生理盐水两次，为排除时间影响，两次注射生理盐水的时间与上述其他组的注射时间相同。
[0126]于Con A刺激后12h处死各组小鼠，收集血液和肝组织进行后续指标测定。
[0127](三)小鼠血清ALT和AST水平的测定同步骤一中的(三)
[0128]给予Con A刺激后12h小鼠血清ALT和AST水平的测定结果如图5A所示。
[0129]图5A中，代表P〈0.001，表示与Con A模型组相比；+代表P〈0.05，表示与地塞米松阳性对照组相比。
[0130]图5A表明，经Con A刺激后，Con A模型组小鼠血清ALT和AST水平显著高于正常对照组；与Con A模型组小鼠相比，DRC3f3组给予小鼠800 μ g/kg体重DRC3f治疗可以显著降低中血清ALT和AST水平(均为P〈0.001);同样，地塞米松阳性对照组的实验结果与DRC3f3组的实验结果相似(均为P〈0.001)。
[0131](四)肝组织石蜡包埋及HE染色如步骤一中的(四)
[0132]给予Con A刺激后12h小鼠肝组织石蜡包埋及HE染色结果如图5B所示。
[0133]图5B中，a代表正常对照组，b代表Con A模型组，c代表地塞米松阳性对照组，d代表DRC3f3组。箭头指示的为坏死区，Scale bar, 50 μ m。
[0134]图5B表明，Con A模型组小鼠肝组织可见大面积的肝细胞坏死；与&)114模型组小鼠相比，地塞米松阳性对照组和DRC3f3组可以显著减少Con A诱导的肝细胞坏死。
[0135](五)生存率实验
[0136]1、实验分组
[0137]将30只雄性Balb/c近交系小鼠随机分为3个组，即Con A模型组、地塞米松阳性对照组和DRC3f处理组，每组10只。
[0138]2、在尾静脉注射致死剂量的Con A注射液(Con A25mg/kg体重，体积为0.25ml)30min后，分别给予Con A模型组、地塞米松阳性对照组和DRC3f处理组小鼠尾静脉注射
0.25ml生理盐水、地塞米松注射液(地塞米松500 μ g/kg体重，体积为0.25ml)和DRC3f注射液(DRC3f800 μ g/kg 体重，体积为 0.25ml)。
[0139]观察各组小鼠注射Con A后72h之内的生存情况，每Ih记录一次，然后分别计算各组小鼠的生存率，结果如图6所示。
[0140]图6中，*代表Ρ〈0.05，表示与Con A模型组相比。
[0141]图6表明，Con A模型组小鼠72h生存率为20% ;中位生存时间为13h ；DRC3f处理组小鼠生存率提高至40%，中位生存时间为37h，与Con A模型组相比，差异有统计学意义，P=0.029 ;地塞米松阳性对照组小鼠生存率提高至60%，中位生存时间为72h，与Con A模型组相比，差异有统计学意义，P=O-Oll ;DRC3f处理组与地塞米松阳性对照组相比，差异无统计学意义，P=0.507。DRC3f和地塞米松均能提高注射致死剂量Con A小鼠的生存率，延长生存时间，但是治疗效果均较预防效果略差。
[0142]实施例2、脱精氨酸补体3f (DRC3f)在治疗慢性肝损伤中的应用
[0143]复方甘草酸苷，是临床上治疗脂肪肝的一种常用药，它能够保护肝细胞膜，通过抑制磷脂酶A2的活性达到抗炎保护肝细胞膜的作用；同时能够发挥类固醇样作用，具有抗炎、抗变态反应和类固醇样免疫调节等作用。与此同时它还有NK细胞活化作用、胸腺外T淋巴细胞分化增强作用，对慢性肝病肝纤维化及癌变有抑制效果。
[0144]另一种阳性药物降脂通络软胶囊，主要成分为中药姜黄，其具有活血化瘀行气止痛作用，根据中华心血管病杂志编辑委员会血脂异常防治对策专题组针对血脂异常防治研究发现证实，其降血脂作用机制可能与促进胆囊对胆固醇排泄和抑制脂肪酸合成有关，对药物性肝损害有一定修复作用。
[0145]一、大鼠脂肪肝模型的快速建立
[0146]雄性SD大鼠(180_200g)购买后在动物房适应性培养一周，称量大鼠体重，每隔3天按照3ml/kg腹腔注射10%CC14 (体积百分含量10%的四氯化碳的橄榄油溶液)共4周，同时闻脂词料喂食4周。
[0147]二、实验分组及处理方式
[0148]正常组:雄性SD大鼠购买后在动物房适应性培养一周，正常饲料饲养+生理盐水注射10周(每周3次)。
[0149]将步骤一构建的脂肪肝模型大鼠随机分为以下各组并接受以下处理:
[0150]DRC3f低剂量组(200 μ g/kg):按照大鼠体重尾静脉注射DRC3f (200 μ g/kg，给药剂量2ml/kg.次)，每周3次，治疗6周；
[0151]DRC3f中剂量组(400 μ g/kg):按照大鼠体重尾静脉注射DRC3f (400 μ g/kg，给药剂量2ml/kg.次)，每周3次，治疗6周；
[0152]DRC3f高剂量组(800 μ g/kg):按照大鼠体重尾静脉注射DRC3f (800 μ g/kg，给药剂量2ml/kg.次)，每周3次，治疗6周；
[0153]西药组(复方甘草酸苷):复方甘草酸苷稀释液灌胃治疗(复方甘草酸苷用生理盐水稀释至60mg/ml,给药剂量2ml/kg.次),每周三次,治疗6周；
[0154]中药组(降脂通络软胶囊):降脂通络软胶囊稀释液灌胃治疗(降脂通络软胶囊用生理盐水稀释至40mg/ml,给药剂量2ml/kg.次),每周三次,治疗6周；
[0155]模型组:通过尾静脉分别在相应给药时点给予大鼠生理盐水(给药剂量2ml/kg.次)治疗6周。
[0156]上述实验，DRC3f低、中、高剂量组及模型组每组8只，西药组、中药组每组12只，各组给药时间均保持一致。
[0157]三、血清学指标检测
[0158]末次治疗后将大鼠禁食12h后，剖杀大鼠收集血液，分离血清应用CHEMIX-180全自动生化分析仪(购自日本Sysmex公司)检测肝功能(血清ALT、AST活性，血清总胆红素TBIL水平)、血清甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(CHOL)等指标的变化情况。
[0159]各组大鼠的血清ALT检测结果如图7所示。
[0160]图7中，*代表？〈0.05，#代表？〈0.01，均与模型组相比。
[0161]图7表明，DRC3f低剂量组、DRC3f高剂量组、西药组、中药组及正常组血清ALT水平均显著低于模型组；DRC3f中剂量组血清ALT水平与模型组无明显差异(P>0.05)，3个DRC3f剂量组与西药组无明显差异(P>0.05)。
[0162]各组大鼠的血清AST检测结果如图8所示。
[0163]图8中，*代表P〈0.05，#代表P〈0.01，均与模型组相比；▲代表p〈0.05，与西药
组相比。
[0164]图8表明，DRC3f低剂量组、DRC3f高剂量组及正常组血清AST水平均显著低于模型组(P〈0.05) ;DRC3f中剂量组、西药组、中药组血清AST水平与模型组无明显差异(P>0.05)，DRC3f高剂量组的血清AST水平与西药组有明显差异(P〈0.05)。
[0165]各组大鼠的血清TBIL检测结果如图9所示。
[0166]图9表明，DRC3f低剂量组、DRC3f中剂量组、DRC3f高剂量组、西药组、中药组及正常组血清TBIL水平与模型组无明显差异(P>0.05)。3个DRC3f剂量组的血清TBIL水平与西药组无明显差异(P>0.05)。
[0167]各组大鼠的血清CHOL检测结果如图10所示。
[0168]图10中，#代表P〈0.01，与模型组相比。▲▲代表p〈0.01，与西药组相比。
[0169]图10表明，DRC3f低剂量组、DRC3f中剂量组、DRC3f高剂量组血清CHOL水平均显著低于模型组(P〈0.01);西药组、中药组及正常组血清CHOL水平与模型组无明显差异(P>0.05)。DRC3f中剂量组、DRC3f高剂量组的血清CHOL水平与西药组有明显差异(Ρ〈0.01)。
[0170]各组大鼠的血清TG检测结果如图11所示。
[0171]图11中，#代表Ρ〈0.01，与模型组相比。▲▲代表ρ〈0.01，与西药组相比。
[0172]图11表明，DRC3f低剂量组、西药组、中药组、正常组血清TG水平均显著低于模型组(P〈0.01)；DRC3f中剂量组、DRC3f高剂量组血清TG水平与模型组无明显差异(P>0.05)。DRC3f中剂量组、DRC3f高剂量组的血清TG水平高于西药组，有明显差异(P〈0.01)。
[0173]四、病理学检测
[0174]末次治疗后将大鼠禁食12h后，剖杀大鼠，各组大鼠于肝左叶同一部位取一小块肝组织，4%的多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片，进行HE染色。
[0175]将各组大鼠的组织在光镜下观察，评估肝脏的脂肪变性程度:
[0176]O级(肝细胞无脂肪变性)；
[0177]I级(< 25%肝细胞脂肪变性)；
[0178]2级(25%~50%肝细胞脂肪变性)；[0179]3级(50%~75%肝细胞脂肪变性)；
[0180]4级(> 75%肝细胞脂肪变性);
[0181]HE染色结果如图12所示。
[0182]图12表明，正常组大鼠肝组织中肝小叶结构清晰，肝细胞围绕中央静脉和汇管区有序排列，形成肝索，脂肪变性程度O级；在模型组大鼠肝组织中出现大片脂肪空泡，> 75%肝细胞脂肪变性，脂肪变性程度4级；DRC3f低剂量组、DRC3f中剂量组、中药组，50%~75%肝细胞脂肪变性，脂肪变性程度3级；西药组、DRc3f高剂量组25%~50%肝细胞脂肪变性，脂肪变性程度2级。
[0183]五、肝组织冰冻切片及苏丹染色
[0184](一)取各组大鼠肝左叶外侧下段同一部位的一小块肝组织，未固定的肝组织体积为 24X24X2mm。
[0185](二)取出组织支承器，放平摆好肝组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
[0186](三)将冷冻好的肝组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
[0187](四)调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5~IOmm间。
[0188](五)调好防卷板，制作冰冻切片，准确地调好防卷板，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
[0189](六)应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论，切带脂肪的组织时，应调至_25°C左右，切含大量的脂肪时，应调至-30°C。切片后进行苏丹染色。
[0190]结果如图13所示。
[0191]图13表明，正常组肝组织极少量脂肪，游离脂肪含量较少；模型组肝组织汇管区有大量游离脂肪；DRC3f低剂量组、DRC3f中剂量组仍有较多游离脂肪组织，但相对于模型组已经有所减少；西药组、中药组、DRC3f高剂量组游离脂肪含量相对于模型组下降十分明显。
[0192] 以上结果表明，DRC3f高剂量能显著降低ALT、AST、CH0L水平，HE染色和脂肪特殊染色结果显示DRC3f高剂量也能够明显降低肝脏脂肪变性程度及肝脏游离脂肪的含量。