专利名称：抗肿瘤抗氧化抗缺氧的含硒肽合剂及其制备方法肿瘤是威胁人类生命健康的重大难治性疾病，人类在肿瘤的治疗过程中经历了漫长的历史变迁。抗肿瘤药物是重要的治疗手段之一，随着研究的深入与科学技术的发展，抗肿瘤药物随着新靶点的发现而不断进步。近年，科学家对肿瘤的深入研究发现，尽管肿瘤发生和发展的原因十分复杂，但归根结底都与基因表达及基因表达产物活性异常密切相关。同时，由于基因表达异常所形成的原发和继发的肿瘤周围环境(如血管生成、免疫系统功能变化异常等)的恶化，促进肿瘤细胞恶性表观的进一步发展，并产生体内扩散和转移。而且近年来国内外的研究结果清晰地表明，表观遗传改变在肿瘤的发生和发展中具有普遍的意义。因此，针对以组蛋白去乙酰化酶(HDAC)这一类影响表观遗传的重要分子靶标开展的小分子药物研发已经成为国际肿瘤靶向治疗领域的热点之一。由于HDAC在基因表达中起着关键作用，所以，它们与许多细胞功能密切相关，包括细胞周期调控、细胞增殖、免疫调控、分化和基因程序化表达，同时有与传统化疗药物对肿瘤耐药性基因表达完全不同的调节模式等。试验表明，HDAC抑制剂能够抑制人体及动物体内的肿瘤的生长，包括肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌和淋巴瘤等。HDAC抑制剂在作用机制上既区别于传统细胞毒类药物(即在对增殖快速的肿瘤细胞杀伤的同时，也累及正常细胞的传统化疗药物)，也不同于典型的靶向药物。但是，现在的研制工作出现了新的问题(一)、现有的抑制剂单一使用，效能低；(二)、大部分抑制剂在体内易降解、半衰期短，不稳定；(三)、对造血因子GATA-I和10的转录抑制，可引起血小板减少等不良反应；(四)、还有微量元素硒抗肿瘤功能肯定，但是硒离子在小肠的中性和偏碱性环境中沉淀，严重影响作用效果。三.
本发明的目的是要提供一种抗肿瘤、抗氧化、抗缺氧的含硒肽合剂。本发明的另一目的是提供该合剂的制备方法。本发明是根据中医药学对“肿瘤”及其并发的抗氧化抗缺氧能力降低的发病机理的认识以及治疗原则，参考现代“硒”、“肽”及“HDA C抑制剂”的药理研究成果，从我国卫生部审定的可用于保健食品的中药材中筛选出益气养阴、活血通脉、抗肿瘤，又能提高血液微循环和免疫力的药材，由人参、丹参、芦荟、枸杞子、薏苡仁、茯苓、大枣、葛根、茜草及微量元素等组成原材料，用现代生物工程技术酶法或微生物发酵法提取出含硒环肽、短链脂肪酸、亲电酮类等纯天然HDAC抑制剂化合物，具有高效协同抗肿瘤及抗氧化抗缺氧的功效。含硒肽合剂是具有全新化学结构的亚型选择性蛋白去乙酰化酶纯天然组合抑制剂，属于新型抗肿瘤作用机制的肿瘤表观遗传调控药物，与传统的肿瘤治疗药物不同，它以癌细胞异常的表观遗传作为靶点进行饱和攻击，并通过诱导患者自身的免疫监测和免疫杀伤作用而发挥整体抗肿瘤作用，纯天然无化学污染。本发明的物品是由下列组分制成的(用量为重量)人参10-30份枸杞子10-25份葛根20-30份硒 0. 01-0. 2 份丹参10-20份薏苡仁20-50份大枣10-25份芦荟10-30份茯苓20-30份茜草10-20份制备本发明的配方优选重量配比范围是人参2-10份丹参5-20份
枸杞子6-15份葛根715份硒 0. 0005-0. 01
本发明物品的最佳重量配比是
薏苡仁10-30份大枣4-15份
芦荟3-15份
茯苓6-15份茜草6-15份
乃参10份薏苡仁12份大枣5份
芦荟4份茯苓8份茜草10份
人参5份枸杞子8份葛根8份硒0. 001份本发明物品上述配方中可添加其它微量元素，如添加锌、铬等，生成多肽金属螯合物，来提高功能效果。将上述各组分组成本发明物品的生产方法是以上述配方药材为原料，采用常规制药加工方法可生产出含硒中成药合剂，采用制备肽的常规方法能生产出含硒肽合剂。现重点说明选用微生物发酵法制备肽化合物。具体方法有两种(一)、将上述配方药材混合粉碎，用水煎提取方法得到水煎药液(预处理)，加入肽菌株，进行液体深层发酵培养，调PH值，加热灭酶，冷却，过滤纯化，既得，再按常规方法制成药物剂型。(二)、(1)将人参、丹参、薏苡仁、芦荟、茯苓、茜草、硒按上述配方比例混合粉碎，用乙醇回流提取，滤过醇提液备用，药渣分别保存；( 将枸杞子、大枣、葛根按上述配方比例混合粉碎，加入醇提后的药渣，进行水煎处理；C3)醇提药液、水煎药液混合后，加入肽菌株，进行液体深层发酵培养；(4)调PH值，加热灭酶，冷却，过滤纯化，既得，再按常规方法制成药物剂型。本发明抗肿瘤原理是通过下列机制(一)纯天然增效性HDAC抑制剂靶向作用，直接杀伤肿瘤细胞；(二)提升免疫力及抗氧化抗缺氧能力，抑制肿瘤细胞生存；(三)截断肿瘤区的血液供应，阻止肿瘤继续扩大；(四)分化，能是一部分肿瘤细胞转化为非肿瘤细胞。本发明的主要特点是(一)配方中的药材含有黏附剂(多糖)、果胶、脂肪酸、氨基酸衍生物、植物多糖、多元醇等，均为肽吸收促进剂、修饰剂和稳定剂，所以本发明性能较稳定，对人体更安全，药理活性更强；(二)活性肽结合硒离子，由小肠肠壁细胞吸收后再释放进入血液，从而避免了硒离子在小肠的中性和偏碱性环境中沉淀，提高抗肿瘤的整体效果；(三)所含的人参肽具有活化血小板间黏附作用；(四)所含的皂苷类黄酮类化合物同时具有抗氧化抗缺氧作用。为了证实本发明对抗肿瘤及抗氧化抗缺氧作用的效果，我们分别做了以下试验。(一)抗肿瘤药效学试验(1)、药物来源与配制含硒肽合剂，20毫升口服液，按生药1 1提取。用前以蒸馏水配制成试验所需浓度的混悬液。(2)、试验动物试验采用体重18_22g昆明小鼠，雌雄兼用，但每批试验性别相同，由中国医学科学院动物中心提供。(3)、试验方法取生长良好的小鼠可移植肿瘤Lewis肺癌、肝癌H22及肉瘤S180，按抗癌药药效学实验技术要求常规接种小鼠，于接种后M小时分组给药。试验共分五组，每组10只鼠，设对照组，环磷酰胺阳性药组(常规方法)，含硒肽合剂1. 25,2. 5,3. 75g/kg三剂量组。环磷酰胺60mg/kg腹腔注射一次，含硒肽合剂灌胃给药连续9次。停药后对小时处死动物，剥瘤称重，计算抑瘤率，并进行统计学处理。、试验结果1、对小鼠Lewis肺癌的疗效试验三批试验结果，含硒肽合剂1.25g/kg组的抑瘤率分别为31.0%、26. 3%、25. 2%(P < 0. 01、ρ < 0. 05、ρ < 0. 05) ；2. 5g/kg 组的抑瘤率分别为 36. 3%、31. 6%、41. 0% (ρ
<0.01、ρ < 0.01、ρ < 0.001) ；3. 75g/kg 组的抑瘤率分别为 51. 0 % ,38. 3 % ,41. 2 % (ρ
<0. OOUp < 0. OUp < 0. 001)。2、含硒肽合剂对小鼠肝癌Η22的疗效试验三批试验结果，1.25g/kg组的抑率分别为 16. 7%、36. 1%、23.9% (ρ < 0. 05、ρ < 0. 001、ρ < 0. 01) ；2. 5g/kg 组的抑瘤率分别为 22. 5%,35. 6%,22. 4% (ρ < 0. 05、ρ
<0. 001、ρ < 0. 05) ；3. 75g/kg 组的抑瘤率分别为 29. 6 % ,41. 4 % ,34. 2 % (ρ < 0. 01、ρ
<0. OOUp < 0. 001)。3、含硒肽合剂对小鼠肉瘤S180的疗效试验三批试验结果，含硒肽合剂1. 25g/kg组的抑瘤率分别为33. 7%、24. 1^^29.7% (ρ均< 0. 05) ；2. 5g/kg组的抑瘤率分别为 35. 2%,32. 7%,21. 8% (口均< 0.05) ；3. 75g/kg 组的抑瘤率分别为 45. 9%,40. 6%,33. 6% (ρ < 0. 05、p < 0. 01、p < 0. 05)。(5)、试验结论含硒肽合剂1. 25,2. 5,3. 75g/kg三剂量组对小鼠肉瘤S180有明显抑瘤作用，对小鼠Lewis肺癌、肝癌H22均表现了明显抑瘤作用，且呈剂量关系。其中对小鼠Lewis肺癌疗效更明显，含硒肽合剂大剂量4. 74g/kg组平均抑瘤率达63. 8%。( 二)抗氧化试验含硒肽合剂有总黄酮成分，具有抗氧化抗缺氧功效。对此我们进行了试验。方法如下以含硒肽合剂(20毫升口服液一1 1原药材提取)、给以老龄BAL B/C小鼠灌胃45d后测定与抗氧化延缓衰老有关的生化指标。结果含硒肽合剂能使肝超氧化物歧化酶(SOD)活性显著增强；全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性显著提高。结论含硒肽合剂具有较明显的抗氧化作用。(三)抗缺氧试验我们对含硒肽合剂的抗缺氧作用进行了动物实验，现报告如下。
材料与方法含硒肽合剂20毫升规格、原药材1 1提取。动物选择昆明种小鼠，鼠龄40-50天(大连医学院动物室提供)。①抗常压下致小鼠缺氧试验，取昆明种小鼠20只，雌雄各半，鼠龄40-50天，体重21. 2士3. 49，随机分为2组，每组10只，分别由腹腔注射含硒肽合剂2ml/5公斤(体重)和等容量生理盐水，15min后，将其放入10只250mm广口瓶，口内密闭，每瓶2只，每组各1只，瓶内放钠石灰109，观察小鼠存活时间(以呼吸停止为指标)。②抗氰化钾致小鼠缺氧试验，取昆明种小鼠20只，雌雄各半，鼠龄40-50天，体重19.4 土 1.69，随机分为2组，每组10只，分别由腹腔注射含硒肽合剂^iil/公斤(体重)和等容量生理盐水，15min后，两组小鼠均腹腔注射氰化钾溶液0 ·1πι1/109(体重)，观察小鼠存活时间(以呼吸停止为指标)。两次试验结果，含硒肽合剂组抗缺氧能力明显强于生理盐水组，说明含硒肽合剂具有抗缺氧功效。
四.

人参5份丹参10份芦荟4份
枸杞子8份薏苡仁12份茯苓8份
葛根8份大枣5份茜草10份
硒0. 001份。生产方法(1)将人参、丹参、薏苡仁、芦荟、茯苓、茜草、硒按上述配方比例混合粉碎，用75%乙醇(6倍量)回流提取1.5小时，滤过醇提液备用，药渣分别保存；(二)将枸杞子、大枣、葛根按上述配方比例混合粉碎，加入醇提后的药渣，进行水煎2次(8倍水)，每次1. 5小时处理，药液过滤；(3)把醇提药液、水提药液混合后接入高产肽菌株，供压缩空气(供养气)，在温度2548°C、pH6. 5-7条件下进行液体深层发酵培养72小时；(4)调pH值，加热灭酶，将药液浓缩到每人每天服用3次、每次20毫升的浓度(药材水为1 1)，冷却，过滤纯化，及时灌装扎封，105°C流通蒸汽灭菌30分钟，既得含硒肽合剂。


“含硒肽合剂”是以中药人参、丹参、芦荟、枸杞子、薏苡仁、茯苓、大枣、葛根、茜草、硒等为基原，利用现代微生物发酵技术制备的，具有全新化学结构的组蛋白去乙酰化酶纯天然增效性组合抑制剂，包括含硒环肽、短链脂肪酸、亲电黄酮等组合化合物，属于新型抗肿瘤作用机制的肿瘤表观遗传调控药物，与传统的肿瘤治疗药物不同，它以癌细胞异常的表观遗传作为靶点进行饱和攻击，并通过诱导患者自身的免疫监测和免疫杀伤作用而发挥整体抗肿瘤作用，并且抗氧化抗缺氧，纯天然无化学污染。