专利名称：壳聚糖粉末的制作方法壳聚糖粉末本发明涉及以细的且可控的粉末形式的壳聚糖、其用于控制某些酵母如酒香酵母(Brettanomyces)的用途,且涉及用于处理液体食品的方法。技术状态酒香酵母作为污染许多发酵产品的剂被描述，发酵产品包括葡萄酒、苹果酒、啤酒、红茶菌(kombucha)、酸乳酒、龙舌兰酒等。在葡萄酒生产部门中，检测葡萄园中的污染物酵母变得棘手，这是由于酵母在这个阶段是少数的事实。然而，发酵(用于将糖转化成醇的过程)将导致对这些微生物的现实“选择”。实际上，酒香酵母是特别耐乙醇且特别耐SO2的，且尽管培养基的糖被耗尽，也能够存在于培养基中。而且，用于制造葡萄酒的某些技术或某些程序可以促进酒香酵母在葡萄酒中的发展，比如在酒糟(Iees)上成熟。为了酒香酵母可以发展，小于500mg的糖对它们来说是充足的。很多作者已经证明了酒香酵母污染酵母对不同国家的葡萄酒、对德国起泡葡萄酒、Arbois“vins jaunes”(黄酒)或来自法国南部的葡萄酒都有影响。在1965年,Domercq报告了在葡萄酒源标签“Saint Emilion”和“PremiSres Cotes de Bordeaux”的葡萄汁(must)中且在被保持在葡萄酒源标签“Medoc”、“Graves”及“Saint Emilion”下的红葡萄酒或白葡萄酒中分离出酒香酵母。至于葡萄树的类型，加州葡萄似乎是最受影响的。例如，在Burgundy中，对于2000年份的，来自这种类型的葡萄树的发酵葡萄酒中的50 %及装瓶后它们的25%受到影响。最后，甚至用制酒业实践的深思熟虑，这种改变的控制仍然是困难的。控制方式本质上是预防的，它们提供了作用于酒香酵母群体的可能性(S02、DMDC、高温瞬间灭菌、过滤)。然而，这些处理改变了葡萄酒的感官性质且不能保护处理的葡萄酒免受后来的污染。 这个问题不仅与葡萄酒有关，而且扩展到植物源的液体食品，尤其是通过发酵制备的植物源的液体食品。壳聚糖作为技术辅助是已知的，但其在溶液中的使用需要高的浓度，通过约为30-100g/hL。另一方面，壳聚糖的抗细菌性质和抗真菌性质已经被广泛研究且证明，且现今被充分公认。壳聚糖由于其在相对短的时间之内的抗微生物效果而被熟知，当其被用于具有有机酸的溶液中时，通常在酸性pH下，以约0.5-1.5%的浓度(即0.5g/100mL,5g/L,500g/hL到1，000g/hL的浓度)。这些浓度是高的，因为在大多数化妆品、食品或医疗应用中，需要广泛抑制谱(细菌、酵母)。同样地，还描述了壳聚糖对除了包含壳聚糖作为其细胞壁的主要成分的那些真菌以外的各种真菌的抗真菌活性。研究溶液中的壳聚糖，用于控制致植物病的菌株(镰胞菌(Fusarium)、根霉(Rhizopus)、Phylium、假丝酵母(Candida)、曲霉菌(Aspergillus))。还研究溶液中的壳聚糖对发酵期间的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和乳酸菌(小球菌(Pediococcus)和乳杆菌(Lactobacillus))的生长的影响。作者证明，相比于乳酸菌(小球菌和乳杆菌)，壳聚糖以更显著方式抑制酿酒酵母的生长。以具有小于5μπι的大小的微粒的形式的壳聚糖的杀真菌作用被AllanC.等(Allan C.等，(1979)The fungicidal effect of chitosan on fungi of varying cellwall composition Experimental Mycology, 3:285-287)描述在针对在壳聚糖的存在下和在没有壳聚糖的存在下测量微生物的生长的抑制的实验室试验中。使用的浓度是高的(0.l-6g/L)。没有提供关于对酒香酵母的作用的数据。而且，作者观察到对壳聚糖的响应可变性和敏感性强烈依赖于属和物种。Gomes-Rivas 等(Gomes-Rivas L.等，(2004)Selective antimicrobial actionof chitosan against spoilage yeasts in mixed culture fermentations, J.1ntMicrobial Biotechnol31:16-22)描述了壳聚糖用于特定地控制酒香酵母属/德克酵母属(Dekkera)的作用。然而，作者描述了以具有小于420 μ m的大小、DA9% (DA =乙酰化度)的微粒的细粉末的形式的壳聚糖对布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)的生长的影响，及对酿酒酵母的生长的影响。试验是在培养基上进行的。因此，未测量对葡萄酒基质的影响，这使关于这样的壳聚糖作为技术辅助的用途的任何结论随机化。作者指出，在用壳聚糖处理的最初80小时期间，布鲁塞尔酒香酵母的生长被抑制，且超出这个潜伏期，该生长重新开始。它们表明，用600g/hL的壳聚糖来控制布鲁塞尔酒香酵母的生长是可能的。因此，对于合适的工业用途，这个浓度仍然非常高。专利申请US2004/0176477描述了作为糠秕马拉色氏霉菌(Malassezia furfur)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)的抗微生物剂使用的水溶性的微粉化壳聚糖。专利申请FR2599048教导了，根据实例，用浓度为约80g每百升液体食品的壳聚糖来稳定这种液体食品是可能的，尤其是从其颜色的角度。该壳聚糖浓度仍然是高的。`专利US6，482，456描述了壳聚糖的水溶液，即水溶性的壳聚糖。专利申请FR1164984教导了当为了澄清榨汁必须降低壳聚糖的量时，使用壳聚糖与膨润土的混合物。如已经提及的，以其阳离子的形式，壳聚糖提供对某些菌株的抗微生物活性。可以容易地被取代的官能团的存在允许修改壳聚糖性质，且因此修改其活性。例如，溶液中的壳聚糖谷氨酸盐或乳酸盐(chitosan glutamate or lactate)已经被用于限制抗微生物作用或抗真菌作用。然而，至今所提议的壳聚糖并没有被用作技术辅助，以满足这个行业的专业人员的期望，用于预防“酒香酵母风险”。发明目的这就是Kitozyme SA建立研究与开发项目以寻找解决上下文所描述的技术问题的技术辅助的原因。本发明的主要目的是解决在于提供用于控制酒香酵母属的酵母的技术辅助的新的技术问题。本发明的目的还是解决在于提供用于控制液体食品且尤其是通过发酵制备的液体食品中的不期望的酵母，且尤其是酒香酵母属的酵母的技术辅助的新的技术问题。本发明的目的还是提供从食品安全的角度是可靠的且不降低处理的液体食品的品质的可用的技术辅助。本发明的目的是解决工业规模上的，尤其任选地具有醇或发酵的液体食品的行业中的这些技术问题。发明描述因此，本发明涉及以粉末形式的壳聚糖，其颗粒大小(粒径)被包括在0.1-200 μ m之间。有利地，壳聚糖包括被包括在5-100微米之间，且优选在5-60微米之间，且还优选被包括在5-50微米之间的颗粒大小。根据备选方案，壳聚糖包括小于70微米，且优选小于50微米的颗粒大小。出乎意料地，用具有小于100微米的颗粒大小的粉末，获得对不期望的酵母群体的非常显著且非常快速的作用是可能的。当颗粒大小小于50微米时，这种作用尤其显著。颗粒大小是通过激光衍射法得到的颗粒大小。本发明的壳聚糖优选地具有以下颗粒大小，该颗粒大小具有被包括在5-30 μ m之间，优选在10-30 μ m之间，且更优选在10-25 μ m之间的D (0.5)(总分布的平均直径，且颗粒量的50%具有小于这个值的直径且50%具有更大的直径)。因此，D(0.5)表示考虑到颗粒大小的分布曲线下面积的分布的中间值。 根据备选方案，壳聚糖可以在筛选后使用。优选地，壳聚糖包括被包括在0_30mol%之间的乙酰化度(DA)。乙酰化度是N-乙酰基-葡萄糖胺单元的数目与总单体数目的比率。壳聚糖的乙酰化度是通过电位滴定来确定的，电位滴定由通过氨基(amine group)的滴定来确定壳聚糖的乙酰化度组成。这是基于Rinaudo等(1999)的工作。简而言之，壳聚糖被放入到在过量的稀盐酸中的溶液中。氨基(在未乙酰化的葡萄糖胺单元( G)上)带正电荷的(过量的HCl)。然后，该溶液通过自动滴定仪(KEM，自动电位滴定仪，AT-500N)，用稀NaOH溶液来滴定，且测量pH。在反应的开始部分，确定过量的HC1。接着，确定带电的氨基的量:滴定曲线显示出两个拐点。两个NaOH体积之间的差提供了知道游离胺的量的可能性。依据CAS N0.9012-76-4，提及壳聚糖。本发明的壳聚糖是从真菌源制备的多糖。从安全且大量的生物技术的或食品真菌源提取且纯化壳聚糖，真菌源比如双孢蘑菇(Agaricus bisporus)或黑曲酶(Aspergillus niger)。通过富含几丁质的提取物的水解得到壳聚糖。几丁质是由通过β类型(1，4)的键结合到一起的几个N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元组成的多糖。壳聚糖由葡萄糖胺糖单元(脱乙酰化单元)和通过β类型(1，4)的键结合到一起的N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元(乙酰化单元)组成，且形成聚(N-乙酰基-D-葡萄糖胺)_聚(D-葡萄糖)类型的聚合物。在本发明中，葡聚糖(D-葡萄糖单元)的百分数优选地小于聚合物的15% (质量/质量)。本发明的壳聚糖作为技术辅助是有用的。关于技术辅助，是指除任意设备或仪器以外的物质或材料，其本身不作为食品成分被消耗，意图用于原料、食品或它们的成分的转化，用于满足处理或转化过程的某些技术目的，且可以具有在成品中具有非有意但不可避免的残余物或食品的存在的结果(来自CODEX Alimentarius的定义)。本发明的壳聚糖有利地为真菌源且优选地源自子囊菌(Ascomycete)类型的真菌的菌丝体，且尤其是源自黑曲霉和/或源自真菌担子菌(Basidiomycete)，且尤其是香菇(Lentinula edodes)(香燕(shiitake))和/或双孢蘑燕。优选地，真菌是黑曲霉。壳聚糖可以是GMO源的，但优选为非GMO源的。可以使用任意类型的壳聚糖。用于制备壳聚糖的方法是被描述在专利W003068824(EP1483299 ；US7, 556,946)中的方法。许多研究证明，壳聚糖的抗微生物活性根据壳聚糖的乙酰化度(DA)且根据壳聚糖的分子量(分子量:MW)而变化。因此，本发明覆盖不同的DA和丽范围。两个参数(DA和MW)独立地影响壳聚糖的抗微生物活性，然而，似乎是丽对抗微生物活性的影响要比DA的影响更重要(Sekiguchi, S.等，(1994)Molecular weightdependency of antimicrobial activity by chitosan oligomers, 在:Nishinari,K.&Doi,E.(编辑)，"Food Hydrocolloids !Structures,Properties and Functions",Plenum Press, New York)。为了引用近来的实例，对细菌进行研究，主要包括以下那些研究:0mura，Y.等(Omura,Y.等，(2003)Antimicrobial activities of chitosan with different degreesof acetylation and molecular weights Biocontrol.Sc1.,8 (1):25-30) ；Tsai,G.J.；Zhang, S.L., Shieh, P.L.(Tsai, G.J.等(2004)Antimicrobial Activity of aLow—Molecular—Weight Chitosan Obtained from Cellulase Digestion of ChitosanJ.Food Prot., 67 (2):396-398) ；Zivanovic S.等(Zivanovic S.等，(2004)MolecularWeight of Chitosan Influences Antimicrobial Activity in 0il-1n-ffater EmulsionsJ.Food Prot.,67(5):952_959。对于真菌，Eaton,P.等(Eaton,P.等，(2008)Atomicforce microscopy study ofthe antibacterial effects of chitosans on Escherichia coli and Staphylococcusaureus Ultramicros·copy, 108 (10):1128-1134.)已经发现，壳聚糖的分子量(MW)越低，壳聚糖对微生物的生长和增殖的抑制作用就越好。以相同的方式，很多研究已经证明，壳聚糖的DA与其抗微生物活性之间的逆关系(Hongpattarakere,T.等(2008)Effect of deacetylation conditions on antimicrobialactivity of chitosans prepared from carapace of black tiger shrimp(Penaeusmonodon) Songklanakarin J.Sc1.Technol..30(1):第 I 页-第 9 页；Tsai, G.J., andal.(2002)Antimicrobial activity of shrimp chitin andchitosan from differenttreatments Fisheries Sc1.,68 (I):170-177)。本发明还涉及包含如前面所定义的壳聚糖的组合物。尤其，本发明涉及本发明的壳聚糖悬浮液。更具体地，例如从这种悬浮液的定性组成的角度，从这种悬浮液的纯度的角度和/或从壳聚糖源的角度，这种悬浮液适合用作技术辅助。壳聚糖作为粉末被掺入待处理的液体食品中。考虑到通过消除酒香酵母稳定微生物，壳聚糖尤其被使用。因此，本发明的壳聚糖是不溶于水的。关于“不溶于水”是指至少90%且优选地95% (质量/质量)的壳聚糖不溶于蒸馏水中。在实例中，由于壳聚糖被认为是完全不溶的，水中的可溶材料的百分数可以被比作杂质。本发明的壳聚糖是不溶性的，水合后，具有通常大于20% (质量/质量)的晶体部分。在其用作技术辅助之前，壳聚糖被悬浮且混合在液体(比如诸如水)中，所述液体与待处理的液体食品是相容的，即其不损害液体食品的最终使用。壳聚糖/液体的质量比率(例如:壳聚糖/水)优选地被包括在1/1-1/10之间，且优选是1/5 (质量/质量；m/m)。壳聚糖不溶于水，因此必须预先充分地搅拌混合物。优选地，在临将其添加到待处理的液体之前，搅拌混合物。本发明的壳聚糖或壳聚糖悬浮液被添加到待处理的液体食品中。在待处理的液体的整个体积上且例如在通过以小的体积倒出产品的泵送期间，壳聚糖还应是均匀的，以确保良好地分布在酒主体中。因此，壳聚糖应被逐渐添加。优选的是，在添加壳聚糖的同时，使待处理的液体均化。对于处理葡萄酒，通常需要大桶(vat)的完全泵过。在处理结束，通过抽取除去壳聚糖(技术辅助)，以除去壳聚糖和被吸附的微生物。例如，在7天到10天的作用时间后且在待处理的液体的自然倾析后，且通常在发酵的液体食品比如葡萄酒的处理中，进行这个除去步骤。本发明还涉及壳聚糖或如前面所定义的组合物作为抗真菌剂和主要用于控制酵母，尤其是酒香酵母属酵母和/或德克酵母属酵母，且甚至更尤其是异酒香酵母、布鲁塞尔酒香酵母、克劳森酒香酵母、班图酒香酵母、郎比可酒香酵母、B.naardenensis和/或B.nanus的用途。本发明的壳聚糖的作用不限于特定的菌株，因为相同类型的几种菌株被测试。如前面所示的，现有技术中的壳聚糖的已知浓度是高的，因为在大多数化妆品、食品或医疗应用中，需要宽抑制谱(细菌、酵母)。现在，本发明不寻找这种作用，相反，例如在发酵如在例如葡萄酒酿酒期间，必须避免有用的细菌和酵母的抑制。因此，本发明是出乎意外的，因为以非常低的剂量(< 10g/hL)，本发明的壳聚糖选择性地作用于不期望的酵母。另一方面，本发明涉及壳聚糖或如前面所定义的组合物作为抗真菌剂和特别用于控制液体食品，且尤其是植物源的即从植物(葡萄、苹果、马铃薯、甜菜根等)制备的液体食品，且尤其是通过发酵制备的液体食品例如葡萄酒、啤酒、苹果酒、起泡葡萄酒或果汁中的不期望的酵母的用途。本发明涉及液体食品的处理，液体食品比如水、发酵的饮料(通过在溶液中的食品转化成醇、通过基本产品的发酵而得到的饮料)、利口酒(其中添加了醇的葡萄汁)、烈酒(通过发酵饮料的蒸馏得到的)，主要的利口酒为:彼诺甜酒(Pineaudes Charentes)(基于法国白兰地(Cognac))、阿马尼亚克烧酒(Floe de Gascogne)(基于阿马尼亚克酒)、香槟酒和勃艮第葡萄酒的果仁酒(Ratafia of Champagne andBurgundy, Riquiqui)、来自 Jura 的 Macvin、来自 Beziers 的 Cataroise、来自 Normandie 的Pommeau(基于苹果白兰地酒)。液体食品可以从植物的不同部位得到:叶、根、谷物、果实等。因此，本发明涉及所有的液体食品，包括可能受到酒香酵母类型的不期望的酵母污染的所有液体；来自发酵的液体(食品或非食品)，比如发酵前或发酵期间的葡萄汁，或发酵液体(例如来自植物(马铃薯、甜菜根......或葡萄)的葡萄汁/生物质)；植物源的非发酵液体食品(果汁)，及来自葡萄汁的发酵的液体食品。因此，本发明的处理可以应用到皮斯科白兰地(Pisco)、彼诺甜酒、烈酒、苹果酒、啤酒、用于工业目的的酒精、及葡萄酒。意外发现，本发明的壳聚糖可以用作针对液体食品，且特别是植物源的，任选发酵的液体食品中的不期望的酵母的抗真菌剂，液体食品从其组成的角度，通常是复杂的。壳聚糖除去另外得到的或还 在发酵的液体植物食品之内的酵母，尤其是上面所引用的属或物种的那些酵母的能力是不可预测的。根据另一方面，本发明涉及用于液体食品，且特别为植物源的液体食品，且尤其是通过发酵制备的植物源的液体食品的医疗和/或预防处理的方法，其中将除去不期望的酵母，应防止不期望的酵母的存在，和/或应限制不期望的酵母的群体，且尤其是酒香酵母属和/或德克酵母属的酵母，甚至还特别是异酒香酵母、布鲁塞尔酒香酵母、克劳森酒香酵母、班图酒香酵母、郎比可酒香酵母、B.naardenensis和/或B.nanus,所述方法包括在壳聚糖或如前面所定义的组合物的存在下，放置液体食品。本发明还涉及生产房屋(生产工厂、葡萄酒和烈酒库房等)中的卫生学和预防方法，使用该方法可以特别避免停止生产用于清洁。预防用途通常与医疗处理一样重要(工厂的葡萄酒和烈酒库房的预防卫生学)。根据本发明的待处理的液体食品尤其是葡萄酒、啤酒或苹果酒。不期望的酵母特别是异酒香酵母和/或布鲁塞尔酒香酵母。本发明尤其涉及用于处理液体食品，任选地发酵的液体食品，以对抗酒香酵母属的酵母且尤其是布鲁塞尔酒香酵母物种的存在的方法。根据优选的备选方案，壳聚糖以Ι-lOg/hL待处理的液体食品，且优选地被包括在2_5g/hL待处理的液体食品之间的浓度存在。因此，与现有技术的其它产品相比，使用的浓度是特别低的，对于使用二碳酸二甲酯(DMDC)的处理，现有技术的其它产品通常需要多于20g/hL 左右。液体食品在壳聚糖的存在下放置足够的时间段，用于除去、限制或防止酵母的存在，尤其是前述酵母的存在。该时间段通常为至少3天，且优选至少5天，且还优选至少7天。关于“除去”酵母的存在，是指将不期望的酵母的群体减少到检测阈值(10CFU/mL)以下的事实。关于“限制”，是指将群体限制为不期望的酵母群体的至少10倍或甚至100倍。关于“预防”，是指预防不期望的酵母群体的发展、增殖，和/或限制不期望的酵母群体。处理可以是在发酵期间的液体食品上进行的。实际上，意外发现本发明的壳聚糖允许发酵的持续，且尤其是酒精发酵和/或苹果酸-乳酸发酵。发酵没有由于本发明的壳聚糖的存在而被扰乱。尤其，本发明的壳聚糖对酿酒酵母的群体没有有害作用。壳聚糖和/或包含壳聚糖的组合物优选地被分离，例如通过液体食品的抽取、澄清、过滤和/或离心，以保存液体食品。在与本发明的壳聚糖充分接触一段时间后，可以抽取液体食品。在阅读了解释性的说明书后，对于本领域的技术人员来说，本发明的其它目的、特征和益处将变得明显，所述说明书参考仅作为阐述给出且不以任何方式限制本发明的范围的实施例。实施例是本发明的主要部分，且从被视为整体的、包括实施例的说明书中，相对于任意现有技术状态似乎是新的的任意特征在其功能且在其一般性上是本发明的主要部分。因此，每一个实施例具有一般的范围。另一方面，在实施例中，所有的百分数是按重量计给出的，除非另有说明；且温度是以摄氏度给出的，除非另有说明；且压力是大气压力 ，除非另有说明。实施例A-酵母菌株用于葡萄酒的人工接种的布鲁塞尔酒香酵母的菌株为:被鉴定为在地中海葡萄园中占大多数且具有100% A和100% B基因型的菌株。它们源自ICV-DNAid菌株的收集(collection)。在28°C下温育7天后，它们被保持在4°C下的倾斜的琼脂糖培养基(YAC培养基)上。B-用于曲(leaven)的培养的培养基和条件曲是驯化培养基(acclimatization medium),在该培养基中酵母可以生长且达到约107CFU/mL的群体，同时适应不是非常有利的环境(酸pH、高的乙醇含量)。用于实验的曲的组成被描述在下面的表I中:表1-用于布鲁塞尔酒香酵母的曲培养基的组成

本发明涉及以微粉化粉末形式的壳聚糖，涉及其用于控制某些酵母比如酒香酵母(Brettanmyces)的用途，且涉及用于处理液体食品的方法。本发明尤其涉及以微粉化粉末形式的不溶于水的壳聚糖，其中颗粒大小被包括在5-50微米之间，且涉及其在液体食品的处理中和/或用于控制酒香酵母的用途。