专利名称：一种交叉保护性dna疫苗的制作方法獲弧菌(Vibrioanguillarum)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)分别为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，二者皆为重要的养殖鱼类病原菌，其宿主范围涵盖多种海水和淡水鱼类，包括牙鲆、大菱鲆、罗非鱼、美国红鱼等。在我国，由鳗弧菌和海豚链球菌引起的疫病暴发流行给多种养殖鱼类产业造成了严重的经济损失。除了鱼类外，鳗弧菌和海豚链球菌皆为动物感染性病原，能够感染人类和其它陆生动物。目前，分别针对鳗弧菌和海豚链球菌的单一性DNA疫苗在国际上已有报道，但是尚无能够同时针对这两种病原的交叉保护性DNA疫苗。
本发明目的在于提供一种细菌传递的交叉保护疫苗。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种交叉保护性DNA疫苗为真核重组表达质粒PIS0。所述重组质粒pISO，将质粒pBSOU和质粒pISilO分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化大肠杆菌DH5，得质粒piS0。交叉保护性DNA疫苗的制备方法，所述重组质粒pISO，将质粒pBSOU和质粒PlSilO分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化大肠杆菌DH5，得质粒PlSO0所述质粒pISilO，以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体PBS-T连接，连接液转化入大肠杆菌DH5，得质粒pISilO ；所述质粒pBSOU，以鳗弧菌VA68为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体PBS-T连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，得质粒pBSOU。具体为I)质粒PlSilO的构建以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接4-6小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB培养基上培养18-24小时，得质粒pBSSlO ；将质粒pBSSlO和质粒pID2分别用SmaI和EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含安卡青霉素的LB固体培养基上培养24小时，即为质粒pISi 10 ； 2) DNA疫苗pISO的构建以鳗弧菌VA68为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接4-6小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)的LB培养基上培养18-24小时，得质粒pBSOU ；将质粒pBSOU和质粒pISilO分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，即为DNA疫苗pISO ;所述弓丨物Fl 为 5’ -CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3’，Rl 为 5’ -CTCGAGCCCGGGGA TATGAATATAATTATATGAGCT-3’ ；所述引物为 F2 为 5’ -CCCGGGACCACCATGAACAAAACTCTGATTG-3，，R2 为 5，-CCCCGGGAGAAGTCGTAACGTAGACCT-3，。交叉保护性DNA疫苗的应用，所述DNA疫苗在制备具有预防和治疗鳗弧菌和海豚链球菌的交叉疫苗制剂中的应用。本发明具有如下优点本发明疫苗能够同时保护鱼类抵抗鳗弧菌和海豚链球菌感染，且保护效应分别高达83 %和82 %。所述LB组成成分按重量百分比计I. O %蛋白胨，O. 5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5 %蒸馏水。步骤2) DNA疫苗pISO的构建以鳗弧菌VA68为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s, 55°C 60s, 72°C 60s，5个循环后改为94°C 40s, 65°C 60s, 72°C 60s, 25个循环后再在72°C延伸反应IOmin。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。PCR产物纯化后与天根载体pBS-T于室温连接4_6小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5a后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，命名为PBS0U。将pBSOU和上述质粒pISilO用SmaI酶切，分别回收Ikb和6. 5kb片段，将二者用T4DNA连接酶于室温连接2_4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，SP为DNA疫苗pISO。所述獲弧菌VA68 购于美国 ATCC(American type culture collection),编号68554,分类名为 Vibrio anguillarum。所述弓丨物为 F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAACAAAACTCTGATTG-3’和 R2 :5’ -CCCCGGGAGAAGTCGTAACGTAGACCT-3，。实施例2DNA疫苗的应用步骤I)疫苗制备液。将上述所得DNA疫苗质粒pISO在PBS中稀释至终浓度为150 μ g/ml，即为疫苗制备液。步骤2)疫苗的接种。将100条牙鲆(每条重约11. 3g)随机分为4组，每组25条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤I)的疫苗制备液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别腹腔注射IOOul PBS。步骤3)鳗弧菌和海豚链球菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养鳗弧菌VA68和海豚链球菌G26至0D_为0. 9，然后离心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌体。将鳗弧菌菌体悬浮于PBS中至终浓度为4xl07cfu/ml，即为鳗弧菌悬液；将海豚链球菌菌体悬浮于PBS中至终浓度为lxl08cfu/ml，即为海豚链球菌悬液。步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的鳗弧菌悬液腹腔注射步骤2)的A和B组鱼，用上述步骤3)的海豚链球菌悬液腹腔注射步骤2)的C和D组鱼，每条鱼的注射量为IOOu I。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，3条；B组，18条；C组，3条；D组，17条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS = IOOx (I-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故DNA疫苗pISO针对鳗弧菌和海豚链球菌的免疫保护效率分别为83%和82%。由此得出DNA疫苗pISO对鳗弧菌和海豚链球菌具有良好的交叉免疫保护效应。
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种针对鳗弧菌和海豚链球菌的交叉保护性DNA疫苗。DNA疫苗为真核重组表达质粒pISO。制备方法所述重组质粒pISO，将质粒pBSOU和质粒pISi10分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化大肠杆菌DH5α，得质粒pISO。本发明所述DNA疫苗pISO对鳗弧菌和海豚链球菌分别有83％和82％的免疫保护效率。