专利名称：一种产氨基甲酸乙酯脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)又名脲烧,属多位点致癌物质，于2007年被 WHO 认定为 2A 级致癌物(Baan R, et al. Carcinogenicity of alcoholic beverages. The Lancet Oncology,2007,8(4) :292-293 ；E.Dybing, et al. Risk assessment of dietary exposures to compounds that are genotoxic and carcinogenic—an overview. Toxicology letters，2008，180 :110-117)。氨基甲酸乙酯曾作为医药和兽药使用，后因有毒且疗效欠佳而被禁止用于人类医药领域。氨基甲酸乙酯是食品发酵和贮藏过程中的天然产生物，广泛存在于饮品酒类(葡萄酒、黄酒等)、酸乳酪、酱油等发酵制品中，不同的发酵食品中氨基甲酸乙酯含量不一，一般低于650 μ g/kg(Dirk ff. et al. The composition of unrecorded alcohol from eastern Ukraine Is there a toxicological concern beyond ethanol alone . Food and chemical toxicology, 2010,48 :2842-2827 ;石维妮，等.发酵性食品中的氨基甲酸乙酯含量调研.中国酿造，2009，11 :124-126)。其中，酒精饮品是膳食摄入氨基甲酸乙酯的主要来源，其次为谷物类和豆类发酵食品，因此，长期饮酒的消费者是氨基甲酸乙酯受害的高危人群(EFSA. Opinion of the Scientific Panel on Contaminants in the Food chain on a request from the European Commission on ethyl carbamate and hydrocyanic acid in food and beverages.The EFSA Journal 2007,551 :1-44)。现阶段，各类食品中并无统一的氨基甲酸乙酯限量标准，但部分国家已制订出酒精饮品中氨基甲酸乙酯的最高限量，如加拿大对多种酒精饮品的氨基甲酸乙酯限量从 30-400 μ g/L不等；欧盟部分成员国也制订了相应标准；韩国于2008年颁布葡萄酒中氨基甲酸乙酯限量标准为 30 μ g/L (World Trade Organization Committee on Sanitary and Phytosanitary Measures G/SPS/N/K0R/272. 6 February 2008 ；The Korean Food and Drug Administration Advance Notice No. 2008-25 (31 January 2008))。根据氨基甲酸乙酯的形成机理，针对性地形成了一些相应的控制方法，对降低食品中的氨基甲酸乙酯含量具有一定的作用。(I)发酵原料中尿素的控制通过对发酵大米的精制或多次清洗，可以有效地降低原料中50%以上的尿素，但该方法会导致原料营养价值降低，影响发酵产品的质量。(2)工艺控制发酵过程中的温度、PH等工艺条件均对氨基甲酸乙酯的形成有较为显著的影响，可以通过控制相关工艺参数降低产品中氨基甲酸乙酯的含量。但由于发酵食品的风味受发酵工艺条件影响较大，该方法在实际应用时的可行性较低。(3)高性能菌株选育利用诱变和基因工程手段，获得精氨酸酶缺陷型或表达受阻的酵母突变菌株(Heui-dong Park, et al. Antisense-mediated inhibition ofarginase(CARl) gene expression in Saccharomyces cerevisiae. J. Biosci. Bioengin., 2001,92(5) :481-484)，或通过对葡萄酒酿造中苹果酸-乳酸发酵阶段酒类酒球菌的选育， 获得精氨酸转化能力受阻的突变菌株(王华，等.不同酒类酒球菌苹果酸-乳酸发酵对葡萄酒中氨基酸的影响.中国食品学报，2003，3 (4) :51-55)，均能有效地降低产品中氨基甲酸乙酯的含量。高性能基因工程菌株选育曾经也被认为是控制发酵制品中氨基甲酸乙酯形成的最好方法，但由于食品安全和生物安全性原因，基因工程菌株在食品生产过程的应用受到非常严格的规定，尤其是欧盟区的严格法律规定导致该方法在最近几年均未有新的进展。(4)脲酶对尿素的分解脲酶可以将尿素分解为氨和CO2，在生产过程中利用脲酶控制成品酒中氨基甲酸乙酯含量是最为常用方法。国际葡萄酒组织、欧盟、美国FDA等均允许脲酶作为食品添加剂使用，因此在脲酶的生产菌株选育、发酵工艺优化、生产应用等方面都有较多研究(Marco Esti, et al. Modeling of urea degradation in white and rose wines by acid urease. J. Agric. Food Chem. , 2007, 55 :2590-2596)。我国出口黄酒均米用该方法控制氨基甲酸乙酯的含量。黄酒生产以大米为原料，成分复杂。酿造过程包括原料经蒸煮、冷淋、发酵、过滤得到黄酒原酒，黄酒原酒再经冷藏、去沉淀、勾兑、罐装灭菌等环节得到黄酒成品，整个过程步骤较多，周期较长，因此，黄酒中的氨基甲酸乙酯形成途径较多。利用不同方法控制黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯前体物质的产生，可以在一定程度上降低产品中氨基甲酸乙酯的含量，但不可能将多种不同控制方法同时应用于同一批次的黄酒生产中，因此产品中氨基甲酸乙酯含量通常较高。而采用单一的源头控制方法只能部分降低体系中氨基甲酸乙酯的含量，很难有效降低甚至完全清除产品中的氨基甲酸乙酯。
本发明提供了一种产氨基甲酸乙酯脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株，用于制备可快速、高效降解黄酒中氨基甲酸乙酯的氨基甲酸乙酯脱氨酶。一种产氨基甲酸乙酯脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株，命名为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)ZJ09，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2012年2月10日，保藏编号为CCTCC M 2012012。该菌株为从土壤中分离、筛选得到的，经鉴定为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌ZJ09的生理生化特性为能分解淀粉，可以利用柠檬酸钠为碳源， 可以利用硝酸钠为能源；利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露糖发酵产酸；能水解酪朊和明胶；接触酶反应和V-P反应阳性。细胞直杆状，革兰氏染色阳性，芽孢椭圆；平板培养基上菌落略皱缩。本发明提供了一种利用上述枯草芽孢杆菌菌株制备氨基甲酸乙酯脱氨酶的方法， 包括将经活化的枯草芽孢杆菌ZJ09接种到含氨基甲酸乙酯的液体培养基中进行发酵培养；发酵完成后，从发酵液中分离纯化得到氨基甲酸乙酯脱氨酶。所述的氨基甲酸乙酯在液体培养基中的质量百分比浓度优选为0. 5-1. 5% ;更优选为1.0%。采用不添加氨基甲酸乙酯的培养基进行菌株发酵，检测不到氨基甲酸乙酯脱氨酶的产生。在液体培养基中添加适量的氨基甲酸乙酯能诱导菌株代谢生成氨基甲酸乙酯脱4氨酶，实验发现，当氨基甲酸乙酯浓度为O. 5-1. 5%时，单位体积发酵液中氨基甲酸乙酯脱氨酶的酶活较高；特别地，当浓度为I. 0%时酶活最高。但过高浓度的氨基甲酸乙酯会引起发酵液体系PH值上升，影响菌体生长，使氨基甲酸乙酯脱氨酶的产生受到影响。以体积IL计，所述的液体培养基由以下组分组成葡萄糖14_16g，酵母膏5_6g，蛋白胨7-8g，玉米浆7-9g，磷酸二氢钾l_2g，硫酸镁O. 6-1. Og,氨基甲酸乙酯5_15g，余量为水。该配方组分的液体培养基能为枯草芽孢杆菌ZJ09提供菌体生长和氨基甲酸乙酯脱氨酶产生所需要的营养成分，其中葡萄糖是主要的碳源；酵母膏和蛋白胨提供氮源，并含有一定量的生长因子；玉米浆含有丰富的维生素和生长因子；磷酸二氢钾和硫酸镁提供菌体生长所需的磷、硫、钾和镁等元素。所述的发酵培养温度优选为36_38°C，利于菌体生长。所述的发酵培养时间优选为45_50h，单位体积发酵液中氨基甲酸乙酯脱氨酶的酶活最高。根据枯草芽孢杆菌ZJ09的生长曲线，发酵培养到36-40h时，菌体含量达到最高; 再经9-10h，发酵液中氨基甲酸乙酯脱氨酶产量达到最高。所述的分离纯化为对发酵液依次进行盐析、离子交换层析和膜浓缩处理，再经冷冻干燥，制得冻干粉。依序进行多步分离纯化，能得到纯度较高的氨基甲酸乙酯脱氨酶，且在操作过程中氨基甲酸乙酯脱氨酶损失较少，活性保持较好；同时，将氨基甲酸乙酯脱氨酶制成冻干粉，不但能延长甲酸乙酯脱氨酶的保质期，而且也便于在使用时定量控制其用量。本发明还提供了一种采用上述方法制得的氨基甲酸乙酯脱氨酶，该酶酶活较高， 能降解黄酒中的氨基甲酸乙酯。本发明还提供了上述氨基甲酸乙酯脱氨酶在降解黄酒中氨基甲酸乙酯中的应用， 包括(I)取经冷藏的黄酒原酒；(2)将氨基甲酸乙酯脱氨酶加入黄酒原酒中，进行酶解反应；(3)去除沉淀。在冷藏后的黄酒原酒中，含有大量的氨基甲酸乙酯，此时加入氨基甲酸乙酯脱氨酶对其进行酶解处理，不需要新增其他设备，操作工艺简单。经过酶解反应，可以降解黄酒中的氨基甲酸乙酯；且处理结束后可继续原有的生产工艺过程，即去沉淀、勾兑、罐装灭菌等，去沉淀时可同时除去酶解过程中产生的部分不溶物，不会影响黄酒产品的风味，同时产品中氨基甲酸乙酯的清除率可达95%以上。优选地，所述的酶解反应温度为18_25°C，酶解反应时间为ll_13h ;更优选地，所述的酶解反应温度为25°C，酶解反应时间为12h。根据黄酒原有生产工艺，冷藏结束后，室温放置不能超过24h，否则会影响原有生产方案的运行和产品质量；该酶解条件下，最有利于对黄酒中氨基甲酸乙酯的充分酶解，且符合实际生产的需要。所述氨基甲酸乙酯脱氨酶的加入量优选为O. 05-0. 15kg/l吨黄酒原酒；更优选为 O. lkg/Ι吨黄酒原酒。该加量条件下既能保证其与黄酒酿造过程中产生的氨基甲酸乙酯充分反应，又不会浪费氨基甲酸乙酯脱氨酶。本发明的枯草芽孢杆菌ZJ09在合适的培养条件下可代谢生成氨基甲酸乙酯脱氨酶，以该酶在黄酒冷藏处理后加入黄酒原酒中，能直接酶解黄酒酿造过程中产生的总氨基甲酸乙酯，实现快速、高效地降低黄酒产品中氨基甲酸乙酯的含量。试验证明，采用本发明方法制得的黄酒产品，其氨基甲酸乙酯的含量低于30yg/L，显著提高了黄酒产品的安全性。本发明方法操作方便，不受氨基甲酸乙酯形成途径的限制，处理方式简单易行。本发明公开了一种产氨基甲酸乙酯脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZJ09，保藏号为CCTCC M 2012012。其在合适的培养条件下可代谢生成氨基甲酸乙酯脱氨酶，以该酶在黄酒冷藏处理后加入黄酒原酒中，能直接酶解黄酒酿造过程中产生的总氨基甲酸乙酯，从而实现快速、高效地降低黄酒产品中氨基甲酸乙酯的含量，显著提高了黄酒产品的安全性。本发明方法操作方便，不受氨基甲酸乙酯形成途径的限制，处理方式简单易行。