专利名称：一种脑靶向载两性霉素b聚合物胶束给药系统的制作方法据报道，侵袭性 系统性真菌感染在病危患者中的发病率和死亡率均较高，死亡率维持在40% 90%。所述真菌，如新型隐球菌、白色念珠菌及曲霉菌等可轻易侵入患者中枢神经系统，尤其对于免疫抑制患者，进而发展成为颅内真菌感染。研究显示，由于血脑屏障的存在，疏水性的抗真菌药物难以自主进入脑部。目前临床上治疗颅内真菌感染的主要手段是鞘内注射抗真菌药物，该法伤害性大，不利于长期用药。因此，需要建立一个经血管给药、能有效跨越血脑屏障、运送抗真菌药物到达脑内作用部位的方法。疏水性多烯大环内酯类抗生素两性霉素B已经成为治疗深部真菌感染的金标准，这是基于它独特的治疗性质(例如高效、光谱的杀真菌效果，能够克服多药耐药等)。但是，临床已有的两性霉素B制剂，例如注射用两性霉素B 以及注射用两性霉素B脂质体 均难以透过血脑屏障而达到治疗浓度。另外，传统的两性霉素B制剂如注射用两性霉素B 存在严重的系统毒性，从而被限制应用。两亲性嵌段共聚物自组装形成纳米级的核-壳结构，即胶束，目前作为疏水性药物的传递系统正在引起广泛的关注。研究显示，在水溶液中，疏水性药物被包载进入胶束的疏水内核中，从而能增加药物的溶解度。基于受体介导机制的药物传递系统已经应用于脑靶向药物递释领域。目前已知的存在于血脑屏障上的特异性受体有转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、表皮生长因子受体等。已有报道表明低密度脂蛋白受体相关蛋白能够介导其配体跨越血脑屏障上的内皮细胞。
本发明目的是针对目前临床现有的两性霉素B制剂如注射用两性霉素B 入脑效率低、毒副作用大等问题，提供低密度脂蛋白受体相关蛋白配体多肽修饰的脑靶向聚合物胶束给药系统，尤其涉及一种新的脑靶向载两性霉素B聚合物胶束给药系统。本发明采用Angiopep-2作为脑靶向头基，使用PEG化的磷脂类作为基础载体材料，以PEG化磷脂类材料及其带有马来酰亚胺基团的衍生物两亲性嵌段共聚物作为组分，两者在水溶液中自组装成稳定的胶束结构，通过两亲性嵌段共聚物在水溶液中的自组装行为，将疏水性模型药物包载进入聚合物胶束内核中，形成稳定的核-壳结构，其中，通过共价方式表面修饰Angiopep-2,制得Angiopep-2修饰的脑祀向聚合物胶束给药系统。本发明的以Angiopep-2为祀向头基的脑祀向聚合物胶束给药系统，能够明显提高所包载的疏水性药物在脑部的蓄积量以及入脑效率，同时降低药物的毒性。具体而言，本发明的脑靶向载两性霉素B聚合物胶束给药系统，其特征在于，采用Angiopep-2作为脑靶向头基，用PEG化的磷脂类作为基础载体材料，以PEG化磷脂类材料及其带有马来酰亚胺基团的衍生物两亲性嵌段共聚物作为组分，两者在水溶液中自组装成稳定的胶束结构，将疏水性模型药物两性霉素B (简称AmB)包载进入形成的聚合物胶束内核中，形成约20 nm稳定的核-壳结构,制成本发明的脑祀向载两性霉素B聚合物胶束给药系统。本发明中，所述的Angiopep-2修饰所述的聚合物胶束作为疏水性药物传递载体。所述的Angiopep-2修饰的脑祀向聚合物胶束由Angiopep-2和两亲性嵌段共聚物 组成，其中Angiop印-2与两亲性嵌段共聚物的分子摩尔比为2 20:100。本发明中，Angiop印-2(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY,分子量 2. 4 kD)属肽类家族Angiopeps，是低密度脂蛋白受体相关蛋白配体多肽，其来源于抑肽酶和低密度脂蛋白受体相关蛋白的库尔茨域。本发明中，采用聚乙二醇(polyethyleneglycol,简称PEG)化的磷脂类材料为载体材料，其安全、无毒、生物相容性好，而且PEG化的磷脂具有较低的临界胶束浓度，因此，其形成的聚合物胶束具有更好的增溶效果并可在大量血液稀释过程中保持良好的稳定性。本发明中，形成的聚合物胶束可将其包载的药物通过被动或主动的途径靶向到特定组织，通过在聚合物胶束表面修饰具有靶向性的分子，例如单抗、肽类、凝集素，糖类、激素类以及低分子量的化合物等，可明显增加其在靶部位的蓄积，所述的聚合物胶束表面PEG分子能延长胶束在体内的循环时间,进一步成功实现药物祀向传递。本发明中，所述的两亲性嵌段共聚物材料选自PEG化磷脂类、PEG化壳聚糖类、PEG化聚乳酸类、PEG化聚氨基酸类以及普朗尼克类材料； 所述的马来酰亚胺功能化的两亲性嵌段共聚物分别是所述的两亲性嵌段共聚物材料的亲水嵌段如PEG分子或聚氧乙烯分子的马来酰亚胺功能化的衍生物。本发明中，所述的PEG化磷脂类材料及其带有马来酰亚胺基团的衍生物选自二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇2000 (简称PE-PEG)以及二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇2000马来酰亚胺(简称PE-PEG-Mal )。本发明中，所述的疏水性药物选自疏水性的抗肿瘤药物、抗真菌药物或抗艾滋病药物；尤其是疏水性模型药物两性霉素B (简称AmB)。本发明通过以下技术方案构建脑靶向聚合物胶束给药系统 以PEG化磷脂类材料及其带有马来酰亚胺基团的衍生物两亲性嵌段共聚物作为组分，两者在水溶液中自组装成稳定的胶束结构，通过共价方式表面修饰Angiopep-2,制得Angiopep-2修饰的脑祀向聚合物胶束给药系统；其包括步骤 按处方量称量PEG化磷脂类材料及其带有马来酰亚胺基团的衍生物置于圆底烧瓶中，加入氯仿使其溶解；将疏水性模型药物溶解于甲醇中制备成O. 25 mg/ml的储备液，吸取AmB储备液加入PEG化磷脂类材料的氯仿溶液中；两溶液混合后旋转蒸发形成药物_聚合物薄膜，真空干燥过夜，加入处方量的10 mM HEPES缓冲生理盐水pH 7.4 (简称HBS)，室温搅拌使溶液平衡，加入Angiopep-2，室温避光搅拌12 h，分子排阻色谱法去除未包封的药物，即制得脑靶向载药聚合物胶束给药系统； 其中，Angiopep-2与PEG化磷脂类材料的分子摩尔比为2 20:100。本发明采用核磁共振技术对所制备的脑靶向聚合物胶束给药系统及其制备过程的中间产物进行结构鉴定。结果表明，两亲性的PE-PEG分子在水溶液中自组装形成聚合物胶束。如图3所示，6. 7 ppm处为空白PE-PEG/PE-PEG-Mal混合胶束表面马来酰亚胺基团的特征吸收峰，当混合胶束与Angiopep-2反应后,谱图中马来酰亚胺的特征吸收峰消失,表明马来酰亚胺与Angiopep-2的巯基特异性反应,验证PE-PEG-Angiopep祀向聚合物胶束合成成功。本发明对脑靶向载AmB聚合物胶束给药系统的制备工艺进行优化，首先通过单因素考察法考察投药量、水化介质量以及水化温度对处方包封率(简称EE%)、载药量(简称DL%)以及粒径的影响。当确定对处方具有显著性影响的因素及其考察范围后，采用星点设计-效应面优化法对制备工艺进行细致优化，得到较优处方，并进行多次验证，说明本发明确定的脑祀向载AmB聚合物胶束给药系统的制备工艺可行。本发明所构建的脑靶向载AmB聚合物胶束给药系统在BCECs的摄取实验中，定量结果显示，PE-PEG-Angiopep (100:20)/AmB脑靶向聚合物胶束的摄取量最高，是普通聚合物胶束摄取量的I. 5倍，是游离AmB摄取量的4. 3倍。由于AmB具有较严重的毒副作用，例如溶血性以及对正常细胞的毒性，本发明所构建的脑靶向载AmB聚合物胶束给药系统与市售制剂注射用两性霉素B 相比，所载AmB的溶血性以及对BCECs的毒性均明显降低。本发明所构建的脑靶向载AmB聚合物胶束给药系统通过ICR小鼠尾静脉注射方式考察体内脑靶向效率。I h时脑组织分布结果显示，载AmB脑靶向聚合物胶束组在脑内分布均显著高于注射用两性霉素B 组(P < O. 001)，且随着胶束表面Angiop印-2的修饰度增力口，脑靶向聚合物胶束组在脑内的分布明显增加，其中PE-PEG-Angiop印(100:20) /AmB脑靶向聚合物胶束组比注射用两性霉素B 组的脑内蓄积量显著增加4. 4倍(P < O. 001)，同时在肝和脾的蓄积量分别显著下降6倍和2. 2倍。本发明所构建的脑靶向载AmB聚合物胶束给药系统通过SD大鼠尾静脉注射方式考察体内药动学行为。结果表明，市售制剂注射用两性霉素B 组、AmB普通胶束组以及脑靶向聚合物胶束组均符合三室药动学模型，其中AmB普通胶束组和脑靶向聚合物胶束组在体内的药动学行为没有明显差异，而胶束组相对于市售制剂，t1/2显著延长I. 8倍，AUCcr显著提高I. 8倍。通过ICR小鼠尾静脉注射载罗丹明123 (简称Rho 123)的脑靶向聚合物胶束给药系统，脑组织冰冻切片后荧光显微镜定性观察Rho 123脑内分布情况，初步探讨本发明构建的脑靶向聚合物胶束给药系统的入脑机制。由于Rho 123是BBB上高表达的P-糖蛋白的经典底物，因此游离的Rho 123无法透过BBB。从定性结果看出，经Angiopep-2修饰后的聚合物胶束明显促进Rho 123在脑组织的分布，由此可推测构建的脑靶向聚合物胶束给药系统可避开P-糖蛋白的外排作用，有效增加药物在脑部的积累量。本发明的突出优点在于,采用极具临床应用潜力的脑祀向头基-Angiopep-2,修饰脑靶向聚合物胶束给药系统，增加脑部疾病治疗药物在BCECs的摄取，特别是通过无创伤的静脉注射方式给药后显著提高药物在脑部的蓄积量。与现有的市售制剂如注射用两性霉素B 相比较，脑靶向效率显著提高；另外，本发明采用经FDA认证的安全、无毒、生物相容性好的PEG化磷脂类作为载体材料，构建的聚合物胶束给药系统可明显降低AmB的溶血性和细胞毒性。
本发明所构建的Angiopep-2修饰的脑靶向聚合物胶束给药系统，可以应用于促进其他入脑效率低的疏水性药物向脑部蓄积。


图I，载AmB聚合物胶束处方优化的包封率(横向线)和载药量(纵向线)二维等高线图的叠加图，
其中，横向线深色区域为较优区域。
图2，空白PE-PEG普通聚合物胶束核磁共振图谱，
其中，A :溶剂为氘代氯仿，
B :溶剂为重水。图3，核磁共振图谱，
其中，A :空白PE-PEG/PE-PEG-Mal混合聚合物胶束，
B :空白PE-PEG-Angiop印脑靶向聚合物胶束。图4 ,PE-PEG-Angiop印脑靶向聚合物胶束的原子力显微镜图，
其中，A :空白聚合物胶束，
B :载药聚合物胶束。图5，BCECs分别在37°C和4°C摄取的定量结果。图6，MTT法考察脑靶向载AmB聚合物胶束对BCECs的毒性。图7，脑靶向载AmB聚合物胶束的溶血性考察结果。图8，脑靶向载AmB聚合物胶束的体内药动学行为考察结果。图9，脑靶向AmB聚合物胶束体内的组织分布情况，
其中，A:1 h时脑组织分布，
B 4 h时脑组织分布，
C1 h时其他重要器官分布，
D 4 h时其他重要器官分布。图10，冰冻切片考察载Rho 123的脑靶向聚合物胶束在脑组织的分布情况，
其中，A-D :尾静脉注射游离Rho 123脑内分布结果，
E-H :尾静脉注射PE-PEG/Rho 123普通聚合物胶束脑内分布结果，
I-L :尾静脉注射PE-PEG-Angiop印(100:20)/Rho 123脑靶向聚合物胶束脑内分布结
果，
A，E和I :大脑皮层冰冻切片图，
B，F和J :纹状体冰冻切片图，
C，G和K :海马冰冻切片图，
D，H和L :黑质冰冻切片图。

固定称取10 mg PE-PEG置于圆底烧瓶中，加入2 ml氯仿使其溶解，称取AmB溶解于甲醇中制备成O. 25 mg/ml的储备液，向PE-PEG的氯仿溶液中加入一定量的AmB甲醇溶液，混合均匀后旋转蒸发形成均匀的药物-聚合物薄膜，真空干燥过夜，加入一定体积的10 mMHBS pH 7. 4，室温下搅拌2 h使溶液平衡，分子排阻色谱法去除未包封的AmB即得PE-PEG/AmB普通聚合物胶束给药系统。 采用星点设计-效应面优化法对聚合物胶束包载AmB的制备工艺进行优化。首先进行单因素考察，分别考察投药量、水化介质量、水化温度对聚合物胶束包封率、载药量以及粒径的影响，研究发现，投药量以及水化介质量对于处方的包封率和载药量具有显著性的影响，并确定了二者的考察范围分别为投药量为O. 56^1. 6625 mg，水化介质量为广5ml ο固定载体量(PE-PEG)为10 mg，选择对胶束形成有显著影响的两个因素投药量以及水化介质量进行考察。实验采用两因素、五水平的星点设计。以包封率、载药量作为效应值进行模型拟合，得到各效应对两因素的二维等高线图的叠加图(如图I所示)。通过叠加图得到各因素对应的较优区域，从而获得载AmB聚合物胶束给药系统的较优处方。表I是获得的载AmB聚合物胶束给药系统的较优处方。表I


本发明属生物技术领域，具体涉及一种脑靶向载两性霉素B聚合物胶束给药系统。本发明使用极具临床应用潜力的脑靶向头基Angiopep-2修饰聚合物胶束，包载小分子疏水性药物，制备脑靶向聚合物胶束给药系统。所制备的脑靶向聚合物胶束给药系统可有效提高疏水性药物在脑毛细血管内皮细胞上摄取，特别是通过无创伤的静脉注射方式给药后显著提高药物在脑部的积累量和入脑效率，与药物的现有临床制剂如注射用两性霉素B 比较，脑靶向效率显著提高；所构建的聚合物胶束给药系统可明显降低AmB的溶血性和细胞毒性。本发明的Angiopep-2修饰的脑靶向聚合物胶束给药系统，可以应用于促进其他入脑效率低的疏水性药物向脑部蓄积。