专利名称：穿透细胞膜的靛类双吲哚衍生物的用途的制作方法图1是个曲线图，表明用本发明的靛类双吲哚衍生物(实施例1、4和6化合物)对LXFL 529/17化疗期间，相对肿瘤体积随时间的变化。按照下列表4中的时间和剂量给裸鼠腹膜内注射本发明的抗肿瘤活性物质。与赋形剂对照进行比较，所有化合物都显著地抑制肿瘤生长。图2是个曲线图，表明在LXFL 529/17化疗期间试验裸鼠相对体重随时间的变化。5-甲基靛玉红(实施例6)在100mg/kg-300mg/kg剂量时在体重无明显减少情况下(图2和图4)显示出非常高的抗肿瘤活性(图1和图3)，因而证明高抗肿瘤活性、无明显毒性。图3、图5和图7是曲线图，表明用本发明的其它靛类双吲哚衍生物(实施例8、9、10和14化合物)对LXFL 529/17化疗期间，相对肿瘤体积对时间的变化。图4、图6和图8是曲线图，表明用所述本发明的其它靛类双吲哚衍生物对LXFL 529/17化疗期间，所试验裸鼠的相对体重随时间的变化。通过下列实施例和比较实施例详细解释本发明，它们也使本发明进一步的优点变得明显。1.靛类双吲哚衍生物的合成实施例1(靛玉红)氩气氛下，向0.42g(2.4mmol)羟基吲哚乙酸酯(indoxylacetate)溶于20ml甲醇的溶液中加入0.35g(2.4mmol)靛红和0.55g(5.2mmol)碳酸钠。将混合物在环境温度下搅拌30分钟。在环境温度下放置24小时后，滤出反应混合物。用少量甲醇和水洗涤沉淀直到滤液显示出中性pH。在真空干燥器中贮存，通过氢氧化钾除去残留水分。自乙醇或吡啶中重结晶，得到深紫色结晶(RussellG.A.，Kaupp G.(1969)，J.Am.Chem.Soc.，913851-9，修改)。收率0.51g(81％)，深紫色细针状，Fp341-343℃CHN-分析(C16H10N2O2)；MW262.26g/mol；计算值73.3％C，3.8％H，10.7％N；实验值73.2％C，4.0％H，10.6％N；质谱m/z＝262(M+，100％)，234(43％)，205(25％)，158(3％)，131(4％)，103(7％)，76(3％)；1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
IR谱3340cm-1ν(N-H)，1710cm-1ν(3’-C＝O)，1650cm-1ν(2-C＝O)，1590cm-1ν(C＝C，芳基)，1450cm-1ν(C＝C，芳基)，745cm-1ν(具有四个相邻氢原子的芳基)。
UV/Vis谱(DMSO)290nm，363nm，383nm(肩)，551nm。
用基本上相同的合成方法进行下列实施例2至9、12、13和比较实施例2(5-碘代靛玉红)收率80％，深紫色细针状，Fp334-335℃(分解)；CHN-分析(C16H9IN2O2)；MG388.16g/mol；计算值49.5％C，2.3％H，7.2％N；实验值49.7％C，2.5％H，7.1％N；质谱388(M+，100％)，360(3％)，269(9％)，261(6％)，233(16％)，205(16％)，128(1％)；
1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
UV/Vis谱(DMSO)370nm，386nm(肩)，555nm。
实施例3(5-溴靛玉红)收率70％，深紫色细针状；CHN-分析(C16H9BrN2O2)；MG＝341.16g/mol；计算值56.3％C，2.7％H，8.2％N；实验值56.4％C，2.7％H，8.2％N；质谱342(M+，100％)，340((M+，99％)，314(18％)，262(64％)，233(34％)，205(81％)，177(10％)；1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
实施例4(5-氯靛玉红)收率95％，深紫色细针状；CHN-分析(C16H9ClN2O2)；MG＝296.70g/mol；计算值49.5％C，2.3％H，7.2％N；实验值49.7％C，2.5％H，7.1％N；质谱m/z＝296(M+，100％)，268(39％)，239(8％)，233(35％)，205(50％)，177(7％)，153(6％)，137(7％)，77(7％)，120(4％)，102(6％)，77(7％)；1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
实施例5(5-氟靛玉红)收率92％，深紫色细针状；CHN-分析(C16H9FN2O2)；MG＝280.25g/mol；计算值68.6％C，3.2％H，9.9％N；实验值68.0％C，3.2％H，9.9％N；质谱m/z＝281(M++H+，19％)，280(M+，100％)，252(73％)，223(32％)，176(6％)，140(7％)，121(13％)，94(4％)，76(12％)，77(7％)，57(4％)，44(15％)；1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
实施例6(5-甲基靛玉红)收率92％，深紫色细针状；CHN-分析(C17H12N2O2)；MG＝276.28g/mol；计算值73.9％C，4.4％H，10.1％N；
实验值73.8％C，4.3％H，10.2％N；质谱m/z＝276(M+，100％)，261(10％)，248(47％)，247(53％)，220(6％)，219(18％)，205(7％)，171(4％)，165(10％)，138(4％)，133(15％)，104(7％)，77(7％)；1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
实施例7(5-硝基靛玉红)收率88％，深紫色细针状；CHN-分析(C16H9N3O4)；MG＝307.26g/mol；计算值62.5％C，3.0％H，13.7％N；实验值62.4％C，3.0％H，13.3％N；质谱m/z＝307(M+，5％)，276(10％)，262(100％)，234(23％)，205(22％)，158(6％)，131(10％)，104(19％)，76(12％)，50(6％)；1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
实施例8(靛玉红-3’-肟)通过将靛玉红与盐酸羟胺在吡啶溶液中反应合成出靛玉红-3’-肟(Farbwerke vorm.Meister Lucius & Brüning in Hoechst a.M.，Patentschrift des Reichspatentamtes Nr.283726(1913))。13C-NMR谱显示羟基亚氨基残基的位置在3’位(δ(C2)＝171.05ppm；δ(C3’)＝145.42ppm；DMSO-d6，RT)。
收率90％，红色结晶；CHN-分析(C16H11N3O2)；MG＝277.30g/mol；计算值69.3％C，4.0％H，15.2％N；实验值69.0％C，4.0％H，14.9％N；1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
实施例9(5-碘靛玉红-3’-肟)通过将5-碘靛玉红与盐酸羟胺在吡啶溶液中反应合成出靛玉红-3’-肟。13C-NMR谱显示羟基亚氨基残基的位置在3’位(δ(C2)＝170.25ppm；δ(C3’)＝151.52ppm；DMSO-d6，RT)。
收率90％，红色结晶；CHN-分析(C16H10IN3O2)；MG＝403.20g/mol；计算值47.7％C，2.5％H，10.4％N；实验值47.1％C，2.5％H，10.1％N；
1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
实施例10(异靛) 通过将羟吲哚与靛红在醋酸中加入盐酸进行反应合成出异靛(Wahl A.，Bayard P.，Comptes Rendues Hebdomadaires desSeances de L’Academie des Sciences，148，(1909)，716-719)。
收率84％，棕色结晶状物质；CHN-分析(C16H10N2O2)；MG＝262.26g/mol；计算值73.3％C，3.8％H，10.7％N；实验值73.0％C，3.8％H，10.9％N；质谱m/z＝262(M+，100％)，234(85％)，220(5％)，205(18％)，190(4％)，177(5％)，151(5％)，132(17％)，103(6％)，76(4％)，32(26％)。
1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
实施例11(靛蓝) 购得由Fluka Chemie AG公司生产的化学级靛蓝。
实施例12(靛玉红-5-磺酰胺)1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
实施例13(靛玉红-5-砜(2-羟乙基)酰胺)1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
实施例14(双(3-苯基吲哚-2-基)) 惰性气体保护下，向2-氨基二苯酮溶于二氯甲烷和吡啶的冷溶液中滴加草酰氯的二氯甲烷溶液。反应毕，加入0.5N盐酸，滤出生成的沉淀，随后用0.5N盐酸、碳酸氢钠溶液和水洗涤。将所得产物(N，N’-双(2-苯甲酰基苯基)-草酰胺)、锌粉和氯化钛(III)悬浮于二甲氧基乙烷中加热至回流。加热3小时后，将混合物冷至环境温度，滤出沉淀，用乙酸乙酯洗涤。用柱层析(硅胶)纯化粗产物，然后溶于乙酸乙酯，加入石油醚，以白色结晶形式沉淀析出。
CHN-分析(C28H20N2)，MG＝384.48g/mol；计算值87.5％C，5.2％H，7.3％N；实验值87.3％C，5.3％H，7.3％N；1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
比较实施例1(靛玉红-5-磺酸)收率76％，深紫色结晶状物质；质谱388(M+，100％)，360(3％)，269(9％)，261(6％)，233(16％)，205(16％)，128(1％).
1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
比较实施例2(靛玉红-3’-肟-5-磺酸)收率76％，深紫色结晶状物质；质谱388(M+，100％)，360(3％)，269(9％)，261(6％)，233(16％)，205(16％)，128(1％).
1H-NMR和13C-NMR谱与目标结构一致。
表2概括出实施例1至9和比较实施例1和2的靛玉红化合物的结构。
表1


2.细胞吸收进入LXFL 529L细胞研究了实施例1、6和8和比较实施例1和2化合物对培养号为P23至P39的LXFL 529L细胞的穿透能力。结果列于表2中。所给出的被细胞吸收物质的量取决于培养基中该物质的浓度。所有实验中的培养时间都为2小时。此外，评价了被细胞溶质和细胞器官(特定的)中细胞吸收物质的分布，并在表2的中间栏中列出。按照Skehan等在J.Natl.Cancer Institute 82，第1107-1112页(1990)中的sulfo-rhodamine B试验(SRB试验)测定肿瘤细胞生长抑制。在含血清的培养基中培养3天。实验用肿瘤细胞系是大细胞肺癌异种移植系LXFL 529L和乳腺癌系MCF-7。结果以IC50[μM]给出，对应于与赋形剂对照试验进行比较使50％生长抑制时化合物的浓度。
表2

实施例1、6和8化合物都能被肿瘤细胞吸收。与母体化合物靛玉红(实施例1)进行比较，实施例6化合物穿透细胞膜的能力有了实质性改善。与非取代靛玉红(实施例1)比较，实施例8化合物的吸收也略有改善。
尽管比较实施例1和2化合物能很好地溶于生理溶液，但它们基本上不能被细胞吸收。显然，磺酸酯基阻止了其穿透细胞膜。此外，对于比较实施例2，引入肟基也不能补偿这一不利结果。
3.抗肿瘤活性的评价用例如D.P.Berger等在Annals of Oncology 1，第333-341页(1990)中描述的菌落形成试验来评价化合物的抗肿瘤活性“人肿瘤异种移植clonongenic试验法，评价、预测值及药物筛选应用”。
实验是用各种肿瘤细胞系进行的，特别是乳腺癌(MAXF)、肺腺癌(LXFA)、大细胞肺癌(LXFL)、小细胞肺癌(LXFS)、结肠癌(CXF)、黑色素瘤(MEXF)、胰腺癌(PAXF)、肾癌(RXF)、卵巢癌(OVXF)和膀胱癌(BXF)。
IC70-值和IC50-值分别定义为与未进行治疗的对照物比较使集落生成分别减少70％和50％时药物活性化合物的浓度。因此，IC70-和IC50-值用于表明药物活性化合物的抗肿瘤活性，低的IC70-和/或IC50-值表明为优越的抗肿瘤活性。根据本发明，IC70-值优选为20μM或更低，更优选10μM或更低。
表3表明本发明实施例和比较实施例1化合物的抗肿瘤活性。本发明实施例化合物对各种类型的肿瘤细胞系显示出良好至优秀的抗肿瘤活性。比较实施例1化合物对任何肿瘤系都未显示出抗肿瘤活性。正如上述表2中说明的，这一行为与该物质缺乏对细胞膜的穿透能力相一致。
非常令人吃惊的是，取代方式的微小变化导致抗肿瘤活性范围的显著变化。然而，几乎所有实施例的化合物都对乳腺癌显示出良好的抗肿瘤活性。
表3

表3(续)

表3(续)

4.体内试验将实施例1、4、6、8、9和10化合物在皮下接种人肿瘤异种移植LXFL 529的裸鼠体内进行试验。按照表4中的剂量和时间表给动物腹膜内注射靛类双吲哚衍生物。
表4

试验进行2 1或28天。与相对于对照的肿瘤体积中间值进行比较评价抗肿瘤活性，以％T/C表示，其中T为试验组，C为赋形剂对照组。表4中，根据活性评价标度给出抗肿瘤活性。
活性评价-无活性T/C＞50％+ 肿瘤抑制T/C＞25-50％++ 肿瘤停滞T/C≤25％附图1-8进一步具体说明该结果。
通常，试验小鼠体重减少20％以上时被看作是毒性剂量。


本发明涉及穿透细胞膜的靛类双吲哚衍生物用于制备治疗人实体癌药物的用途。