全人源抗人白介素17a单链抗体的制作方法 【技术领域】 [0001] 本发明涉及一种构建天然噬菌体抗体库的方法以及由该抗体库获得的可与人白 介素17A特异结合的单链抗体。属于医药【技术领域】。 [0002] 人白细胞介素17(human interleukin-17，hIL-17)于1993年从一种激活的T细胞 杂交瘤中分离出来，最初称为细胞毒性T细胞抗原8(CTLA8)。目前已知IL-17即IL-17A主 要由Th-17细胞分泌，且在IL-17家族中存在6个成员（IL-17A-F)，他们分别由150?180 个氨基酸构成，通常以二聚体的形式存在。它可以导致趋化性细胞因子如IL-8、单核细胞趋 化因子-l(MCP-l)和GRO-α的增高，从而促使中性粒细胞和单核细胞的募集。此外，IL-17 通过刺激IL-6和PGE2的产生，加强局部炎症反应；诱导细胞间黏附因子（ICAM)产生，促 使T细胞反应。IL-17具有强大的促炎作用，其与多种疾病如类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA)，气道炎症，慢性炎性疾病以及肿瘤的生长相关。 [0003] 类风湿性关节炎：一种以关节滑膜炎为特征，以慢性多发性关节炎为主要临床表 现的一种自身免疫性疾病。研究表面，在病人关节的滑液中可以检测到活性的IL-17, IL-17 刺激软骨细胞产生iNOS和N0及其它与分解代谢相关的酶，并与IL-1 β，TNF- α -起刺激 成骨细胞分泌如GM-CSF和IL-6等细胞因子，从而抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖合成，调节 破骨细胞，发生骨破坏。IL-17还可以诱导基质金属蛋白酶，直接在疾病进展中起到破坏性 作用。因此，阻断IL-17/IL-17R通路可能是治疗RA的新途径。研究发现，利用抗鼠 IL-17 抗体治疗胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis, CIA)模型中，关节局部炎症， 软骨破坏，骨质侵蚀明显减轻。 [0004] 肺病：如慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary diseases)，是一种 具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，多与肺部对有害颗粒物或 有害气体的异常炎症反应有关。其病程的恶化，与气道中中性粒细胞的数量增多有关。研 究表明，在CCPD急性加重期及稳定期IL-17水平显著升高，IL-17引起中性粒细胞增多，促 进释放IL-6、IL-8,打破基质金属蛋白酶平衡，参与了 CCPD的发病，是引起肺内炎症细胞 浸润及肺实质破坏的主要原因之一。 [0005] 其他疾病如：多种慢性纤维化性疾病（Mi等，2011);
[0006] 急性移植物排斥（Antonysamy 等，1999; Yoshida 等，2006; Tang 等，2001);
[0007] 银屑病（Teunissen等，1998)和银屑病关节炎；
[0008] 全身性硬化症（Kurasawa 等，2000 );
[0009] 全身性红斑狼疮（Wong等，2000);
[0010] 自身免疫炎性肠炎和克罗恩病（Nielsen等，2003 ;Fujino等，2003 ;Yen等， 2006)；
[0011] 心血管疾病，包括动脉粥样硬化（Csiszar和Ungvari, 2004)，川崎病（Sohn等， 2003)，缺血性心脏病（Csiszar，2003)和中风；
[0012] 癌症，包括淋巴瘤（Maggio 等，2002)和肿瘤（Numassaki 等，2005);
[0013] 病毒感染导致的疾病等。
[0014] 综上所诉，此类疾病均出现IL-17异常表达，利用IL-17拮抗剂治疗此类疾病，具 有重要价值。
[0015] 上世纪90年代中期以来，抗体药物在新药中崭露头角。在治疗性应用中，全人抗 体可以克服鼠源单克隆抗体在临床应用中的诸多缺点：如诱发人体产生抗鼠抗体（HAMA) 反应，不能有效引起CDC及ADCC等。随着对人类抗体基因及结构的研究及分子生物学技术 的进展，利用噬菌体抗体库制备人源抗体，已成为获得全人抗体的最主要手段之一。
[0016] 噬菌体抗体库是利用基因重组技术将外源基因的基因型和表型统一在同一个噬 菌体颗粒内。更重要的是，该类噬菌体抗体，不仅可以与特异的配体结合，而且保持感染能 力。这样又将抗体的选择能力和噬菌体的扩增能力偶联起来，使得噬菌体展示技术成为一 种极其有效抗体筛选系统。经典的筛选方法是将抗原纯化，然后与抗体库孵育，通过数次 "吸附一洗涤一洗脱一扩增"的过程（即生物淘选），使得特异克隆得以富集。可以迅速得 到针对靶抗原的抗体，通过功能筛选最终获得中和性抗体。
[0017] 针对IL-17A的抗体已见报道，例如，R&D公司已生产鼠抗人IL-17单克隆抗体 MAB317。W02006/054059(UCB细胞技术公司）描述了 IL-17A中和性抗体分子，该分子最 初从杂交瘤中分离并PEG化抗体片段。采用BIAcore测定该片段对IL-17的亲和力为 133-365pM。
[0018] CN200580026569. 4 (诺瓦提斯公司）报道IL-17A的特异性抗体，并应用与治疗 IL-17介导的相关疾病。
[0019] CN200680046605. 8 (伊莱利利公司）报道IL-17A的特异性抗体，并应用与治疗 IL-17介导的相关疾病。
[0020] W02006/013107(诺华制药股份有限公司）报道了 IL-17A的特异性抗体，特别是称 为AIN457,从杂交瘤分离人抗IL-17抗体与人IL-17A的亲和力为227pM.
[0021] CN200780023566. 4(阿斯特拉捷利康股份公司），报道利用噬菌体库分离获得抗 IL-17单链抗体片段。
[0022] CN200780029886. 0 (UCB医药有限公司）报道IL-17A的特异性抗体，并应用与治 疗IL-17介导的相关疾病。
[0023] CN200780003925. X (诺瓦提斯公司)报道了将IL-17A特异性抗体用于治疗实体或 造血系统性肿瘤。
[0024] 其本发明中的与人IL-17A相结合的片段，与上述片段序列完全不同，并抑制 IL-17A相关生物学活性可用于治疗IL-17A相关疾病，其为全新的IL-17A的抗体分子，特别 是人抗体分子。



[0025] 本发明的目的是提供具有潜在医学和药学价值的一组全人源抗人白介素17A抗 体可变区序列。全人源抗人白介素17A抗体可变区核苷酸序列全长234个核苷酸，其由可 变重链区和可变轻链区组成，下划线部分为可变区序列。
[0026] 重链可变区：
[0027] QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS 30
[0028] SNSAAffNVIR QSPSRGLEWL GRTYYRSKffS 60
[0029] HDYAVSVKSR ITINPDTSKN QFSLQLNSVT 90
[0030] PEDTAVYYCA REGEYGDYGY ffGQGTLVTVS 120
[0031] S
[0032] 轻链可变区：
[0033] SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY 30
[0034] YASWYQQKPG QAPVLVIYYD DDRPTGIPER60
[0035] FSGSNSGNTA TLTISRVEAG DEADYYCAAff 90
[0036] DDSLNGPVFG GGTKVTVLSG GST 113
[0037] 本发明公开了一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗 体含有的如下的结合片段，
[0038] 该片段的重链氨基酸序列为：SEQ ID N0:1 ;
[0039] 该片段的轻链氨基酸序列为：SEQ ID NO:3。
[0040] 所述的结合片段的核苷酸序列如下：
[0041] 该片段的重链核苷酸序列为：SEQ ID N0:2 ;
[0042] 该片段的轻链核苷酸序列为：SEQ ID N0:4。
[0043] 本发明公开的一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗 体含有的如下的结合片段，包含一组CDR :HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,其 中该组CDR的至少与下列序列的同源性具有30% :
[0044] HCDR1 的氨基酸序列 SEQ ID N0:5 ;
[0045] HCDR2 的氨基酸序列 SEQ ID N0:6 ;
[0046] HCDR3 的氨基酸序列 SEQ ID N0:7 ;
[0047] LCDR1 的氨基酸序列 SEQ ID N0:8 ;
[0048] LCDR2 的氨基酸序列 SEQ ID N0:9 ;
[0049] LCDR3 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 10。
[0050] 本发明公开的一种能够和人成熟白介素17A结合的抗体，其特征在于，所述的抗 体含有的如下的结合片段，所述结合片段中包含含有抗体VH结构域和VL结构域，
[0051] 其中所述VH结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3及重链框架区FR1、FR2、FR3和 FR4 ；
[0052] 其中所述VL结构域包含LCDR1、LCDR2和LCDR3及轻链框架区FR1、FR2、FR3和 FR4。
[0053] 所述的重链框架区FR根据抗体框架分类，可以属于人或其他物种的
[0054] VH1、VH2、VH3、VH4、VH5 或 VH6 ;
[0055] 所述的轻链框架区FR根据抗体框架分类，可以属于人的或其他物种
[0056] 的 Vk1、Vk2、Vk3*Vk4*VA1、VA2、VA3*VA4〇
[0057] 所述的其他物种优选是鼠。
[0058] 本发明公开的一种能够和人成熟白介素17Α结合的抗体，其特征在于，所述的抗 体含有的如下的结合片段，包含一组重链FR :HFR1、HFR2、HFR3,以及轻链FR :LFR1、LFR2和 LFR3,其中该组FR的至少与下列序列的同源性具有30% :
[0059] HFR1 的氨基酸序列 SEQ ID N0:11 ;
[0060] HFR2 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 12 ;
[0061] HFR3 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 13 ;
[0062] LFR1 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 14 ;
[0063] LFR2 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 15 ;
[0064] LFR3 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 16。
[0065] 本发明的抗体，其特征在于，含有上述结合片段的改型片段，及抗体基因片段，以 及同源性在30%以上的免疫结合片段。
[0066] 所述的改型片段选自 Diabody、Triabody、Tetrabody、Fab、scFv-Fv、IgG。
[0067] 所述的抗体基因片段如VH或VL。
[0068] 本发明的抗体，为全人源抗体。
[0069] 本发明公开了一种产生结合人IL-17A的结合片段的方法，该方法包括：提供编 码VH结构域的起始核酸和编码VL结构域的起始核酸的序列库，该起始核酸具有可替换的 HCDR1、HCDR2和/或HCDR3编码序列；利用随机突变VH和VL结构域起始核酸序列，和/或 将一个或多个核酸插入HCDR3起始序列库区域，进而产生亲和力更高的结合片段。
[0070] 适应症：由于IL-17A信号通路参与许多自身免疫病(类风湿性关节炎)、慢性炎症 疾病（慢性阻塞性肺炎）及肿瘤的发生及发展，激活IL-17A信号通路，促进相关细胞因子 释放可以抑制以上疾病的进程，该全人源抗人白介IL-17A单链抗体具有亲和力高，全人源 化，免疫原性低，其生物学功能在于阻断IL-17A信号通路和抑制相关细胞因子释放，因此 其适应症在于治疗以上自身免疫病及慢性炎症疾病。
[0071] 本发明的抗体优选在制备治疗IL-17A相关疾病中的应用。
[0072] 优选的IL-17A相关疾病选自类风湿性关节炎。
[0073] 本发明的结合成员偶联于可检测物质和治疗剂，包含权利要求的结合成员用于的 诊断试剂盒。
[0074] 术语及简称
[0075]