降低弯曲菌属感染的疫苗和方法

B·哈吉斯, N·R·帕佛德, Y·M·权, S·莱顿

2013年3月13日

2011年6月9日

2010年6月9日

阿肯色大学评议会

A61K39/02GK102971008SQ201180028098

弯曲 疫苗 感染 降低

1.一种包含编码 SEQ ID NO7 (cjaD ;cj0113)、SEQ ID NO8 (cjaA ;cj0982)或 SEQID NO9 (ACE 393 ;cj0420)的抗原多肽或其片段的第一多核苷酸序列的载体，所述第一多核苷酸序列与该载体非固有相关2.根据权利要求I所述的载体，其进一步包括编码与该载体非固有相关的免疫刺激多肽的第二多核苷酸序列3.一种包含第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列的载体，所述第一多核苷酸序列编码与该载体非固有相关的抗原多肽，所述第二多核苷酸序列编码免疫刺激多肽，其中抗原多肽是 SEQ ID N01 (cjaD ;cj0113)、SEQ ID NO2 (cjaAcj0982)或 SEQ ID N03 (ACE393 ；cj0420)的片段4.根据权利要求1-3任一项所述的载体，其中所述载体是细菌5.根据权利要求4所述的载体，其中所述的细菌是选自沙门氏菌属、埃希氏菌属、芽孢 杆菌属或乳杆菌属的属6.根据权利要求4所述的载体,其中所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列被整合至细菌的基因组7.根据权利要求2-6任一项所述的载体，其中所述载体包括一个以上的第一多核苷酸序列的拷贝、一个以上第二多核苷酸序列的拷贝或一个以上第一和第二多核苷酸序列的拷贝8.根据权利要求2-7任一项所述的载体，其中所述第一多核苷酸序列在框架中被连接至第二多核苷酸序列9.根据权利要求2-8任一项所述的载体，其中所述抗原多肽和免疫刺激多肽在载体表面表达10.根据权利要求9所述的载体，其中所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列被插入在编码跨膜蛋白外部部分的第三多核苷酸序列中11.根据权利要求2-10任一项所述的载体，其中所述免疫刺激多肽是CD154多肽或HMGBl多肽12.根据权利要求11所述的载体，其中所述CD154多肽能够结合CD40，CD154多肽具有少于50个的氨基酸，且含有SEQ ID NO 13的氨基酸140-149或其同源物13.根据权利要求12所述的载体，其中所述⑶154多肽含有选自SEQID NO 15-19的多肽14.根据权利要求11所述的载体，其中所述HMGBl多肽包含选自SEQIDNO 20-28的至少一个或SEQ ID NO 20-28的至少一个的片段的多肽15.根据权利要求1-14任一项所述的载体,其中所述第一多核苷酸序列是SEQIDNO 7或其片段16.根据权利要求1-15任一项所述的载体，其中所述第一多核苷酸序列是SEQIDNO8, SEQ ID NO9, SEQ ID N08 的片段、SEQ ID NO9 的片段，或其组合17.根据权利要求1-16任一项所述的载体，其中向受试者施用载体能够激发抗体反应18.根据权利要求17所述的载体，其中所述抗体反应是IgA反应19.根据权利要求1-18任一项所述的载体，其中所述载体能够保护接种的受试者免受随后的弯曲菌属的感染20.一种药物组合物，其包括权利要求1-19任一项所述的载体和药学上可接受的载体21.一种增强受试者中免疫反应的方法，其包括以增强受试者免疫反应的有效量向受试者施用权利要求1-19任一项所述的载体22.根据权利要求21所述的方法，其中所述免疫反应包括增强的抗体反应23.根据权利要求22所述的方法，其中所述可溶IgA抗体反应被增强24.根据权利要求23所述的方法，其中相对于施用对照载体的受试者的IgA反应，载体施用后的IgA反应增加了至少3倍25.根据权利要求21-23任一项所述的方法，其进一步包括用弯曲菌属攻击受试者，其中与施用对照载体的受试者相比，攻击后，在施用载体的受试者中，弯曲菌属在受试者中的生长降低了 21ogs26.一种增强受试者中对弯曲菌属感染的抗性的方法，其包括在随后的暴露于弯曲菌属后，以增强对弯曲菌属感染的抗性的有效量向受试者施用权利要求1-19任一项所述的载体27.根据权利要求21-26任一项所述的方法，其中所述载体是减毒的28.根据权利要求27所述的方法，其中在施用前灭活载体29.根据权利要求26-28任一项所述的方法，其中通过增加的抗体产生增强抗性30.根据权利要求29所述的方法，其中增加的抗体反应包括增加的IgA反应31.根据权利要求26-30任一项所述的方法，其中增加的抗性的特征在于随后的用弯曲菌属的感染导致了与对照相比降低的弯曲菌属生长32.根据权利要求31所述的方法，其中与对照载体施用后的弯曲菌属生长相比，弯曲菌属的生长降低至少21ogs

用于产生对抗多种制剂的黏膜免疫的安全和成本有效的疫苗的库是很有限的引起世界范围的人胃肠道疾病的主要细菌是弯曲菌属(Campylobacter)对于可预知的将来，细菌性胃肠炎持续构成美国和国外一般公众的重要威胁发生空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)感染比更加众所周知的来自沙门氏菌属(Salmonella)物种或大肠杆菌(Escherichia coli)0157 H7的感染更频繁全国范围的弯曲菌属胃肠炎疾病的实际负担是每年500-850例感染/100，000人

激发对弯曲菌属多种血清型的黏膜的、体液的和细胞介导的免疫反应的疫苗载体为限制弯曲菌属胃肠炎提供了有前景的方法通过插入编码非固有线性表位(抗原多肽)的多核苷酸序列，本项目利用一种新方法开发疫苗抗原多肽可以在疫苗载体中与免疫刺激多肽，如⑶154 (⑶40L)或HMGBl (高迁移率族蛋白I)组合使用适当地未发现抗原多肽和免疫刺激多肽是与载体固有相关的多肽表位或抗原多肽和免疫刺激多肽可以在重组载体表面上表达载体可以是细菌、病毒或甚至是脂质体载体在施用之前，载体可以是活的、活的且减毒的或灭活的如在实施例中所显示的，实质上的初步数据表明表达外源表位的沙门氏菌属或芽孢杆菌属(Bacillus)构建体能够快速在体内诱导高滴度的表位特异的抗体而且，表面⑶154或HMGBl的共表达有效地增强了对外源表位的抗体反应重组DNA技术使得能够相对简单的操作许多细菌和病毒物种一些细菌和病毒是温和的或非致病的，但其能够产生强的免疫反应这些细菌和病毒成为用于激发对异源的、非固有的或外源的抗原的免疫反应的有吸引力的疫苗载体细菌或病毒载体可以模仿自然感染，并产生强的持久的免疫疫苗载体通常相对便宜地生产和施用另外，这种载体通常携带一种以上抗原，并可以提供对多种传染性剂的保护编码来自任何数目的病原性生物体的多肽抗原的多核苷酸可以被插入至疫苗载体，并表达产生抗原多肽抗原多肽是能够被获得性(adaptive)免疫系统特异识别的多肽抗原多肽包括免疫原性的任何多肽抗原多肽包括但不限于病原体相关的、变应原相关的、肿瘤相关的或疾病相关的抗原病原体包括病毒、寄生虫、真菌和细菌病原体以及蛋白质病原体，例如朊病毒抗原多肽可以是全长蛋白质或其部分已经非常明确许多蛋白质的免疫系统识别是基于相对少的氨基酸数目，通常称为表位表位可以仅为8-10个氨基酸因而，此处描述的抗原多肽可以是全长蛋白质、8个氨基酸长的表位、或这两种极端间的任何部分事实上，抗原多肽可以包括来自单一病原体或蛋白质的一个以上的表位适当地，抗原多肽是与载体非固有相关的多肽非固有相关包括也可以固有地存在于载体中的抗原多肽，但其作为表位被重组地表达，作为融合蛋白质与不同的多肽组合表达，从而与固有地表达的多肽相比，允许免疫反应的差异展示和差异增强相同表位的多个拷贝或来自不同蛋白质的多个表位可以包含于疫苗载体中可以想到来自相同或不同病原体或疾病的几个表位或抗原组合在单一疫苗载体中施用，以产生对多个抗原的增强的免疫反应重组疫苗载体可以编码来自多种病原性微生物、病毒或肿瘤相关抗原的抗原施用能够表达多种抗原的疫苗载体具有同时诱导对两种或多种疾病的免疫的优点多核苷酸可以被插入疫苗载体的染色体或在质粒或其它外染色体DNA上编码编码表位的多核苷酸可以被独立地表达(即，在载体中被可操纵地连接至功能的启动子)或可以被插入在载体中表达的疫苗载体多核苷酸中(即，固有的多核苷酸或非固有的多核苷酸)适当地，疫苗载体多核苷酸编码在疫苗载体的表面上表达的多肽，如跨膜蛋白质编码抗原多肽的多核苷酸可以在框架中被插入到疫苗载体多核苷酸序列，以允许抗原多肽表达在载体表面上例如，编码抗原多肽的多核苷酸可以在框架中被插入到细菌多核苷酸中编码跨膜蛋白质的外环区的区域中，从而载体多核苷酸序列保留在框架中参见下面的实 施例，其中抗原多肽被插入到肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)载体的IamB基因的外环可替代地，编码抗原多肽的多核苷酸可以被插入分泌的多肽中本领域技术人员将理解编码抗原多肽的多核苷酸能够被插入到多种疫苗载体多核苷酸，以提供抗原多肽的表达和向用疫苗载体治疗的受试者免疫细胞的递呈在实施例中，几个弯曲菌属多核苷酸被插入到肠炎沙门氏菌IamB编码序列中得到的重组细菌在细菌表面表达插入的抗原多肽多核苷酸可以被插入枯草芽孢杆菌的CotB中，从而重组细菌在孢子或sip中表达插入的抗原多肽用于营养细菌中的表面表达载体可包括编码全长弯曲菌属蛋白质(包括cjaD (SEQ ID NO I), cjaA (SEQIDN02)和ACE393 (SEQ ID NO3)或这些蛋白质的抗原多肽的多核苷酸在实施例中，源自全长蛋白质的抗原多肽如下使用SEQ ID NO7 (一种称为cj0113的cjaD多肽)；SEQ IDNO8 (—种称为 cj0982 的 cjaA 多肽)和 SEQ ID NO9 (—种称为 cj0420 的 ACE 393 多肽)用于实施例的多核苷酸分别提供为SEQ IDNO 4-6用于实施例中的多核苷酸具有由丝氨酸接头(linker)分离，并连接至⑶154氨基酸140-149的SEQ ID NO 7-9的抗原多肽(在抗原多肽和免疫刺激多肽之前、后和之间的三个氨基酸)适当地，插入到疫苗载体的抗原多肽的部分是免疫原性或抗原性的免疫原性片段是能够激发细胞或体液免疫反应的肽或多肽适当地，抗原多肽可以是全长蛋白质、或适当地，可以是全长序列的20个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、8个或更多个氨基酸适当地，对目标病原体产生的免疫反应是保护性的免疫反应保护性的免疫反应是这样的反应，其能够阻止或降低随后的目标病原体(即弯曲菌属)感染引起的发病率或死亡率本领域技术人员将理解任何这些多核苷酸序列可以与任何其它抗原多肽(包括来自其它异源病原体或生物体)的多肽组合使用，也可以与编码免疫刺激多肽的多核苷酸联合使用，例如，如国际申请号PCT/US07/078785和PCT/US2011/022062中描述的CD154或HMGBl多肽，这些申请的全文在此引入作为参考也可以将编码对受试者蛋白质是同源的且能够刺激免疫系统对外源表位反应的免疫刺激多肽的多核苷酸插入载体如下面详述，载体可以包括CD154多肽，该多肽能够在受试者中结合CD40，并刺激受试者对载体及其相关的外源抗原多肽反应另外，载体可以包括HMGBl多肽或其功能片段关于抗原多肽如上所述，编码这些多肽的多核苷酸可以被插入到载体的染色体或保留在染色体外本领域技术人员将理解这些多核苷酸能够被插入到多种载体多核苷酸中用于在载体不同部分中表达或用于多肽的分泌编码能够增强对非固有抗原多肽的免疫反应的免疫刺激多肽的多核苷酸也可以编码抗原多肽编码免疫刺激多肽的多核苷酸可以被连接至编码抗原多肽的多核苷酸，从而在疫苗载体中免疫刺激多肽和外源抗原多肽呈现在同一多核苷酸上例如，抗原多肽和免疫刺激多肽可以是融合蛋白质的部分在实施例中，编码能够结合CD40的CD154多肽的多核苷酸也编码来自弯曲菌属cjaD、cjaA或ACE 393的抗原多肽参见所附序列表中潜在多肽序列的一些实例SEQ ID NO 10-12，和编码抗原多肽、免疫刺激多肽和宿主多肽间任选的丝氨酸接头的多核苷酸序列SEQ ID N04-6·在实施例中，编码弯曲菌属抗原多肽的多核苷酸和编码免疫刺激多肽的多核苷酸均被插入跨膜IamB基因的外环本领域技术人员将理解也可以使用编码其它跨膜蛋白质的载体多核苷酸另外，抗原多核苷酸可以是染色体外的或由载体分泌的在实施例中，编码弯曲菌属cj0113抗原(SEQ ID NO7)和免疫刺激肽HMGBl (SEQ ID N020)的多核苷酸从芽孢杆菌属(Bacillus)载体携带的质粒表达，且在细胞表面表达适当地，⑶154多肽长度少于50个氨基酸、更适当地，少于40个、少于30个或少于20个氨基酸长多肽长度可以在10至15个氨基酸之间、10至20个氨基酸之间或10至25个氨基酸之间⑶154序列和⑶40结合区在多个物种间不是高度保守的鸡和人的⑶154序列分别提供在SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14中已经确认了许多物种(包括人、鸡、鸭、小鼠和牛)的⑶154的⑶40结合区，其分别表示于 SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 和 SEQ ID NO 19 中尽管在物种间CD40结合区的序列中存在变异，已经报道了 CD154与CD40的交叉结合例如，人CD154多肽能够增强鸡中的免疫反应因此，可以使用物种特异的CD154多肽或异源CD 154多肽实现本发明HMGBl (高迁移率族蛋白I)蛋白质首先被鉴别为对DNA结构和稳定性重要的DNA结合蛋白质其为广泛表达的核蛋白，无序列特异性地与DNA结合该蛋白高度保守并发现于植物至哺乳动物中斑马鱼、鸡和人HMGBl氨基酸序列分别提供于SEQ ID NO 28,SEQID N020和SEQ ID N027中遍及哺乳动物的该序列高度保守，具有98%的氨基酸同一性，且氨基酸变化是保守的因此，来自一个物种的HMGBl蛋白可能功能性地取代来自另一物种的HMGBl蛋白全长的HMGBl蛋白或其部分可用作此处描述的疫苗载体中的HMGBl多肽HMGBl具有两个DNA结合区，称为如SEQ ID NO 21和22所示的A盒和如SEQID NO 23和 24 所不的 B 盒参见 Andersson 和 Tracey, Annu. Rev. Tmmunol. 2011, 29139-162,其全文并入此处作为参考HMGBl是炎症的调节子，并作为核损伤(如来自坏死细胞的)的信号HMGBl还可能在需要蛋白乙酰化、跨核的移位和分泌的过程中，由单核/巨噬细胞系的细胞活性分泌通过经由晚期糖基化终产物受体(RAGE)和经由Toll样受体家族(TLR)成员(特别是TLR4)的信号传导，细胞外HMGBl作为强效的炎症调节子发挥作用已经鉴别了 RAGE结合活性，其需要SEQ ID NO25的多肽TLR4结合需要SEQ ID NO20的106位的半胱氨酸，其被发现在HMGBl的B盒区域HMGBl的炎症活性不需要全长蛋白，已经鉴定了功能性片段已表明B盒足以介导HMGBl的促炎症作用，因而，在本发明的上下文中SEQ ID NO 23和24是HMGBl多肽或其功能片段另外，RAGE结合位点和促炎症细胞因子活性分别被绘图于在SEQ ID N025和SEQID N026因此，在本发明的上下文中这些多肽是HMGBl多肽的功能片段使用如国际申请NO.W002092004中的那些方法，本领域技术人员能够鉴定能够刺激促炎症细胞因子活性的HMGBl多肽及其片段，该国际申请全文并如此处作为参考适当地，HMGBl多肽在SEQ ID NO 20(SEQ ID NO 25或其同源物)的氨基酸150-183包括RAGE结合结构域，在SEQ ID NO20 (SEQ ID NO26或其同源物)的氨基酸89-109之间包括促炎症细胞因子活性结构域特别地，HMGBl多肽及其功能片段或同源物包括与SEQ ID NO20-28 的HMGBl多肽至少99%同一性、至少98%同一性、至少95%同一性、至少90%同一性、至少85%同一性、或至少80%同一性的多肽本领域技术人员将理解HMGBl多肽可被用于增强对存在于载体中的一种以上的抗原多肽的免疫反应来自HMGBl的多肽至少部分通过激活树突细胞和巨噬细胞，从而刺激产生IL-l、IL-6、IFN-Y和TNF-α，来刺激免疫反应适当地，HMGBl可以在载体表面表达至少部分抗原多肽和至少部分HMGBl多肽或其它免疫刺激多肽可出现在疫苗载体的表面出现在疫苗载体的表面包括这样的多肽，其包含于跨膜蛋白中、与跨膜蛋白、膜脂质或膜瞄定的碳水化合物相互作用、共价地或化学地交联通过具有含有由连接至N端、C端或跨膜蛋白中的任何部位的肽键的多肽的氨基酸(即，在跨膜蛋白的两个氨基酸之间插入或代替跨膜蛋白的一个或多个氨基酸(即，缺失-插入))，多肽可包含于跨膜蛋白质中适当地，多肽可以被插入到跨膜蛋白的外环适当的跨膜蛋白是cotB和IamB,但本领域技术人员将理解许多合适的跨膜蛋白是可用的作为替代，通过本领域技术人员可获得的方法，多肽可共价地或化学地连接至膜中的蛋白、脂质或碳水化合物，或衣壳(如果使用病毒载体的话)例如，二硫键或生物素-抗生物素蛋白交联可被用来将抗原和HMGBl多肽呈现在疫苗载体的表面适当地，抗原多肽和HMGBl多肽是融合蛋白的部分两种多肽可以通过肽键直接连接，或被接头或其中插入的第三蛋白区段所分开在实施例中，一些载体具有编码在同一多核苷酸(IamB)上的弯曲菌属抗原多肽(cj0113、cj0420和cj0982)和免疫刺激多肽(CD154氨基酸140-149或HMGBl或其功能片段)，从而其序列彼此在框架内，并与其所插入的沙门氏菌属多核苷酸在框架内在一些实施方案中，接头可以被加到编码抗原多肽和免疫刺激多肽的多核苷酸序列之间，从而在表达的多肽中几个氨基酸分开两个多肽接头可以是编码单个氨基酸的3个核苷酸，或者可以更长，如编码10个的30个核苷酸，或编码更多氨基酸在实施例中，使用9个核苷酸的接头，其编码3个丝氨酸本领域技术人员容易想到可以使用许多其它类型的接头另外，多核苷酸可以在一个拷贝或多个拷贝中存在例如，可以在跨膜蛋白的相同外环中发现抗原多肽的三个拷贝和免疫刺激多肽的三个拷贝，或者其可以表达在几个不同的载体蛋白中在可替换的实施方案中，免疫刺激多肽和抗原多肽可由不同的多核苷酸编码用于方法中的潜在疫苗载体包括但不限于芽孢杆菌属、沙门氏菌属(肠炎沙门氏菌)、志贺氏菌属(Shigella)、埃希氏菌属(E. coli)、耶尔森菌属(Yersinia)、博德特菌属(Bordetella)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)(霍乱弧菌(Vibrio cholerae))、李斯特氏菌属(Listeria)、腺病毒、痘病毒、疱疫病毒、甲病毒和腺相关病毒适当地，疫苗载体是GRAS生物体疫苗载体可以是失活的或灭活的，从而其不能复制失活或灭活细菌或病毒疫苗载体的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于例如，福尔马林失活、基于抗生素的失活、热处理或乙醇处理的方法在一些实施方案中，疫苗载体可以是基于脂质体的载体本发明提供了包含载体和药学上可接受的载体(carrier)的组合物药学上可接受的载体是任何适合于体内施用的载体药学上可接受的载体可以包括水、缓冲溶液、葡萄糖溶液或细菌培养液组合物的额外成分可适当地包括赋形剂，例如稳定剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂和润滑剂药学上可接受的载体或稀释剂的例子包括例如碳水化合物(如山梨·醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)的稳定剂、例如白蛋白或酪蛋白的蛋白质、例如牛血清或脱脂乳的含蛋白制剂、和缓冲液(如，磷酸盐缓冲液)特别地，当向组合物添加这样的稳定剂时，组合物适合于冷冻干燥或喷雾干燥还提供了通过施用此处所述的载体增强受试者中对弯曲菌属的免疫反应的方法该载体可以包括能够刺激对上述载体和抗原多肽免疫反应的HMGBl多肽或CD154多肽以增强受试者对非固有抗原多肽的免疫反应的有效量向受试者施用载体适当地，增强了对弯曲菌属攻击的免疫反应增强免疫反应包括但不局限于增强抗体反应与对照相比，载体施用后适当地增强了 IgA反应，更适当地增强了分泌的IgA反应对照可以是载体施用前的同一受试者、仅施用载体的可比较的受试者、或施用表达不相关的或非弯曲菌属抗原多肽的载体的可比较的受试者抗体反应，适当地IgA反应，与对照受试者的反应比较，可被增加2倍、3倍、4倍、5倍或更多增强的免疫反应也可以导致在施用此处所述的载体后弯曲菌属生长或复制、在受试者中形成克隆的能力降低可通过用弯曲菌属感染攻击施用载体的受试者，并与对照受试者相比，监测细菌形成克隆和复制(即，感染受试者)的能力来测试所述降低弯曲菌属在受试者中的生长可降低llog、21ogs、31ogs、41ogs、51ogs或甚至更多弯曲菌属在施用载体的受试者中的生长可以在检测限以下另外，公开了增强对弯曲菌属感染抗性的方法简言之，该方法包括以激发免疫反应的有效量向受试者施用上述包含弯曲菌属抗原多肽的载体增强对弯曲菌属感染的抗性包括但不限于降低弯曲菌属感染的发病率(incidence)、限制弯曲菌属感染从一个宿主向其它宿主的传播、降低弯曲菌属在受试者中的复制、在同一宿主的侵入或传播、降低弯曲菌属感染相关的发病率、以及降低弯曲菌属感染的持续时间载体的施用可以防止受试者感染上弯曲菌属或防止出现任何疾病的外在体征，例如胃肠炎或GBS增强的弯曲菌属抗性还可以包括增加的抗体产生、适当地IgA的产生抗体反应，适当地，IgA的反应，与对照受试者的反应相比，可以增加2倍、3倍、4倍、5倍或更多增强的免疫反应也可以导致在施用此处所述载体后弯曲菌属在受试者中的生长、复制和形成克隆能力降低可通过用弯曲菌属感染攻击施用载体的受试者，与对照受试者相比并监测细菌形成克隆和复制(即，感染)受试者的能力来测试这种降低弯曲菌属在受试者中的生长可降低llog、21ogs、31ogs、41ogs、51ogs或更多弯曲菌属在施用载体的受试者中的生长可以在检测限以下