专利名称：源自流感m2的修饰的肽疫苗的制作方法流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae family)并且是负链、单链RNA病毒。病毒颗粒大小为80至120nm。病毒颗粒在表层的脂双层膜(其内侧排列有基质蛋白 KMl))中具有红细胞凝集素(血凝素，HA)、神经氨酸酶(NA)和基质蛋白2(M2)。表层内分节段的负链RNA与核蛋白(NP)和RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)形成复合物(RNP)。根据内部蛋白的抗原性，流感病毒分为A、B或C型，其中A型和B型可导致人中流感的流行。A型可导致具有强致病性的流感大流行。就A型流感病毒而言，已知由HA的16种亚型和NA的9 种亚型组合产生的许多血清型。已知的是，通常而言，RNA病毒易于变异。流感病毒并非例外且其抗原性通过编码HA或NA的基因的点突变而逐年逐渐改变(抗原性漂移(antigen drift))。就A型流感病毒而言，已知通过在几十年的间隔用另外亚型代替HA和NA任一者或两者的离散突变 (discrete mutation)而出现抗原性不同的新病毒株(抗原性转变(antigen shift))。此类抗原性漂移和/或转变导致的流感病毒突变不断地对人造成损害。世界上曾经出现过若干抗原性转变，引发流行病(大流行病)，导致许多人受害。具体而言，有1918的西班牙流感、1957年的亚洲流感、1968年的香港流感和1977年的俄国流感。由感染流感病毒导致的流感是世界范围内以流行病形式出现的严重感染性疾病之一。在老年人、儿童或免疫系统弱的患者中已有许多死亡或脑炎病例。即使流感病毒感染不导致患者死亡，但例如发烧、头痛和疲劳的身体症状可使患者在某时期内停止社会活动， 这导致极大经济损失。因此，除了重视针对流感病毒感染的常规保护外，还存在甚至针对新病毒株建立有效预防措施的必要，这是由于抗原性转变导致新病毒株出现的可能性增加。针对流感的预防措施是每年进行疫苗接种。当前实际使用的疫苗是片段疫苗，其包含作为主要成分的HA，其纯化自用鸡胚卵培养的用于制备疫苗的毒株。因此，将预测出现于当年流行病的病毒用作制备疫苗的毒株。因此必需每年通过预测导致流行病的毒株来确定用于制备疫苗的毒株，并且在用于制备疫苗的毒株与导致流行病的毒株之间存在不匹配的情况下，疫苗将没那么有效。与用单次免疫接种程序可在至少数年内提供免疫力的疫苗 (例如DPT(白喉、百日咳、破伤风)疫苗和日本脑炎疫苗)相比，当前的流感疫苗需要每年接种，因此对接受疫苗的那些人和注射疫苗的医师两者都不便并且这将造成费用负担。此外，在由于预测失败而在流行病中出现与预期病毒株不同的病毒株的情况下，接受疫苗的那些人尽管已接种疫苗，但仍将感染流感病毒。特别地，在出现由导致显著不同抗原性的转变产生的流感新毒株的情况下，因为使用常规流感疫苗预期将几乎不会有保护作用，故此将出现病毒爆发流行，即所谓的大流行。如上所述，因为目前流感疫苗不能充分应对病毒中的突变，极其需要受抗原突变影响较小的通用流感疫苗来解决此问题。因为导致此类流行病的流感病毒是A型流感病毒，故此通过开发提供A型流感病毒中共有免疫原性的疫苗可获得不仅针对每年的流行病还针对大流行病的所需流感疫苗。 基于所述观点，已进行了靶向A型流感病毒中共有的M2蛋白的疫苗研究(参见例如非专利文献I)。M2蛋白是病毒表面蛋白，其在A型流感病毒中具有相对充分保守的氨基酸序列。 其以相对少的量存在于流感病毒颗粒中(参见例如非专利文献2)但其在病毒感染的细胞中以相对高的水平表达(参见例如非专利文献3)。据报道，针对M2的抗体抑制体内和体外两种樽型中A型流感病毒的复制(参见例如非专利文献4和5)。此外，SI印ushkin等报道，在用M2接种的小鼠中，阻止了异源A型流感病毒的致死感染并且促进了病毒从肺组织除去(参见例如非专利文献I)。还有报道指出，其中疏水跨膜结构域已被除去的修饰的M2蛋白可用于制备疫苗(参见例如专利文献 I)。在另一方面，Neirynck等报道，将与乙型肝炎病毒核心抗原的N-末端融合的M2的胞外域用作疫苗抗原(参见非专利文献6)。依据Neirynck等，在其表面上暴露M2的乙型肝炎病毒核心颗粒在大肠杆菌中表汰,并目.从大肠杆菌纯化颗粒,并且通过将颗粒与佐剂一起给予来诱导针对M2的抗体。此外，使用采用小鼠的实验，Wu等(参见例如非专利文献7)和Mozdzanowska等 (参见例如非专利文献8)报道，通过利用佐剂或称作MAP的低聚物的肽，与由23个氨基酸残基(其在从M2除去疏水跨膜结构域后产生)组成的区域对应的肽(M2e)也能针对异源 A型流感病毒的致死感染起保护作用。还揭示的是，至少一种针对保护性抗体(其由用M2e 的免疫接种而产生)的表位存在于从M2e的第6至第13位的氨基酸区域中(参见例如非专利文献9)。常规流感疫苗的制备需要耗时及费力的过程，即首先预测当年流行的病毒株，使病毒适应在卵中培养，在大量卵中培养病毒，从培养物中分离病毒，灭活病毒，并且纯化抗原蛋白。使得不必要预测当年流行的病毒株来制备疫苗株并且可应对大流行病的新疫苗的开发将极大有助于国民福祉并降低医疗费用。专利文献I :美国专利No. 6169175专利文献2 .TP-A-2001-512748非专利文献I Slepushkin 等，1995, Vaccine 13 :第 1399-1402 页非专利文献2 =Zebedee 和 Lamb，1988 J. Virol. 62 :第 2762-2772 页非专利文献3 =Lamb 等，1985 Cell 40 :第 627-633 页非专利文献4 HuRhey 等，1995 Virology 212 :第 411-421 页非专利文献5 =Treanor 等，1990 J. Virol. 64 :第 I375-I377 页非专利文献6 1999 Nature Med. 5 :第 Il57-Il63 页非专利文献7 2007 Vaccine 25 :第 8868-8873 页非专利文献8 2007 Virology J. 4 118 doi 10. 1186/1743-422X-4-118非专利文献9 ffanli 等，2004 Immunol. Lett 93 :第 131-136 页发明公开内容(本发明解决的技术问题)本发明的目的是提供源自基质蛋白2(流感病毒的表层蛋白之一，下文也称作"M2")的具有强有效免疫原性的修饰的肽，以及利用修饰的肽的方法。(解决问题的方法)在此情况下，本发明人为达到上述目的而持续刻苦研究并因而发现通过将半胱氨酸残基插入由A型流感病毒M2的第2至第24位的23个氨基酸残基组成的肽(下文也称作"M2e")中而制备的肽(下文也称作"M2eC肽")具有比迄今报道的M2e高得多(为 2至20倍)的免疫原性，从而完成本发明。依据本发明，提供以下内容通过将半胱氨酸残基插入由M2的第2至第24位的 23个氨基酸残基组成的肽(M2e)中而制备的M2eC肽(参见专利文献2)，所述M2由97个氨基酸残基组成并且是表层蛋白之一 ；M2eC肽与其它多肽的融合蛋白；包含M2eC肽或融合蛋白作为活性成分的流感疫苗；由编码M2eC肽或融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列组成的核酸片段；其中掺入核酸片段的表达载体(包括病毒载体)；和其中引入表达载体的宿主以及识别M2的抗体。M2eC肽以及由编码M2eC肽的氨基酸序列的核苷酸序列组成的核酸片段可有效用于预防和治疗流感感染。因此，本发明包括以下内容[I]通过将半胱氨酸残基插入由流感病毒基质蛋白2的第2至第24位的氨基酸序列组成的肽(M2e)中而制成的修饰的肽。[2] [I]的修饰的肽，其中流感病毒是A型流感病毒。[3] [I]或[2]的修饰的肽，其中所述半胱氨酸残基在M2e的第15至第16之间的位置或在相对于M2e的第15至第16位的C端处插入。[4] [3]的修饰的肽，其中所述半胱氨酸残基在M2e的以下位置的任一个或者两个或更多个的组合插入第15至第16之间、第20至第21之间、第21至第22之间、第22至第23之间以及第23至第24之间。[5] [I]至[4]中任一项修饰的肽，其中所述插入的半胱氨酸残基的总数是I至5。[6] [5]的修饰的肽，其中在所述每一插入位置上插入的半胱氨酸残基数目至多为3。[7]由[I]至[6]中任一项修饰的肽和多肽组成的融合蛋白。[8] [7]的融合蛋白，其中所述多肽是膜联蛋白V或白蛋白。[9]包含[I]至[6]中任一项修饰的肽或[7]或[8]的融合蛋白作为活性成分的流感疫苗。[10]可跨过生物屏障递送至身体的装置，所述装置包含[9]的流感疫苗。[11]由编码[I]至[6]中任一项修饰的肽或[7]或[8]的融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列组成的核酸片段。[12]其中掺入了 [11]的核酸片段的表达载体。[13]其中引入[12]的表达载体的宿主。[14]识别[I]至[6]中任一项修饰的肽并且具有针对流感病毒的保护作用的抗体。(比现有技术更有效的作用)本发明的M2eC肽具有产生用于预防流感病毒感染的有效抗体的能力，其为无半胱氨酸残基插入的M2e的2至20倍。例如，由氨基酸序列Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Cys-Asp-Cys-Ser-Cys-Ser-Asp (S EQ ID No :10)组成的M2eC肽，其为本发明M2eC肽的一个实施方案，具有为迄今报道的M2e 约20倍的免疫原性并且可合宜地用于流感疫苗。此外，本发明M2eC肽N端的9个氨基酸残基具有在流感病毒中充分保守的氨基酸序列，并且因此所述肽不依赖于流行毒株。此外， 此大小的肽可通过化学合成以低价大量地均质合成，这对于在大流行病的紧急情况下疫苗的迅速供应是极为有利的。本发明的M2eC肽还可与其它多肽作为融合物表达。附图简述图I是显示表2中所示的各免疫组的抗_M2e抗体的平均效价的图示。图2是显示表3中所示的各免疫组的抗_M2e抗体的平均效价的图示。图3是显示表4中所示的各免疫组的抗_M2e抗体的平均效价的图示。图4是显示恰在用同源病毒攻击系统攻击前抗_M2e抗体的平均效价的图示。图5是显示恰在用异源病毒攻击系统攻击前抗_M2e抗体的平均效价的图示。本发明最佳实施方式本发明特征为通过将半胱氨酸残基插入由流感病毒中基质蛋白2的第2至第24 位的氨基酸序列组成的23个氨基酸残基(M2e)中而制成的肽(M2eC肽)。用于本发明M2eC肽中的M2e可源自A型流感病毒的任何毒株，其具有产生针对流感病毒的保护性抗体的能力。就A型流感病毒而言，已分离由HA的16种亚型和NA的 9种亚型的组合产生的许多血清型。如报道的，此类血清型包括A/PR/8毒株、IOWA毒株、 WISC 毒株、TAIff 毒株、LENT 毒株、VIET 毒株、INDO 毒株、HK156 毒株、A/Beijing/262/95 毒株、A/Sydney/5/97 毒株、A/Panama/2007/99 毒株、A/Wyoming/3/2003 毒株、A/New Caledonia20/99 毒株、A/New York/55/2004 毒株、A/Hiroshima/52/2005 毒株 A/Solomon Islands/3/2006 毒株、A/Brisbane/59/2007 毒株、A/Uruguay/716/2007 毒株，和 A/ California/05/2009以及A/California/06/2009，可使用源自这些毒株中任一种的M2的 M2e。优选地，可使用由下式代表的氨基酸序列组成的M2e Ser-Xlaa-Leu-Thr-Glu-Va l-Glu-Thr-Pro-X2aa-Arg-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Cys-X6aa-Cys-X7aa-X8aa-Ser-X9aa-Asp 其中 Xlaa 为 Pro 或 Leu，X2aa 为 Ile 或 Thr，X3aa 为 Asn 或 Ser，X4aa 为 Gly 或 Glu，X5aa 为 Gly 或 Glu, X6aa 为 Lys 或 Arg, X7aa 为 Asn 或 Ser, X8aa 为 Gly 或 Asp 以及 X9aa 为 Asn 或 Ser(SEQ ID No :20)。所述 Xlaa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa 和 X9aa 是源自上述血清型的氨基酸取代而产生的那些。最优选地，可使用由氨基酸序列Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-A sp (SEQ ID No 1)组成的 M2e。在与保护性抗体的产生有关的重要表位区域可不受影响的程度上，未具体限定待插入M2e中的半胱氨酸残基的位置和数目。为提供针对流感病毒传染病的强有效免疫，可在M2e的以下任何位置插入I至5个半胱氨酸残基 第15至第16之间、第20至第21之间、第21至第22之间、第22至第23之间以及第23至第24之间。优选地，每一半胱氨酸残基(总数为4)，可在M2e的第20至第21之间、第21至第22之间、第22至第23之间以及第23至第24之间的位置插入。此外，可至少在一个上文描述的所述各位置中插入至多3个半胱氨酸残基。优选地，在M2e的第20至第21之间的位置插入3个半胱氨酸残基。可基于根据M2蛋白(其源自迄今报道的各种流感病毒)的核酸序列预测的氨基酸序列(参见例如非专利文献5)以及与上述半胱氨酸残基插入相关的设计，用肽合成仪 (例如，430A妝合成仪PerkinElmer Japan Co. ,Ltd. ,Applied Biosystems)通过化学合成而获得本发明的M2eC肽。目前有许多的肽合成承包商例如BEX CO.，LTD,Toray Research Center, inc.、TAKARA BIO Inc.和 Invitrogen,因此其合成可委托给他们。可将本发明的M2eC肽与多种多肽例如白蛋白、膜联蛋白V和病毒蛋白(HBV核心蛋白等)连接用作融合蛋白。所述多肽不特别地受限，但优选在选择的宿主中以更高水平表达的那些。编码所述多肽的核酸片段可通过利用Sambrook等(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第 2 版· Cold Spring Harbor Laboratory Press,N. Y. , 1989)的基因重组技术而得到。编码融合蛋白的核酸片段可通过用PCR或用使用DNA合成酶的方法将编码本发明M2eC肽的核酸片段与编码其它多肽的核酸片段连接而制备。例如当用PCR获得编码融合蛋白的核酸片段时，可使用由编码本发明M2eC肽的核苷酸序列和编码待融合多肽的一部分的核苷酸序列(21个核苷酸)组成的引物以及针对待融合的多肽的另一引物(每一引物的方向可通过任一位于N端的多肽来确定)。适当限制酶的切割位点的核苷酸序列可插入或加入引物末端。可将由此得到的编码本发明M2eC肽或融合蛋白的核酸片段并入所需的表达载体中并且可将该载体引入宿主中以表达该核酸片段。质粒和病毒载体可用作表达载体。待掺入所述表达载体的启动子可选自例如Lac、tac、pho5、adh、SV40早期、SV40晚期、β -肌动蛋白的启动子，这取决于用作宿主的微生物或动物细胞。细菌、酵母、动物细胞、植物细胞和昆虫细胞通常可用作宿主，但可依使用目的来选择。对于宿主细胞的转化，可利用已知的程序。例如，可利用磷酸钙、DEAE葡聚糖、Iipofectin系统的脂质体、原生质体聚乙二醇融合和电穿孔，并且可依所使用的宿主细胞来选择所需方法。本发明M2eC肽和融合蛋白的纯化可通过合宜地将常用于蛋白质化学的方法结合而完成，例如离心、盐析、超滤、等电沉淀、电泳、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱、疏水色谱、羟磷灰石色谱等。此外，为便于纯化本发明M2eC肽之目的，肽可与其它多肽或肽作为融合物而表达。表达此类融合蛋白的载体包括加入寡聚组氨酸的His-标签表达系统(Novagen)、表达加有FLAG标签的融合蛋白的系统(Sigma)、制备带有GST的融合蛋白的谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合蛋白纯化系统(GE Healthcare Bioscience)、MagneHis 蛋白纯化系统(Promega Inc)等。例如，本发明M2eC肽可表达为带有寡聚组氨酸的融合肽并且随后可通过使用镍亲和柱(GE Healthcare Bioscience)来特异地且容易地纯化该肽。得到的M2eC肽的量可通过用天平的重量分析法和紫外光谱测定法(在214nm 波长处的光谱测定)来测定。含有M2eC肽的融合蛋白的量可通过BCA Protein Assay Reagent 试剂盒(Pierce Biotechnology, Inc)、Protein Assay 试剂盒(Bio-Rad Japan, Inc)等来测定。本发明的M2eC肽以及由M2eC肽和其它多肽组成的融合蛋白(下文也简称为"抗原")作为疫苗的评价可如下进行通过用抗原免疫小动物例如鸡、小鼠、大鼠、豚鼠、狗或猴,随后从免疫过的动物获取血液，自此分离血清并且测定针对本发明M2eC肽的抗体效价或针对ML系统中所述血清中流感病毒的中和抗体效价；或者通过将致死剂量的流感病毒给予所述免疫过的动物，并且随后在並 系统中观察免疫过的动物的生死或疾病状况。对于体外系统中抗体的测定,通常可使用ELISA、PHA或噬菌斑测定。由此得到的本发明M2eC 肽具有产生用于抑制流感病毒感染的有效抗体的能力，其为M2e的2至20倍，并且可被用作流感疫苗的免疫抗原。当用作流感疫苗的免疫抗原时，可使用单种M2eC肽，也可使用两种或更多种M2eC肽或其它流感病毒抗原例如HA、NA和NP抗原与M2eC肽的组合。免疫实验方案(例如给药途径例如经皮下、皮内、肌内、腹膜内、经鼻、经口和舌下)以及免疫的间隔可为任何可诱导免疫力的方法，例如通常用于使用可跨过生物屏障递送至身体的装置来研究疫苗或免疫接种的免疫原性的标准免疫方法。这样的装置包括用于经皮肤诱导免疫的各种形式的显微针和亲水凝胶贴剂，以及用于经肠道诱导免疫的各种肠道胶囊剂、脂质体和无包膜病毒颗粒。可向用于免疫的抗原加入任何可用于人的佐剂，例如氢氧化铝凝胶、磷酸铝凝胶、CpG寡核苷酸、MDP、QS21以及MPL+TDM乳剂以增加其免疫能力。此外，为稳定或保持抗原形式之目的，可向抗原加入多种药学上可接受的添加剂。此类添加剂包括稳定剂(精氨酸、聚山梨酯80、MaCrOgOl 4000等)和赋形剂(甘露醇、山梨醇、 蔗糖、乳糖)。可对包含由此制备的本发明M2eC肽或融合蛋白作为活性成分的组合物进行无菌过滤、分配、冷冻干燥等以便配制，并且可将其用作用于预防流感病毒感染和疾病发作的疫苗。如上所述，本发明的M2eC肽能产生针对流感病毒的保护性抗体并且所得抗体可用作用于治疗患有流感的患者的材料和用于构建流感病毒检测系统的材料，例如，通过抗体测定例如ELISA、蛋白质印迹和点印迹的检测系统。这样的保护性抗体(多克隆抗体)可得自用上述免疫实验方案免疫过的动物血清。对于抗体的纯化，可使用如上所述的蛋白质纯化。单克隆抗体可如下述得到。即，依据例如Milstein等，Method Enzymol. , 73, 3-46，1981从免疫过的动物移出产生抗体的细胞例如脾细胞或淋巴细胞并且与骨髓瘤细胞株融合以制备杂交瘤。可使用小鼠骨髓瘤细胞株例如NSI-Ag4/l(Eur. J. Immunol.，6 :511， 1976)、P3X63-Ag8. Ul(Curr. Topics Microbiol. Immunol. ,81 :1，1978)、X63_Ag8. 653(J. Immunol. , 123 =1548,1979)等。通过在HAT培养基中培养足以使未融合细胞消亡的一段时间(通常为数天至数周)来得到杂交瘤。随后从由此得到的杂交瘤中选出产生目标抗体的那些并使用其培养液用常规有限稀释将其克隆。选择产生与本发明肽特异性结合的抗体的克隆可用常用的分析技术例如ELISA、RIA或蛋白质印迹来进行。与本发明M2eC肽结合的抗体还可通过使用卩遼菌体展示的抗体制备技术来制备(Phage Display of Peptides and Proteins A Laboratory Manual, Brian K. Kay 等编辑，Antibody Engineering A PRACTICAL APPROACH, J. McCAFFERTY 等编辑，ANTIBODY ENGINEERING 第 2 版，Carl A. K. B0RREBAECK 编辑)。通过以下实施例将更详细地说明本发明，但无论如何本发明不受限于这些实施例。实施例I :<通过将半胱氨酸残基插入M2e来制备的M2eC肽的免疫原性评价>I.材料和方法⑴M2eC 肽作为用于制备M2eC肽的模板的M2e氨基酸序列基于具有更通用序列(1999 Nature Med. 5 1157-1163) (BEX Co. , Ltd.)的 A/New Caledonia/20/1999 (HlNl)毒株 (GeneBank登记号ACF41880)的氨基酸序列来合成。合成的M2e以及各M2eC肽示于表I。 所合成的各肽用含ImM EDTA的用氮气置换的注射用蒸馏水以5mg/mL来制备，并且作为贮存液储存在低于_80°C直至使用。表I本发明公开了源自作为流感病毒的表层蛋白之一的基质蛋白2(下文称作″M2″)的修饰的肽；以及所述修饰的肽的用途。具体公开的是通过将半胱氨酸残基插入包含位于A型流感病毒M2氨基酸序列中第2个氨基酸残基至第24个氨基酸残基之间的23个氨基酸残基的肽(下文称作″M2e″)中而产生的修饰的肽；由所述修饰的肽和多肽组成的融合蛋白；包含所述修饰的肽或所述融合蛋白作为活性成分的流感疫苗；含有所述流感疫苗并且可递送至有生命生物体内的装置；包含编码所述修饰的肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸片段；其中整合有所述核酸片段的表达载体；其中引入所述表达载体的宿主；以及可识别所述修饰的肽并且具有针对流感病毒的保护作用的抗体。