一种蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉的制备方法(-)[0002]类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病。主要临床表现为对称性、持续性关节肿胀和疼痛，常伴有晨僵，受累关节以近端指间关节，掌指关节，腕、肘和足趾关节最为多见，部分患者可出现发热、贫血、皮下结节及淋巴结肿大等关节外表现。该病好发于中年女性，致残率较高，发病I年内致残率可高达20%，10年内可达60%左右。在中国，RA患病率为0.3-0.6%，而在发达国家成人中的发病率高达0.5%-1%。现代医学对于RA的药物治疗主要包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、病情改善抗风湿药(DMARDs)、糖皮质激素以及生物制剂，但效果个体差异明显，毒副作用较大，这是临床使用抗风湿药面临的主要问题。[0003]类风湿关节炎属中医“痹证”范畴，多由正气不足，感受风、寒、湿、热之邪所致，常呈慢性进行性过程，病程长，其证多顽固难已。清代叶天士指出:“风寒湿三气合而为痹，经年累月，外邪留著，气血俱伤，化为败瘀凝痰，混处经络，须用虫类搜剔，以动药使血无凝着，气可宣通。”蕲蛇是常用的虫类药，又名白花蛇，乃蝰科动物五步蛇的干燥体，味甘、咸，性、温。有毒，入肝脾二经，能搜风通络、攻毒定惊。善行而无处不到，外达皮肤，内通经络，且透骨搜风之力尤强，被称为截风要药，对于治疗痹证有着显著效果。现代研究发现，蕲蛇能促进垂体前叶促肾上腺皮质激素的合成与释放，使血中的这种激素浓度升高，产生抗炎、消肿镇痛作用，且无激素样的副作用。但是，蕲蛇现已被列为国家二级濒危保护动物，药材名贵，价格较高，而且来源有限，人工养殖较困难，因此，如何最大程度利用蕲蛇的药用价值，是临床使用蕲蛇急需解决的问题。[0004]本发明人认为应当利用现代先进的科学技术发掘传统药物的特效成分，制成简便易服、易推广的剂型，同时使药物更好的被人体吸收，以较少的药材发挥最大的作用，进而充分发挥其对类风湿关节炎的治疗作用。(三)
[0005]传统中药多以煎剂、散剂入药，存在药物有效成分吸收欠佳、不易保存及疗效不稳固等不足。本发明旨在克服以上不足，改进蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉的制作工艺，制成可以良好吸收、长久保存及疗效稳定的冻干粉剂型，从而确保了传统中药的有效利用和临床推广。同时，通过不同剂型的动物实验比较，证实其无毒、无副作用，且疗效较传统煎剂和散剂更优。[0006]本发明采用的技术方案是:[0007]本发明提供一种蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉的制备方法，所述方法为:将蕲蛇(优选蕲蛇饮片)干燥、粉碎，制成蕲蛇粉末，将蕲蛇粉末与水以质量比1:5~20混合，在60~100°C条件下密闭煎煮20~60分钟(优选60°C煎煮30min)，将提取液离心，取上清液冷却至0°C，然后缓慢加入固体硫酸铵至饱和度为40%~60%，4°C静置2小时，离心，收集沉淀，将沉淀加水溶解后以超纯水(优选MiliQ超纯水)为透析液进行透析，更换透析液至透过液中不含硫酸铵，取截留液，过滤，滤饼冷冻干燥，获得蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉。[0008]进一步，优选所述水均为MiliQ超纯水。
[0009]进一步，优选所述蕲蛇粉末与水的质量比为1:15~20，更优选1:20。
[0010]进一步，优选所述滤饼冷冻干燥的条件为:-50~_70°C 1:冷冻干燥24~48h，更优选_60°C冷冻干燥48h。
[0011]更进一步，本发明所述蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉的制备方法推荐按如下步骤进行:将蕲蛇干燥、粉碎至粒径为60~100目，制成蕲蛇粉末，将蕲蛇粉末与MiliQ超纯水以质量比1:20混合，在60°C密闭煎煮30min，将煎煮液在4°C、1200Xg条件下离心10min，取上清液冷却至0°C，然后缓慢加入固体硫酸铵至饱和度为60%，4°C静置2小时，离心，收集沉淀，将沉淀加MiliQ超纯水溶解后以MiliQ超纯水为透析液进行透析，更换透析液至透过液中不含硫酸铵，取截留液，用0.45 μ m滤膜过滤，滤饼在-50~_70°C冷冻干燥24~48h，获得蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉；所述透析是在截留分子量1000的透析袋中进行。
[0012]本发明首先将提取蕲蛇水溶性总蛋白，然后冻干成冻干粉；建立II型胶原诱导的关节炎大鼠模型；分别用提取的蕲蛇冻干粉高、低剂量，蕲蛇煎剂高、低剂量，蕲蛇散剂高、低剂量喂养CIA模型；采用足趾容积测量法检测CIA大鼠模型用药前后双足踝关节肿胀程度，并且进行关节炎指数评分；对大鼠足部进行X线照射，观察其组织形态的变化；通过ELISA法检测大鼠血清中IL-1 β的浓度；制作踝关节病理切片，HE染色观察其病理改变。
[0013]本发明所述蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉在制备治疗风湿性药物中的剂量推荐为1.72g/kg。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:本发明提供一种制备蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉的制备方法，该制备工艺条件简单，条件温和，所得蕲蛇冻干粉有效成分含量高，能够更好地被人体吸收，同时发挥更大的药效作用；本发明通过硫酸铵沉淀能够提取到纯度较高的可溶性粗蛋白，同时能够保持其生物活性，为后续的提纯分离加工步骤提供可靠原料，此法对比三氟乙酸/丙酮沉淀提取方案，不仅减少总蛋白损失，同时保持较高的蛋白活性。
(四)


[0015]图1为蕲蛇不同剂型对CIA大鼠关节炎指数的影响。
[0016]图2为各组大鼠踝关节X线摄片比较，A为空白组，B为模型组，C为煎剂低计量组，D为煎剂高剂量组，E为冻干粉低计量组，F为冻干粉高剂量组，G为散剂低计量组，H为散剂高剂量组。
[0017]图3为各组大鼠踝关节病理组织的HE染色照片，A为正常对照组(HE染色，20X )，B为模型组(HE染色，20 X )，C为煎剂低剂量组(HE染色，20 X )，D为煎剂高剂量组(HE染色，20 X )，E为冻干粉低剂量组(HE染色，20 X )，F为冻干粉高剂量组(HE染色，20 X )，G为散剂低剂量组(HE染色，20 X )，H为散剂高剂量组(HE染色，20 X )。
[0018]图4为不同温度下获得的蕲蛇水溶性总蛋白的电泳图，a为分子量Mark，b和c为实施例1获得的提取液，d和e为实施例2获得的提取液，f和g为实施例3获得的提取液。
[0019]图5为不同时间下获得的蕲蛇水溶性总蛋白的电泳图，a为70°C提取20分钟获得的提取液；b为70°C提取40分钟获得的提取液；c为70°C提取60分钟获得的提取液。
(五)
[0020]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0021 ] 实施例1:蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉
[0022]称取蕲蛇饮片(购自浙江中医药大学饮片厂)5g，粉碎，过100目，制成蕲蛇粉末，60°C烘干30分钟，实际重量为4.976g，置于密闭容器，加入100mLMiliQ超纯水，混匀，60°C煎煮40分钟，将提取液转移至离心管(50ml)，4°C、1200Xg离心10min，取上清即得粗蛋白；将粗蛋白冷却到0°C，逐步加入固体硫酸铵至饱和度60%，4°C静置2小时，1200Xg离心30分钟，收集沉淀，MiliQ超纯水重新溶解沉淀，装入透析袋(截留分子量1000)中，以MiliQ超纯水为透析液，4°C透析脱盐，多次更换透析液至透过液测不到硫酸铵，得蛋白提取物(SP截留液)，用0.45 μ m滤膜过滤除菌，滤饼在-60°C冻干48h，获得蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉0.198g，备用。
[0023]实施例2
[0024]将实施例1中的煎煮温度改为80°C，其他操作同实施例1，获得蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉0.207g。
[0025]实施例3
[0026]将实施例1中的煎煮温度改为100°C，其他操作同实施例1，获得蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉0.213g。
[0027]利用BCA蛋白浓度检测法，将实施例1-3煎煮结束后获得的提取液进行蛋白浓度的检测(SDS-PAGE银染)，不同温度获得提取液统一上样浓度为5mg/ml，具体为:(1)固定:室温下，10%冰醋酸固定液(冰醋酸:150ml ;双蒸水:1350ml，震荡30min左右)。(2)洗胶:把经固定的胶板置于盛有1.5L双蒸水的塑料盘中，清洗两次，每次2-4min。(3)染色:染色液(硝酸银:1.5g (0.lwt%)>37wt%甲醇2.25ml,加双蒸水至1.5L)震荡30min左右。(4)显色:显色液(碳酸钠:45g(终浓度0.03g/ml)，体积浓度37%甲醛水溶液2.25ml (终浓度0.15%)，硫代硫酸钠300 μ I (终浓度10mg/ml)，加双蒸水至1.5L)。(5)终止显色:双蒸水清洗。
[0028]使用仪器:Min1-PROTEAN? Tetra Cell凝胶电泳仪，其中b、d、f上样量为1μ l，c、e和g上样量为2μ 1，结果见图4所示。60°C提取液(b，c)在66-116KD区间有多条明显大分子蛋白条带；80°C提取液(d，e)在25kD左右的蛋白含量较高；100°C提取液(f，g)在25kD左右的蛋白含量较高，在18.4kD处条带含量增加。
[0029]结论:升高温度使蕲蛇水溶性总蛋白分解为小分子蛋白多肽。
[0030]实施例4:提取时间对蕲蛇水溶性总蛋白的影响
[0031]将实施例1煎煮温度改为70°C，煎煮时间依次为20分钟、40分钟和60分钟，获得3份提取液，将提取液分别进行蛋白浓度测定，结果见图5所示。煎煮时间对提取液中可溶性总蛋白的影响(银染，上样量2μ I):随提取时间延长，相同位置蛋白条带颜色加深，表明含量增加(40分钟对比20分钟)，提取时间继续增加，小分子条带出现，表明持续受热对蛋白的分解作用(60分钟对比40分钟)。
[0032]实施例5:蕲蛇水溶性总蛋白冻干粉对类风湿关节炎大鼠的干预效应
[0033](一)材料与方法
[0034]1.实验动物
[0035]Wistar大鼠，雌性，体重160±20g，共70只，由浙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号=SYXK (浙)2008-0115。全封闭SPF状态下隔离饲养，室温20°C，相对湿度40~60%，每日光照12h，自由摄食、饮水。
[0036]2.实验药品
[0037]蕲蛇购自浙江中医药大学中药饮片厂，干燥药材250g。
[0038]3.实验试剂
[0039]牛II型胶原购自Chondrex公司；弗氏完全佐剂、弗式不完全佐剂购自Sigma公司；大鼠白介素_1β (IL-Ιβ )ELISA试剂盒购自R&D公司；大鼠抗牛II型胶原抗体ELISA试剂盒购自Chondrex公司。
[0040]4实验仪器
[0041 ] YLS-7A足趾容积测量仪(安合盟科技发展有限公司)、多功能酶标仪(ThermoScientific公司)、小动物成像仪、病理切片、显微镜。
[0042]5.实验方法
[0043]5.1造模方法
[0044]选取SPF级健康雌性wistar大鼠70只，适应性喂养一周。参照《CurrentProtocols in Immunology》中CIA大鼠的造模方法，具体如下:牛II型胶原8ml,溶于
0.05mol/L、pH3.2冰醋酸水溶液中，造模前一天配制，4°C冰箱振荡过夜。第二天，与等体积的完全弗氏佐剂混合，用注射器法反复乳化，制成含牛II型胶原1.0mg/mL的乳化液(gp胶原乳剂)。随机选取8只作为空白对照组，余下62只大鼠均进行初次免疫，分多点于大鼠尾根部皮下注射胶原乳剂，0.2mL/只。初次免疫I周后，再次配置胶原乳剂，将完全弗氏佐剂换成不完全弗氏佐剂，其余方法同上，然后于大鼠尾根部不同点注射含有牛II型胶原1.0mg/mL的胶原乳剂进行加强免疫，0.15mL/只。初次及加强免疫时，空白对照组8只大鼠皮下注射等量的生理盐水。
[0045]5.2药物制备
[0046]蕲蛇煎剂:将43g蕲蛇饮片置于300ml蒸馏水中，100°C煎煮浓缩至100ml，得到浓度为0.43g/ml的蕲蛇水煎剂；将86g蕲蛇饮片置于300ml蒸馏水中，100°C煎煮浓缩至100ml，得到浓度为0.86g/ml的蕲蛇水煎剂。
[0047]蕲蛇散剂:将蕲蛇饮片磨成散剂，100目过筛，溶于蒸馏水，分别配制0.145g/ml和
0.29g/ml的蕲蛇混悬液。
[0048]5.3分组及给药
[0049]初次免疫后20天，56只实验大鼠关节炎指数超过6分(包括6分)，即造模成功，然后将造模成功的大鼠根据双后足肿胀程度用随机区组法分成蕲蛇煎剂低剂量组、蕲蛇煎剂高剂量组、蕲蛇散剂低剂量组、蕲蛇散剂高剂量组、蕲蛇冻干粉低剂量组、蕲蛇冻干粉高剂量组、模型组共7组，每组8只。[0050]分组后开始灌胃给药观察，灌胃剂量为2ml/只，每天I次，共给药24天。根据实验动物药物剂量换算出药物浓度:蕲蛇煎剂低剂量组0.86g/kg、蕲蛇煎剂高剂量组
1.72g/kg、蕲蛇冻干粉低剂量组0.25g/kg、蕲蛇冻干粉高剂量组0.50g/kg、蕲蛇散低剂量组0.29g/kg、蕲蛇散高剂量组0.58g/kg。空白对照组和模型组用等量蒸馏水灌胃。
[0051]6.观察指标及方法
[0052]6.1 一般情况
[0053]造模、给药前后观察大鼠体重变化、活动形态、体毛色泽、饮食变化、排泄状况等。
[0054]6.2足趾肿胀度
[0055]用足趾容积测量仪测量大鼠双后足的肿胀度，以大鼠双后足的足容积量作为足肿胀的指标。初次免疫前测量I次，之后每周测量I次。
[0056]肿胀度(％)=(造模后足容积一造模前足容积)/造模前足容积
[0057]6.3关节炎指数(Al)
[0058]初次免疫后开始观察并记录大鼠四肢关节病变程度，每7dl次。参照5级评分法评价:0分:无关节炎；1分:小趾关节轻度肿胀；2分:小趾关节和足跖肿胀；3分:踝关节以下的足爪肿胀；4分:包括踝关节在内的全部关节肿胀。累积得分6分及以上者造模成功，最高为16分。
[0059]6.4血清IL-1 β、抗牛II型胶原抗体检测
[0060]给药35天后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血,3000r/分钟离心后采集血清，分装保存。严格按照试剂盒说明书检测IL-1 β、抗牛II型胶原抗体含量。
[0061]6.5小动物成像系统
[0062]给药35天后，麻醉处死大鼠，取双侧踝关节，置于小动物成像仪上，设置好参数，X线拍摄，观察其改变。
[0063]6.6踝关节病理观察
[0064]X线拍摄后，及时将关节放入10%福尔马林中，固定一周，石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察病理变化。
[0065]6.7统计学处理
[0066]计量资料用平均数土标准差表示；多组间比较采用方差分析法，方差齐性时组间两两比较采用LSD-t法，方差不齐时采用Kruskal-wallis H检验。均采用双侧检验，P< 0.05者认为有统计意义，采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。
[0067](二)结果
[0068]1.各组大鼠治疗前后双侧足趾肿胀度检测结果
[0069]造模后，模型组与正常对照组相比，左后足肿胀度明显增加(P〈0.01);给药二周后，与模型组相比，各组均呈下降趋势，其中煎剂低剂量组、冻干粉高剂量组、散剂低、高剂量组左后足肿胀度下降具有统计学意义(P〈0.05，P<0.01);给药三周后，与模型组相比，各组左后足肿胀度继续下降，其中煎剂低、高剂量组、冻干粉高剂量组、散剂低、高剂量组下降具有明显差异(p〈0.05，P〈0.01)。(见表1)
[0070]表1蕲蛇不同剂型对CIA大鼠左后肢足肿胀度的影响G 士S，%，n=8)