专利名称:高肝素结合力的多肽变异体的制作方法图1类似于肝素结构的典型葡糖胺聚糖的一些结构示意图;图2在大肠杆菌中表达和分离的T3、T4变异体经SDS聚丙烯酰胺电泳分离后,卡马斯亮蓝染色示意图;同时包括氧化型BMP-2和EHBMP-2(上)及还原型BMP-2和EHBMP-2(下)。左边是分子量标准(15、20、30、35、68和94kD)。从左至右的上柱顺序是第1--4道分别为浓度为2umol的BMP-2、EHBMP-2,T3(序列表中序列5)和T4(序列表中序列6);第5--8道分别为浓度为5umol的BMP-2、EHBMP-2、T3、T4。图3用Pharmacia BIA2000系统记录的T3和T4(序列表中序列5和6)以及BMP-2变异体的肝素结合力的感应测定值示意图。图4用BIA2000系统记录的T3和T4(序列表中序列5和6)以及BMP-2变异体与受体BMPR-1A的胞外功能区的结合力的感应测定值示意图。图5在用35SO4标记的鸡胚肢体芽细胞培养实验中BMP-2、T3变异体、T4变异体的量效曲线。图6应用C2C12细胞株进行碱性磷酸酶诱生实验中BMP-2、T3变异、T4变异的量效曲线图7 7a、7b为BMP-2植入在小鼠诱生骨组织的组织学图象,由HE染色。表现为紫色区域环绕白色和暗紫色区域。暗紫色区域为骨髓,白色细胞为存在于正常骨髓中的脂肪组织。周围的肌肉组织为深红色。图8 T3在小鼠上诱生骨组织的组织学图象,HE染色图9 T3在小鼠上诱生骨组织的X线影象图10 T3在小鼠上诱生骨组织的组织学图象方法肝素结合的测定为了检测肝素的结合力,用氨基生物素标记肝素6000(Mach等,1993)并固定到链亲和素包被的生物感应器CM5(Pharmacia BiosensorAB)上。多肽和本发明提供的多肽变异体对用肝素涂布的生物传感器的结合,由BIA2000仪器来测量。具体的实验条件已有报道(Ruppert等,1996)测定与受体EMPR-IA的结合BMPR-IA受体的外功能区由氨基生物素标记(Shen等,1996),并固定于链亲和素包被的生物感应器CM5(Pharmacia Biosensor AB)上。多肽和本发明提供的多肽变异体对用肝素涂布的生物传感器的结合,由BIA2000仪器来测量。测定诱导成骨生物活性如下的细胞培养体系用来测定生物学活性细胞从鸡胚肢体芽上分离,并用于测量用35SO4标记的BMP依赖的蛋白多糖(Ruppert等,1996)。调节BMP蛋白的浓度,使达到最大的细胞应答及EC50(达到最大掺入量50%的浓度)。鼠的成肌细胞株C2C12被用来确定BMP依赖的碱性磷酸酶诱生(Katagiri等,1994),并能确定最大细胞应答和EC50的浓度。实施例1T3的表达和鉴定编码成熟人类BMP-2的cDNA(NIH数据库Entrez/Swiss-ProtNoP12643)和5′末端的ATGGCT(蛋氨酸-丙氨酸)是主要的诱发突变部位(Wang等,1997)。在Ncol和Af/ll的单一切点之间插入如下的双链DNA5′CATGGCTCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACGCGCTCGTAAACGTC3′序列表中序列93′CGAGTTCGGTTTGTGTTTGTCGCCTTTGCGCGAGCATTTGCAGAATT5′序列表中序列10因此,精氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸(序列表中序列。3)被插入到人蛋氨酸-丙氨酸-BMP-2分子上第8位的谷氨酰胺和第九位的精氨酸之间。突变的cDNA已作为Ncol/BamH1片段被整合到pRBSIIPN25X/O(Stueber等,1984)表达载体上。此突变体经测序证实。
T3变异体经表达和产物分离后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证实,与预期的相同,此法制备的T3具有较BMP-2大的表观分子量。这与预计的相同。T3在生物感应实验中与BMP-2受体BMPR-IA的胞外功能区可非特异性结合(解离常数Kd约为200PM),而与肝素的结合能力比BMP-2略强,解离能力下降。
在不同的测试体系中其生物活性有所改变。鸡胚肢体芽细胞用硫酸盐标记方法测定的蛋白聚糖合成表明T3较BMP-2有更高的EC50。可最大掺入量不变。在C2C12细胞株中进行的碱性磷酸酶活性表明T3较BMP-2有更高的EC50值。
实施例2T4的表达和鉴定T4的突变部位同T3基本相同,但在BMP-2的cDNA中插入的双链DNA序列有所不同,其插入序列如下5′CATGGCTCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACGCCTAAGCATAAGCAACGTAAGCGTC3′3′CGAGTTCGGTTTGTGTTTGTCGCCTTTGCGCGATTCGTATTCGTTGCATTCGCAGAATT5′上一序列为序列表中序列11,下一序列在序列表为序列表中序列12。
因此,在BMP-2分子的第八位的谷氨酰胺和第九位的精氨酸之间插入序列为精氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-组氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺。
T4变异体表达产物分离后经聚丙烯酰胺凝胶电泳证实其表观分子量较T3和BMP-2稍大。T4与BMP-2受体BMPR-IA胞外功能区结合的解离常数约为340pM,这和BMP-2与其受体的结合力相关(Kd320pM)。但是T4和肝素结合能力比BMP-2强,解离减慢。T4从肝素上释放的速度比T3还慢。
相对BMP-2而言T4的生物学活性的变化表现为在鸡胚肢体芽细胞的蛋白聚糖合成期,硫酸盐掺入试验,T4有高的EC50值(甚至比T3还高)。同样,在C2C12细胞株中进行诱导碱性磷酸酶实验证实T4比BMP-2有较高的EC50值实施例3多肽变异体体内效率的研究此处所选用的方法为在鼠的大腿肌肉中诱生异位骨组织。异位骨形成即在不与骨组织接触的其他组织中形成骨骼。这个实验的优点在于有很强的说服力。因为,不与任何骨组织接触,不会发生自然再生骨组织的过程。因此,可排除由于手术时骨损伤引起的假阳性结果。
在ICR小鼠诱生异位骨的方法已由K?BLER和URIST在1991年详细报道。
BMP-2和T3变异体以不同的浓度混合溶于牛血清白蛋白中,植入到ICR小鼠的股四头肌中,三周后可由X线摄片或组织学检查检测到新生骨。
单纯牛血清白蛋白植入后不能观察到新骨形成。在BMP-2和T3组中均无炎症或其他损伤后副作用发生。图7表示BMP-2能诱生骨基质和骨髓形成;图8表示T3的相应的处理结果。同BMP-2的作用相比,T3诱生以骨基质为主。
图9表示T3植入后诱生小骨的X线影象。同样条件下,T3诱生的小骨与常规的BMP-2诱生的小骨,在大小上无明显差异图10显示T3诱生小骨的组织学图象。用Masson-Trichrome染色,这种染色方法可以区分不同分化阶段的骨组织。红色区域为完全分化的骨组织,蓝绿色区域为正在进行骨化的组织,在某些地方可在蓝染组织中发现白色圆形细胞,称为软骨形成细胞,因为BMP-2诱导成骨包括软骨内骨化(一时性软骨形成)。
图7-10的实验中重组人BMP-2或T3(序列表中序列5)的量为10umol。下表比较了BMP-2和重组T3的体内效率。
表1由BMP-2和T3诱导的骨形成比较
以上的比较说明低浓度的T3有着比BMP-2更高的骨诱生效率。lug的BMP-2植入后,9个实验对象均未观察到骨组织的形成;而相同量的T3植入后,4个实验动物中全部可观察到骨组织的形成。即使T3的量仅为0.4ug,在4个实验动物中也有3个可观察到诱生骨的形成。
以上结果表明与高肝素结合力的多肽变异体能在体内诱导骨组织形成,且无炎症反应和其他耐受现象发生。与常规的BMP-2相比,T3诱生的骨组织含有较高的骨基质。由于骨基质维持骨的机械稳定性,密度高的骨更牢固,承重功能更好。因此,T3诱生的骨的质量优于BMP-2诱生骨。与BMP-2相比,低浓度的T3在体内即可发挥生物学作用,减少生长因子的必须使用量。这是多肽变异体具有令人满意的优点。
参考文献Altschul et al.,J.Mol.Biol.215(1990),403-410Altschul et al.,BLAST manual,NCB NLM NIH Bethesda MD 20894Chen et al.,Neurosurg.Focus 4(1998)article 11Devereux et al.,Nucleic Acid Res.12(1984),387Fischgrund et al.,J.Spinal Disorder 10(1997),467-472Henikoff & Henikoff,PNAS USA 89(1992),10915-10919Hollinger et al.,J.Biomed.Mater.Res.43(1998),356-364Katagiri et al.,J.Cell.Biol.127(1994),1755-66;erratum published in J.Cell.Biol.128(1995),714Kingsley,Genes Dev.8(1994),133-143Kübler et al.,Dtsch.Zahn?rztl.Z.53(1998),834-843Kübler et al.,Mund-,Kiefer,Gesichtschirurgie 1(1997),2-25Kübler et al.,Mund-,Kiefer-,Gesichtschirurgie 3(Suppl.1)(1999),134-139Kübler & Urist,J.Craniomaxillofac.Surg.19(1991),283-288Mach et al.,Biochemistry 32,(1993),5480-89Maniatis et al.,Molecular Cloning(1989),Cold Spring Harbor Laboratory PressMcDonald & Hendrickson,Cell 73(1993),421-24Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48(1970),443-453Recombinant Gene Expression Protocols,ed.R.S.Tuan Methods in Molecular Bi-ology 62(1995),Humana Press,Totowa,New JerseyReddi,Nature Biotechnol.16(1998),247-52Ruppert et al.,Eur.J.Biochem.237(1996),295-302Shen et al.,Eur.J.Biochem.240(1996),252-261Stueber et al.,EMBO J.3(1984),3143-3148Wagner et al.,J.Surg.Res.66(1996),100-108Wang et al.,PNAS 94(1997),1657-62Weigel et al.,Eur.J.Biochem.180(1989),295-300WO 00/47736 1 PCT/EP00/00637序列表<110> Sebald,Walter<120> Polypeptidvarianten mit erh?hterHeparin-Bindungsf?higkeit<130> PCT1126-01996<140><141><150> DE 199 06 096.7<151> 1999-02-13<160> 12<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 6<212> PRT<213> Künstliche Sequenz<220><221> MUTAGEN<222> (1)<223> K,R oder H<220><221> MUTAGEN<222> (2)<223> K,R oder H<220><221> MUTAGEN<222> (3)<223> K,R,H oder Keine Aminos?ure<220><221> MUTAGEN<222> (4)<223> Kein K,R,H,sonst beliebige Aminos?ure<220><221> MUTAGEN<222> (5)<223> Kein K,R,H,sonst beliebige oder KeineAminos?ure<220><221> MUTAGEN<222> (6)<223> Kein K,R,H,sonst beliebige oder keineAminos?ure<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzKünstlicheSequenzWO 00/477362 PCT/EP00/00637<400> 1Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210> 2<211> 6<212> PRT<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzKünstlicheSequenz<220><221> MUTAGEN<222> (1)<223> K,R oder H<220><221> MUTAGEN<222> (2)<223> Kein K,R,H,sonst beliebige Aminos?ure<220><221> MUTAGEN<222> (3)<223> K,R oder H<220><221> MUTAGEN<222> (4)<223> Kein K,R,H,sonst beliebige Aminos?ure<220><221> MUTAGEN<222> (5)<223> Kein K,R,H,sonst beliebige oder keineAminos?ure<220><221> MUTAGEN<222> (6)<223> Kein K,R,H,sonst beliebige oder keineAminos?ure<400> 2Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210> 3<211> 4<212> PRT<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzWO 00/47736 3 PCT/EP00/00637Heparin-Bindungssequenz<400> 3Arg Lys Arg Ala1<210> 4<211> 8<212> PRT<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzHeparin-Bindungssequenz<400> 4Arg Lys Arg Ala Lys His Lys Gln1 5<210> 5<211> 120<212> PRT<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzT3<400> 5Met Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Ala Arg Lys Arg Leu1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val20 25 30Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr35 40 45Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr50 55 60Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile65 70 75 80Pro Lys AlaCys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu85 90 95Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met100 105 110Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg115 120<210> 6<211> 124<212> PRT<213> Künstliche SequenzWO 00/47736 PCT/EP00/006374<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzT4<400> 6Met Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Ala Lys His Lys Gln1 5 10 15Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp20 25 30Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr35 40 45His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His50 55 60Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val65 70 75 80Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala85 90 95Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn100 105 110Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg115 120<210> 7<211> 374<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzT3(Nukleins?uresequenz)<400> 7ccatggctca agccaaacac aaacagcgga aacgcgctcg taaacgtctt aagtccagct 60gtaagagaca ccctttgtac gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg 120ctcccccggg gtatcacgcc ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc 180atctgaactc cactaatcat gccattgttc agacgttggt caactctgtt aactctaaga 240ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg taccttgacg 300agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt tgtgggtgtc 360gctagtaagg atcc 374<210> 8<211> 386<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzT4(Nukleins?uresequenz)<400> 8ccatggctca agccaaacac aaacagcgga aacgcgctaa gcataagcaa cgtaagcgtc 60WO 00/47736 5 PCT/EP00/00637ttaagtccag ctgtaagaga caccctttgt acgtggactt cagtgacgtg gggtggaatg 120actggattgt ggctcccccg gggtatcacg ccttttactg ccacggagaa tgcccttttc 180ctctggctga tcatctgaac tccactaatc atgccattgt tcagacgttg gtcaactctg 240ttaactctaa gattcctaag gcatgctgtg tcccgacaga actcagtgct atctcgatgc 300tgtaccttga cgagaatgaa aaggttgtat taaagaacta tcaggacatg gttgtggagg 360gttgtgggtg tcgctagtaa ggatcc 386<210> 9<211> 47<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen Sequenzkünstlich<400> 9catggctcaa gccaaacaca aacagcggaa acgcgctcgt aaacgtc 47<210> 10<211> 47<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen Sequenzkünstlich<400> 10ttaagacgtt tacgagcgcg tttccgctgt ttgtgtttgg cttgagc 47<210> 11<211> 59<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen Sequenzkünstlich<400> 11catggctcaa gccaaacaca aacagcggaa acgcgctaag cataagcaac gtaagcgtc 59<210> 12<211> 59<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen Sequenzkünstlich<400> 12ttaagacgct tacgttgctt atgcttagcg cgtttccgct gtttgtgttt ggcttgagc 59
本发明涉及具有高肝素结合力的多肽变异体。它是通过将一氨基酸序列X1X2X3X4X5X6(序列表中序列1或2)增加、插入和/或替代到原多肽中得到的。本发明提供的多肽变异体适用于刺激软骨生成、骨生成和伤口愈合。本发明也涉及编码所说的多肽变异体的氨基酸分子,包含所说的核酸分子的宿主细胞以及制备多肽变异体的方法。
高肝素结合力的多肽变异体制作方法
- 专利详情
- 全文pdf
- 权力要求
- 说明书
- 法律状态
查看更多专利详情
下载专利文献
下载专利
同类推荐
-
李晓琳杨三蓉, 刘亚兰陈顺志, 王林G·盖德纳克
您可能感兴趣的专利
-
郭博昭, 杨静修吴玉章俊介 入山
专利相关信息
-
郑昌学, 马二利