专利名称：使用muc1拮抗剂抑制炎症的制作方法使用MUC1拮抗剂抑制炎症本申请要求2009年5月27日提交的美国临时申请序列号61/181，530、2009年10月21日提交的美国临时申请序列号61/253，730和2010年2月12日提交的美国临时申请序列号61/303，997的优先权，上述每个申请的全部内容均通过引用并入本文。1.发明领域本发明涉及炎性信号转导的调节。具体而言，已证明来源于MUCl细胞质结构域特定区域的MUCl肽抑制MUCl与NF- K B的相互作用，从而抑制NF- k B介导的炎性信号转导。此外，已证明了针对STAT3介导的炎性信号转导的类似作用。2.相关技术 NF-k B 蛋白(RelA/p65、RelB、c-Rel、NF-k Bl/p50 和 NF-k B2/p52)是普遍表达的转录因子。在无刺激时，NF-K B蛋白与IKBa和IkB抑制蛋白家族的其他成员形成复合物定位于细胞质中(Hayden&Ghosh，2008)。高分子量I k B激酶(IKKa、IKKP、IKKy)复合物对IKBa的磷酸化诱导IicBa的泛素化和降解，从而释放NF- k B进行核转位。继而NF-k B靶基因的激活通过调节炎性应答、细胞增殖和存活促进肿瘤发生(Karin&Lin，2002)。NF-kB p65与家族其他成员一样包含负责二聚化和DNA结合的N端Rel同源结构域(Rel homology domain, RHD)。RHD还作为IKBa蛋白中锚蛋白重复序列(ankyrinrepeats)的结合位点发挥作用，其阻断NF-k B p65的核定位信号(nuclear localizationsignal,NLS)。NF-k B_I k B a复合物在核和细胞质之间穿梭(Hayden&Ghosh, 2008)。典型NF-K B通路的激活(例如在对肿瘤坏死因子a (TNFa)的细胞应答中)诱导IKK-P介导的I K B a磷酸化和降解，同时NF- K B p65的平衡向核推移。核NF- k B 二聚体占据启动子和增强子区域中的K B共有序列以及简并变体(Hoffman等,2006 ;Gilmore, 2008)。NF-k B靶基因的激活还通过NF-K B p65的翻译后修饰及其与转录共激活因子相互作用而进一步调节(Hayden&Ghosh，2008)。许多NF- k B靶基因中的一个是I^Ba，其的激活导致I k B a的重新合成和NF- K B转录应答的终止。粘蛋白是具有大量0-糖基化的蛋白质，其主要由上皮细胞表达。分泌的和膜结合的粘蛋白形成物理屏障，其保护上皮细胞的顶边界不受由毒素、微生物和其他形式压力(发生在与外界环境的交界处)所引起的损害。跨膜粘蛋白I(MUCl)也可通过其细胞质结构域将信号传递至细胞内部。除具有海胆精子的蛋白-肠激酶-agrin(protein-enterokinase-agrin, SEA)结构域外,MUCl没有与其他膜结合粘蛋白相似的序列(Duraisamy等,2006)。因此，MUCl翻译为单一多肽，然后在SEA结构域经历自切割(JBC，1992 ；Macao,2006)。跨膜MUCl的C端亚基(MUCl-C)作为受体起作用(Ramasamy等，2007)，并包含足以诱导转化的72个氨基酸的细胞质结构域(MUCKD) (Huang等，2005)。MUCl-C亚基还通过依赖于其寡聚化的过程靶向核(Leng等，2007)。MUCl-⑶作为被表皮生长因子受体(Li等，2001)、c-Src (Li 等 2001)、糖原合酶激酶 3 ^ (GSK3 ^ ) (Li 等，1998)和 c-AbI (Ahmad 等2006)磷酸化的底物起作用。MUCl-⑶还通过直接相互作用稳定Wnt效应物、P -联蛋白，因此有助于转化(Huang等，2005)。其他研究已证明MUCl-⑶直接与IKK P和IKK Y相互作用，并有助于激活IKK复合物(Ahmad等，2007)。显然，沉默MUCl下调NF-k B p65在人癌细胞内的组成型激活，提示MUCl-⑶在NF- K B p65通路的调节中起功能性作用(Ahmad等，2007)。这些发现也暗示，小分子可以靶向MUCl-⑶的功能来干扰癌细胞中的NF-k B信号转导。然而，至今没有有关影响NF- K B信号转导的MUCl拮抗剂的报道。信号转导和转录激活因子(signaltransducer and activator oftranscription, STAT)家族成员也参与转化、肿瘤细胞存活、侵袭和转移(Yu和Jove,2004)。STAT3转录因子被鉴定为白介素-6(IL-6)炎性应答的效应物(Wegenka，1994)。STAT3 通过以下来激活Janus-激活激酶(Janus-activated kinase, JAK) - I 磷酸化 IL-6受体，募集STAT3，之后磷酸化STAT3的705位保守酪氨酸(Yu和Jove，2004)。表皮生长因子受体的激活也与STAT3Tyr-705的直接磷酸化相关。然后磷酸化的STAT3经历二聚化，易位至核并诱导STAT3靶基因的激活，所述靶基因编码细胞周期进展调节物(细胞周期蛋白Dl 和 c-Myc)和凋亡抑制物(生存素和 Bcl-xL) (Alvarez, 2005, Alvarez, 2006)。激活的STAT3诱导转化(Bromberg，1999)。而且，STAT3激活在多种癌和血液恶性肿瘤中被检测到(Aaronson 和 Horvath, 2002 ；Bowman, 2000 ；Yu 和 Jove, 2004),这与 STAT3 参与控制生长和 存活之基因的转录相符。对此，JAK-I — STAT3通路的小分子抑制剂在体外和动物模型中有抗癌活性(Song, 2005 ;Siddiquee，2007 ；Ahmad, 2008 ;Germain 和 Frank，2007)。另外，阻断EGFR至STAT3信号转导的适体抑制恶性上皮和血液细胞的生长(Buerger，2003)。这些发现共同支持STAT3通路在联系炎症与肿瘤发生中的重要性。发明概述因此，按照本发明，提供了在表达MUCl的细胞中抑制炎性信号转导的方法，其包括将细胞与具有至少4个连续MUCl残基但不多于20个连续MUCl残基而且包含序列CQC的MUCl肽相接触，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定对应于天然MUC-I跨膜序列的至少一个氨基酸残基所覆盖。所述肽可包含至少5、6或7个连续MUCl残基，而且所述序列可更具体地包含 CQCR(SEQ ID NO :54)、CQCRR(SEQ ID NO :50)、CQCRRR(SEQ ID NO :51)、CQCRRRR (SEQ ID NO : 52)、CQCRRK (SEQ ID NO 4)或 CQCRRKN(SEQ ID NO :53)。所述肽可包含MUCl的不多于10个连续残基、11个的连续残基、12个连续残基、13个连续残基、14个连续残基、15个连续残基、16个连续残基、17个连续残基、18个连续残基或19个连续残基。MUCl阳性细胞可以是肿瘤细胞、内皮细胞或炎性细胞，例如巨噬细胞、B细胞、T细胞、树突状细胞、骨髓源性抑制细胞、NK细胞或嗜中性粒细胞。所述肽可以与细胞递送结构域融合，例如聚D-R、聚D-P或聚D-K。所述方法还可包括将细胞与第二抗炎剂接触,例如类固醇或C0X-2抑制剂。第二抗炎剂的接触可在肽之前、之后或与其同时进行。所述肽包含的可以全部是L氨基酸、全部是D氨基酸或者包含L和D氨基酸的混合物。炎性信号转导可包括NF-K B介导的信号转导或STAT介导的信号转导，例如STAT3介导的信号转导。NF-k B介导信号转导的炎性信号转导可包括NF-K B激活选自Bcl-xL和MUCl的靶基因。STAT3介导的炎性信号转导可包括STAT3激活选自以下的靶基因细胞周期蛋白D1、生存素、Idpl、Idp2、CdknlC, Leftyl、Mest、Aesl、Zfp57、Zfp3611、Sh3bpl、Ccnd3 和 MUCl。在另一实施方案中，提供了在表达MUCl的细胞中抑制MUCl与NF-k B或STAT结合的方法，其包括将细胞与具有至少4个连续MUCl残基但不多于20个连续MUCl残基而且包含序列CQC的MUCl肽相接触，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定对应于天然MUC-I跨膜序列的至少一个氨基酸残基所覆盖。在另一实施方案中，提供了在表达MUCl的细胞中抑制MUCl与IKBa竞争结合NF- K B的方法，其包括将细胞与具有至少4个连续MUCl残基但不多于20个连续MUCl残基而且包含序列CQC的MUCl肽相接触，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定对应于天然MUC-I跨膜序列的至少一个氨基酸残基所覆盖。在另一实施方案中，提供了在表达MUCl的细胞中抑制MUCl诱导的NF-K B核转位的方法，其包括将细胞与具有至少4个连续MUCl残基但不多于20个连续MUCl残基而且包含序列CQC的MUCl肽相接触，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定对应于天然MUC-I跨膜序列的至少一个氨基酸残基所覆盖。在又一实施方案中，提供了抑制对象中的炎性应答的方法，包括向所述对象施用具有至少4个连续MUCl残基但不多于20个连续MUCl残基而且包含序列CQC (SEQ ID NO 4)的MUCl肽，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定对应于天然MUC-I跨膜序列的至少一个氨基酸残基所覆盖。所述肽可包含至少5、6或7个连续MUCl残基，而且所述序列可更具体地包含CQCR、CQCRR、CQCRRR、CQCRRRR、CQCRRK或CQCRRKN。所述肽可包含MUCl的不多于10个连续残基、11个连续残基、12个连续残基、13个连续残基、14个连续残基、15个连续残基、16个连续残基、17个连续残基、18个连续残基或19个连续残基。炎性应答可由NF- K B介导的信号转导或STAT介导的信号转导(例如STAT3介导的信号转导)引起。肽可与细胞递送结构域融合，例如聚D-R、聚D-P或聚D-K。施用可包括静脉内、动脉内、口服、瘤内、皮下、表面或腹腔内施用，或者局部、区域、系统或持续施用。抑制可包括抑制或解除炎性应答。所述方法还包括向对象施用第二抗炎治疗，例如类固醇或C0X2抑制剂。第二抗炎治疗的施用可在肽之前、之后或与其同时进行。对象可以是人。所述肽可以以0. l-500mg/kg/天施用，或更特别地，以10-100mg/kg/天施用。所述肽可以每日施用，例如施用7天、2周、3周、4周、I个月、6周、8周、2个月、12周或3个月。所述肽可以每周施用，例如施用2周、3周、4周、6周、8周、10周或12周。所述肽包含的可以全部是L氨基酸、全部是D氨基酸或者包含L和D氨基酸的混合物。在又一实施方案中，提供了药物组合物，其包含⑴具有至少4个连续MUCl残基但不多于20个连续MUCl残基而且包含序列CQC的MUCl肽，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定对应于天然MUC-I跨膜序列的至少一个氨基酸残基所覆盖；和(ii)除(i)外的第二抗炎剂。第二抗炎剂是类固醇或C0X-2抑制剂。考虑本文描述的任何方法或组合物都可参照本文描述的任何其他方法或组合物实施。当在权利要求和/或说明书中无数量词与术语“包含”一起使用时，可以表示“一”，但也具有“一或更多”、“至少一”和“一或多于一”的含义。词“约”是指所示数值加或减5%。根据下述详细说明，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而应当理解，指出本发明优选实施方案的详细描述和具体实施例仅仅以说明的方式给出，因为对本领域技术人员而言，根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修饰将变得显而易见。下述附图构成本发明说明书的一部分，包括它们以进一步阐明本发明的某些方面。参照一幅或多幅这些附图并结合详细说明可以更好地理解本发明。图IA-Dp65相关联。(图1A-C)所示细胞的裂解物用抗_p65或对照IgG进行免疫沉淀。沉淀物用抗-MUCl-C和抗-p65 进行免疫印迹。(图1D)将ZR-75-1细胞的裂解物用结合了谷胱甘肽珠的GST或GST-MUC1-CD孵育。吸附物用抗-p65进行免疫印迹。通过考马斯亮兰染色评估引入物GST蛋白。图2A-D =MUCl减弱I k B a和NF- k B p65的结合。(图2A-C)用抗-p65或对照IgG 对所示 ZR-75-1/ 载体、ZR-75-1/MUC1 siRNA(图 2A)、Hela/ 载体、Hela/MUCl (图 2B)、3Y1/载体和3Y1/MUC1-⑶(图2C)细胞的胞浆裂解物进行免疫沉淀。沉淀物用抗I k B a和抗P65的抗体进行免疫印迹。(图2D)在存在或不存在递增量的MUCl-CD的情况下，将结合了谷胱甘肽珠的GST和GST-I KBa用p65 (186-306)孵育。吸附物用抗-p65进行免疫印迹(上)。引入物(input) MUCl-CD通过用抗-MUCl-C进行免疫印迹来评估(中)。引入物GST和GST-I KBa蛋白通过考马斯亮兰染色评估(下)。图3么-0:1^(1-(促进,-1^ 65对此111基因启动子的占据。(图3A)固定ZR-75-1/ 载体和 ZR-75-l/MUClsiRNA 细胞并用抗-MUCl-C (绿色)和抗-NF- k B p65 (红色)双染色。细胞核用T0-PR0-3染色。(图3B和3C)将ZR-75-1/载体、ZR-75-1/MUC1siRNA (图3B) ,HeLa/载体和HeLa/MUCl (图3C)细胞的可溶性染色质用抗p65或IgG对照进行免疫沉淀。最终的DNA提取物用覆盖Bcl-xL启动子NF- k B-RE (-597至-304)或对照区域(-1001至-760)的引物对进行PCR扩增。(图3D)将ZR-75-1细胞的可溶性染色质用抗MUCl-C或对照IgG进行免疫沉淀，并分析Bcl-xL NF- k B-RE或对照区域序列(左)。在Re-ChIP实验中，抗MUCl-C沉淀物被释放，用抗p65再免疫沉淀，然后分析Bcl-xL启动子序列(右)。图4A-D :在MCF-10A细胞对TNF a的应答中MUC1-C与NF- k B p65相互作用。(图4A)将MCF-10A细胞用20ng/ml TNFa刺激所示时间。将裂解物用抗MUCl-C和抗￠-肌动蛋白进行免疫印迹。(图4B)将未处理或用20ng/ml TNFa刺激24小时的MCF-10A细胞裂解物用抗P65或对照IgG进行免疫沉淀。沉淀物用所示抗体进行免疫印迹。(图4C)将未处理或用20ng/ml TNFa刺激24小时的MCF-10A细胞可溶染色质用抗MUCl-C进行免疫沉淀，然后分析MUCl NF-k B结合基序启动子序列。(图4D)在Re-ChIP实验中，抗MUCl-C沉淀物被释放，用抗P65再免疫沉淀，然后分析MUCl NF- K B结合基序启动子序列。图5A-D :1^(1-(促进,-1^ p65 介导的 MUCl 启动子激活。(图 5A 和 5B)MCF_10A细胞用对照或p65siRNA合并物转染72小时。不处理转染的细胞或将其用TNF a刺激24小时。将裂解物用所示抗体进行免疫印迹(图5A)。然后转染细胞以表达NF-K B-Luc报告物或MUCl启动子-Luc报告物(pMUCl-Luc)和SV-40-Reni I Ia-Luc质粒(作为对照)(图5B)。(图5C和5D)将MCF-10A细胞用对照或MUClsiRNA合并物转染72小时。不处理转染细胞或将其用TNFa刺激24小时。将裂解物用所示抗体进行免疫印迹(图5C)。然后转染细胞以表达 NF- K B-Luc 报告物或 MUCl 启动子-Luc 报告物(pMUCl-Luc)和 SV-40-Reni I Ia-Luc质粒(作为对照)(图OT)。转染后48小时测量萤光素酶的活性。结果表示为与用对照siRNA转染的未处理细胞(值指定为I)所得相比的激活倍数(三次独立实验的平均数土标准差)。图6A-D MUCI/CQC肽阻断MUCl和NF-k B p65之间的相互作用。(图6A)具有聚-dArg转导结构域的MUC1/CQC(G0-201)和MUCI/AQA (CP-1)肽的序列。在存在MUC1/CQC或MUC1/AQA的情况下，在室温下将GST-MUCl-⑶用纯化的NF- k B p65孵育I小时。将谷胱甘肽珠的吸附物用抗p65进行免疫印迹(左)。不处理MCF-10A细胞，或者在存在5 u MMUCI/CQC或MUC1/AQA肽(每24小时添加)的情况下将其用TNF a刺激72小时。将抗p65沉淀物用所示抗体进行免疫印迹(右)。(图6B和6C)不处理MCF-10A细胞，或者在存在5uM MUCI/CQC或MUCI/AQA肽(每24小时添加)的情况下将其用TNF a刺激72小时。将可溶染色质用抗MUCl-C(左)或抗p65(右)进行沉淀，然后分析MUCl NF-K B结合基序启动子序列(图6B)。将裂解物用所示抗体进行免疫印迹(图6C)。(图6D)MUCl-C以自诱导调节回路通过IKK与p65的相互作用激活NF- K B通路的预计作用的模型。 图7A-E =MUCl-C细胞质结构域与NF- k B p65和p65RHD结合。(图7A-B)将所示细胞的裂解物用抗P65或对照IgG进行免疫沉淀。将沉淀物用抗MUCl-C和抗p65进行免疫印迹。(图7C)将ZR-75-1细胞的裂解物用结合了谷胱甘肽珠的GST或GST-MUCl-⑶孵育。将吸附物用抗P65进行免疫印迹。引入物GST蛋白通过考马斯亮兰染色评估。(图7D-E)用纯化的 p65 (1-180)(图 7D)或 p65 (186-306)(图 7E)孵育 GST、GST-MUCI-CD 和GST-I K Ba。吸附物和引入物用抗p65进行免疫印迹。图8 :ZR-75_1乳腺癌细胞中的MUCl沉默。使用BLOCK-iT靶点筛选系统(Invitrogen)产生小干扰 RNA (siRNA)，其靶向 MUCl 序列(AAGITCAGTGCCCAGCTCTAC (SEQ IDNO 55))和对照序列(CGCTTACCGAITCAGAATGG (SEQ ID NO :56))。siRNA 盒用于产生所述慢病毒(Kawano等，2007)。在存在聚凝胺(Sigma)时以感染复数5用慢病毒感染ZR-75-1细胞。选择表达EGFP的细胞克隆。裂解物用所示抗体进行免疫印迹。图9A-D =MUCl-C 直接与 STAT3DBD 结合。(图 9A)将 ZR-75-1 (左)和 MCF-7 (右)细胞的裂解物用抗STAT3或对照IgG进行免疫沉淀。将沉淀物用所示抗体进行免疫印迹。(图9B)将ZR-75-1细胞的裂解物用结合了谷胱甘肽珠的GST和GST-MUCl-⑶孵育。将吸附物用抗STAT3进行免疫印迹。引入物GST和GST-MUCl-⑶蛋白通过考马斯亮兰染色评估。(图9C)显示MUCl细胞质结构域的氨基酸序列，指示了磷酸化和结合位点。用纯化的重组STAT3孵育结合了谷胱甘肽珠的GST、GST-MUCl-CD、GST-MUCI-CD (1-45)和GST-MUC1-CD(46-72)。将吸附物用抗-STAT3进行免疫印迹。引入物GST和GST-MUC1-CD融合蛋白质通过考马斯亮兰染色评估。(图9D)STAT3的结构。用纯化的MUCl-⑶孵育结合了谷胱甘肽珠的GST、GST-STAT3(全长；1-770位氨基酸)、GST-MUCl-CD (N端；1-257位氨基酸)、GST-MUC1-CD (DBD ;257_514 位氨基酸)和 GST-MUCl-CD (C 端；514_770 位氨基酸)。将吸附物用抗MUCl-C进行免疫印迹。引入物GST和GST-STAT3融合蛋白通过考马斯亮兰染色评估。图10A-D =MUCl-C与STAT3转录复合物相关联。(图10A-B)表示STAT结合位点(SBS)位置的MUCl启动子区域略图。将ZR-75-l(图10A)和MCF-7 (图10B)细胞的可溶染色质用抗STAT3 (左)和抗MUCl-C (右)进行免疫沉淀。最终的DNA提取物用覆盖MUCl 启动子STAT结合位点(SBS ；-689至-414)和对照区域(CR ；+4524至+4745)的引物对进行PCR扩增。(图10C-D)将所示细胞的可溶染色质用抗STAT3沉淀，并分析MUCl启动子SBS和CR序列。在re-ChIP实验中，抗STAT3沉淀物被释放，用抗MUCl-C再免疫沉淀，然后分析MUCl启动子序列。图IlA-D :在MCF-10A细胞对IL-6的应答中MUC1-C与STAT3相互作用。(图11A)将MCF-10A细胞用IL-6刺激所示时间。将全细胞裂解物(左)和核裂解物(右)用所示抗体进行免疫印迹。(图11B)用IL-6刺激MCF-10A细胞24小时。将裂解物用抗STAT3或对照IgG进行免疫沉淀。将沉淀物用 所示抗体进行免疫印迹。(图11C)将被IL-6刺激所示时间的MCF-10A细胞的可溶染色质用抗STAT3或对照IgG进行沉淀。分析沉淀物的MUCl启动子SBS和CR序列。(图11D)将对照和IL-6刺激的MCF-10A细胞的可溶染色质用抗STAT3沉淀，并分析MUCl启动子SBS和CR序列。在re_ChIP实验中，释放抗STAT3沉淀物，用抗MUCl-C再免疫沉淀，然后分析MUCl启动子序列。图12A-D IL-6对MUCl启动子的激活由STAT3介导。(图12A和B)MCF_10A细胞用对照或STAT3 siRNA合并物转染72小时。然后不处理转染细胞或将其用IL-6刺激24小时。裂解物用所示抗体进行免疫印迹(图12A)。然后转染细胞以表达MUCl启动子-Luc报告物(pMUCl-Luc)和Renilla-Luc质粒。转染后48小时测量萤光素酶的活性(图12B)。结果表示为与用对照siRNA转染的未处理细胞(值指定为I)所得相比的激活倍数(三次独立实验的平均数土标准差)。(图12C)转染MCF-10A以表达野生型或在STAT结合位点突变(mSBS)的pMUCl-Luc以及ReniIIa-Luc。24小时后，不处理细胞或用IL-6刺激24小时，然后测定萤光素酶活性。结果表示为与用野生型pMUCl-Luc转染的未处理细胞(值指定为I)所得相比的激活倍数(三次独立实验的平均数土标准差)。(图12D)用对照或STAT3siRNA处理MCF-10A。24小时后，不处理细胞或将其用IL-6刺激24小时，然后分析萤光素酶活性。结果表示为与用对照siRNA转染的未处理细胞(值指定为I)所得相比的激活倍数(三次独立实验的平均数土标准差)。图13A-D =MUCl-C促进STAT3占据MUCl启动子。(图13A和B)MCF_10A细胞用对照或MUClsiRNA合并物转染72小时。然后不处理转染细胞或将其用IL-6刺激24小时。用抗STAT3沉淀可溶染色质，并分析MUCl启动子SBS和CR序列(图13A)。然后转染细胞以表达MUCl启动子-Luc报告物(pMUCl-Luc)和Renilla-Luc质粒。转染后48小时测量萤光素酶的活性(图13B)。结果表示为与用对照siRNA转染的未处理细胞(值指定为I)所得相比的激活倍数(三次独立实验的平均数土标准差)。(图13C)用抗STAT3沉淀ZR-75-1/载体和ZR-75-1/MUC1 siRNA细胞的可溶染色质，并分析MUCl启动子SBS和CR序列。(图13D)转染 ZR-75-1/ 载体和 ZR-75-1/MUC1 siRNA 细胞以表达 pMUCl-Luc 和 Reni I Ia-Luc。转染后48小时测量萤光素酶的活性。结果表示为与ZR-75-1/MUC1 siRNA细胞(值指定为I)所得相比的激活倍数(三次独立实验的平均数土标准差)。图14A-D :在IL-6刺激的MCF-10A细胞中G0-201阻断MUC1-C和STAT3之间的相互作用。(图14A)在室温中在G0-201或CP-I的存在下与纯化的MUCl-CD孵育GST-STAT31小时。谷胱甘肽珠的吸附物用抗MUCl-C进行免疫印迹(图14B-C)。在5mM G0-201或CP-I (每24小时添加)的存在下用IL-6刺激MCF-10A细胞72小时。抗STAT3沉淀物用所示抗体进行免疫印迹(图14B)。用抗STAT3或抗MUCl-C沉淀可溶性染色质，并分析MUCl启动子 SBS 和 CR 序列(图 14C)。(图 14D)pMUCl-Luc。图15 :MUC1_CD 吻合妝(Stapled Peptide)的序列。图16A :MUC1-⑶吻合肽对非小细胞肺癌细胞H1650生长的作用。为评价对MUCl功能抑制的敏感性，用I和5iiM MUCl CQC吻合肽(G0-200-1B)处理H1650NSCLC细胞7天。用5 ii M G0-200-1B处理H1650细胞与生长的显著抑制和细胞数降低相关。图16B G0-200-2B对细胞增殖的作用。非小细胞肺癌细胞系H-1975培养在含有10%热失活胎牛血清、100单位/mL青霉素、100 u g/ml链霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM。细胞在处理前一天重新接种。用5iiM G0-200-2B处理细胞3天，细胞活力由台盼蓝排除法测定。图17 :不同MUCl-⑶CQC区域肽对激素依赖性乳腺癌细胞生长的作用。为确定暴露于包含不同MUCl-⑶CQC区域的肽是否影响生长，用5iiM不同的肽处理ZR-75-1乳腺癌细胞4天并监测细胞增殖。显著地，与未处理的细胞相比有极大的生长抑制。图18 :不同MUCl-CD CQC区域肽对非小细胞癌细胞生长的作用。用5 y M G0-203、G0-203-2或G0-203cyc处理非小细胞肺癌细胞A5497天。第7天的活细胞数通过台盼蓝排除法测定，通过比较未处理细胞的细胞生长来计算生长抑制百分比。图19 :不同MUCl-⑶CQC区域肽对非小细胞癌细胞H1975生长的作用。用5yM不同的MUCl-⑶CQC区域肽处理非小细胞肺癌细胞H19756天。第6天的活细胞数通过台盼蓝排除法测定。结果证明，用5 u M不同肽处理H1975细胞与显著的生长抑制相关。图20 :不同MUCl-⑶CQC区域肽对三阴性乳腺癌细胞生长的作用。用5 ii M不同的MUCl-CD CQC区域肽处理三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-2316天。第6天的活细胞数通过台盼蓝排除法确定。结果证明，用不同肽处理MDA-MB-231细胞与显著的生长抑制相关。图21 :更短的G0-203肽对ZR-75-1乳腺癌细胞增殖的作用。将人ZR-75-1乳腺癌细胞培养在补充了 10%热失活胎牛血清、100单位/mL青霉素、100 u g/ml链霉素的RPMI1640中。每天用5 ii M的不同肽处理细胞4天，细胞活力通过台盼蓝排除法确定。与G0-210相比，每天用 5iiMG0-203(SEQ ID NO :53)、G0_207 (SEQ ID NO :4)、G0_208 (SEQ ID NO :50)和G0-209 (SEQ ID NO :54)处理ZR-75-1乳腺癌细胞4天与显著的生长抑制相关。说明性实施方案的描述本发明人和其他人已对MUCl在癌症中的作用进行了广泛研究。如上所述，人MUCl是异源二聚体糖蛋白，其作为单一多肽翻译，并在内质网中被切割成N端和C端亚基(Ligtenberg 等，1992 ；Macao 等，2006 ；Levitin 等，2005)。MUCl 的异常过表达在大多数人癌中被发现(Kufe等，1984),其赋予非锚定依赖性生长和致瘤性(Li等,2003a ；Huang等，2003 ；Schroeder等,2004 ；Huang等,2005)。其他研究已证明MUCl的过表达赋予对氧化应激和基因毒性抗癌剂所诱导凋亡的抗性(Yin和Kufe，2003 ；Ren等，2004 ；Raina等，2004 ；Yin 等，2004 ；Raina 等，2006 ；Yin 等，2007)。栓系(tethered)和分泌的粘蛋白家族的作用是在上皮细胞表面提供保护性屏障。在上皮层有损坏时，邻近细胞间的紧密连接被破坏，由于细胞开始heregulin诱导的修复程序而丧失极性(Vermeer等2003)。MUCl-N从细胞表面脱落(Abe和Kufe, 1989),剩余 MUCl-C的作用是作为将环境压力信号传至细胞内的转导物。对此，MUCl-C与ErbB受体家族成员形成细胞表面复合物，而且MUCl-C应答于heregulin刺激而靶向核(Li等，2001 ；Li等，2003c) JUCl-C还通过MUCl细胞质结构域(⑶)与联蛋白家族成员的直接相互作用从而将ErbB受体和Wnt信号转导通路整合来发挥作用(Huang等，2005 ；Li等，2003c ；Yamamoto等，1997 ；Li等，1998 ；Li等，2001 ；Li和Kufe, 2001)。其他研究已证明，MUCl-CD被糖原合酶激酶3 0、^1^、蛋白激酶〇8和c-Abl磷酸化(Raina等，2006 ;Li等，1998 ;Li等，2001 ；Ren 等，2002)。负责MUCl-C核靶向的机制未知。包含典型核定位信号(NLS)的蛋白质通过首先结合至输入蛋白a (importin a )，然后结合至输入蛋白0而输入核(Weis, 2003)。乘载物(cargo)-输入蛋白a/0复合物通过与核孔蛋白结合而停靠在核孔，并且通过依赖于RanGTPase的机制转运通过核孔。典型的NLS是单组分(monopartite)的,其带有4_5个碱性氨基酸的单一簇；或者是双组分(bipartite)的，带有由10-12个氨基酸的接头分隔开的两簇碱性氨基酸。MUCl-⑶包含并不符合单组分NLS原型的RRK基序(Hodel等，2002)。然而，包含非典型NLS的某些蛋白质通过直接结合至输入 蛋白P转运通过核孔(Kau等，2004)。输入蛋白P与一些核孔蛋白相关联(Ryan和Wente, 2000),所述核孔蛋白包括Nup62,其位于核孔复合物的细胞质和核质两面(Percipalle等，1997)。其他研究已表明，￠-联蛋白通过不依赖于输入蛋白和核孔蛋白的机制输入核中(Suh和Gumbiner, 2003)。2006年，本发明人报道MUCl通过涉及与Nup62结合的机制输入核(Leng等，
2007)。他们也证明MUCl通过MUCl细胞质结构域中的CQC基序形成寡聚体，而且MUCl寡聚化是核输入所必需的。2007年，他们还证明MUCl在人癌细胞内的过表达与NF-k B p65的组成型激活相关(Ahmad等，2007)。已表明MUCl在体内与高分子量I k B激酶(IKK)复合物相互作用，而且MUCl细胞质结构域与IKKP和IKKy直接结合。MUCl与IKK3和IKKy 二者的相互作用对IKKP激活是必需的，其导致IKBa的磷酸化和降解。这些发现表明，MUCl对IKKP的生理激活是重要的，而且如在人癌症中所发现的，MUCl过表达赋予IKK P -NF- K B p65通路的持续诱导。在另外的未发表工作中，本发明人已将其研究扩展至进一步阐明CQC基序在寡聚体形成中的作用。他们还证明对应于这一区域的短肽能够以干扰MUCl寡聚体形成，阻止其转运至肿瘤细胞核中。这些肽能抑制肿瘤细胞生长，而且诱导这些细胞的凋亡甚至肿瘤组织的坏死。考虑到MUCl在炎症疾病状态中的新作用，本发明人试图研究这些肽是否能用于治疗炎症疾病。目前的研究证明，MUCl-⑶与NF-K B p65直接结合并阻断NF-K B p65和IkBq之间的相互作用。本发明人现在证明，MUCl-C亚基与NF-k B靶基因启动子上的NF-kB p65相关联，并促进NF-k B介导的转录。结果还证明MUCl-C寡聚化抑制剂阻断MUCl与NF- K B p65的相互作用并且阻断炎性NF- k B通路的组成型激活。此外，已证明与STAT3(另一个炎性信号转导因子)的类似相互作用，MUCl对该过程的参与甚至更多。 下面更详细地描述本发明的这些和另一些方面。I. MUClA.结构MUCl是粘蛋白型糖蛋白，其表达于正常分泌性上皮细胞的顶边界(Kufe等，1984)。MUCl作为单一肽合成并在内质网中将前体切割成两个亚基，之后形成异源二聚体(Ligtenberg等，1992)。切割可通过自催化过程介导(Levitan等,2005)。大于250kDa的MUClN端(MUClN-ter，MUCI-N)亚基包含数量可变的20个氨基酸的串联重复，其因高度保守变化而不完全并且被O-连接聚糖修饰(Gendler等，1988 ；Siddiqui等，1988)。MUCl-N通过与约23kDa的C端亚基(MUClC-ter，MUCl-C) 二聚化而栓系于细胞表面，所述C端亚基包含58个氨基酸的胞外区、28个氨基酸的跨膜区和72个氨基酸的细胞质结构域(CD ；SEQID NO: I) (Merlo等，1989)。人MUCl序列在以下显示GSVVVQLTLA FREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGffG I ALLVLVCVLVALA I VYL I ALAV COCRRKNYGOLPIFPAR
DTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAA TSANL (SEQID NO 2)加粗序列表示⑶，下划线部分是寡聚化抑制肽(SEQ ID NO :3)。随着正常上皮细胞转化成癌细胞，MUCl在胞质内和整个细胞膜上异常过表达(Kufe等，1984 ;Perey等，1992)。与细胞膜结合的MUCl通过网格蛋白介导的内吞作用靶向内涵体(Kinlough等，2004)。另夕卜，MUCl-C 而不是 MUCl-N 靶向核(Baldus 等，2004 ；Huang 等，2003 ；Li 等，2003a ；Li 等，2003b ；Li 等，2003c ；ffei 等，2005 ；ffen 等，2003)和线粒体(Ren 等，2004)。B.功能MUCl 与 ErbB 受体家族成员(Li 等,2001b ；Li 等，2003c ；Schroeder 等，2001)以及Wnt效应子、￠-联蛋白(Yamamoto等，1997)相互作用。表皮生长因子受体和c_Src将MUCl细胞质结构域(MUCl-CD)的Y-46磷酸化，从而增加MUCl和P -联蛋白的结合(Li等，2001a ;Li等，2001b)。MUCl和P -联蛋白的结合也被糖原合酶激酶3 P和蛋白激酶C S调节(Li等，1998 ;Ren等，2002)。MUCl与3 -联蛋白共定位于核内(Baldus等，2004 ;Li等，2003a ；Li等，2003c ;Wen等，2003)，并共同激活Wnt靶基因的转录(Huang等，2003)。其他研究显示MUCl还与p53直接结合并调节p53靶基因的转录(Wei等，2005)。值得注意的是，MUCl过表达足以诱导非锚定依赖性生长和致瘤性(Huang等，2003 ；Li等，2003b ；Ren等，2002 ； Schroeder 等，2004)。大多数线粒体蛋白质在核内编码，并且通过线粒体外膜和内膜中的易位复合物输入线粒体内。某些线粒体蛋白质包含N端线粒体革巴向序列，并且与线粒体外膜中的Tom20相互作用(Truscott等,2003)。其他线粒体蛋白质包含内部革巴向序列，并且与Tom70受体相互作用(Truscott等,2003)。近期工作显示,无内部革巴向序列的线粒体蛋白质通过HSP70与HSP90的复合物递送至Tom70 (Young等，2003)。II. MUCl 肽A.结构本发明考虑设计、生产及使用多种MUCl肽。这些肽的结构特征如下。首先，所述肽具有不多于20个的连续MUCl残基。因此，术语“具有不多于20个的连续残基的肽”(甚至包含术语“包含”时)不应被理解为包含更多数量的连续MUCl残基。其次，所述肽包含CQC基序，而且还可包含CQCR、CQCRR或CQCRRK基序。因此，所述肽具有(至少)MUC1_C结构域的这4、5或6个连续残基。第三，所述肽有至少I个氨基酸残基与CQCRRK基序第一个C残基的NH2端一侧连接，使得所述第一个C残基被与其连接的至少一个氨基酸所“覆盖”。该残基可以是MUCl中天然存在的(即来自跨膜结构域)，可以随机选择(选自20个天然氨基酸或其类似物中的任一个)，或者可以是另一肽序列的一部分(例如，用于纯化的标签序列、稳定化序列或细胞递送结构域)。
通常，所述肽为50个残基或更少，并且包含不多于20个的连续MUCl残基。全长可以是 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 个残基。考虑的肽长度范围是4-50个残基、7-50个残基、4-25个残基、7_25个残基、4_20个残基、7_20个残基、3-15个残基和7-15个残基。连续MUCl残基数可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。考虑的连续残基范围是4-20个残基、5-20个残基、6-20个残基、7-20个残基、4-15个残基、5-15个残基、6-15个残基和7_15个残基。本发明可以使用L-构型氨基酸、D-构型氨基酸或其混合物。尽管L氨基酸占蛋白质中所发现氨基酸的绝大多数，但D-氨基酸在异域海生生物(例如海蜗牛)产生的一些
蛋白质中发现。它们也是细菌细胞壁肽聚糖的主要组分。D-丝氨酸可在脑中起神经递质的作用。氨基酸构型的L和D规则不涉及氨基酸本身的光学活性，而是涉及理论上可合成氨基酸的甘油醛异构体的光学活性(D-甘油醛是右旋的，L-甘油醛是左旋的)。“全D”肽的一种形式是逆反(retro-inverso)肽。天然多肽的逆反修饰涉及这样的氨基酸的合成组装，即其具有与相应L-氨基酸立体化学相反的a -碳，即D-氨基酸相对于天然肽序列顺序相反。因此逆反类似物具有颠倒的末端和颠倒的肽键方向(NH-C0而不是C0-NH)，而大概维持了与天然肽序列相同的侧链拓扑结构。见美国专利6，261，569，其通过引用并入本文。如上所述，本发明考虑融合或缀合细胞递送结构域(也称为细胞递送载体，或细胞转导结构域)。该结构域是本领域公知的，而且通常以短的两性或阳离子肽和肽衍生物为特征，通常包含多个赖氨酸和精氨酸残基(Fischer，2007)。特别感兴趣的是聚D-Arg和聚D-Lys序列(例如，右旋残基，长8个残基)。表I


本发明提供了来自MUC1细胞质结构域的肽以及使用其的方法。这些肽可以抑制MUC1寡聚化、抑制MUC1与NF-κB或STAT的相互作用，并且阻断由NF-κB或STAT信号转导所介导的炎性应答。