条石鲷白细胞介素12亚基IL-12p40及其应用的制作方法[0002]白细胞介素12 (interleukinl2，IL_12)是一类主要有炎性细胞产生的细胞因子，具有广泛生物学活性。IL-12是唯一一类异源二聚体的细胞因子。它由两个二硫键连接的亚基a-chain(p35)和β-chain(IL_12p40)组成形成异源二聚体，其中IL_12p40亚基则与造血细胞因子受体家族成员的胞外结构域(例如IL-6Ra和CNTFR)类似。IL_12p40亚基可以与p35或者pl9分别形成IL-12和IL-23。IL_12p40和p35亚基必须同时表达在同一细胞才能形成有空能的IL-12。IL-12是连接固有免疫和获得性免疫的关键性细胞因子，它是在抵御微生物病原的早期免疫应答中，由巨噬细胞、树突状细胞和B细胞产生，可以诱导或者促进促炎性Thl的产生。IL-12还可以促进NK细胞和T细胞的增殖和细胞裂解活性，参与到调节细胞介导的免疫应答的过程中。鱼类中IL-12研究极少，其中IL-12p40的功能完全未知。
[0003]本发明目的在于提供一种条石鲷白细胞介素12亚基IL_12p40及其应用。[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:[0005]一种条石鲷白细胞介素12亚基IL-12p40:1L_12p40的序列为序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。[0006]白细胞介素12亚基IL_12p40的应用，所述IL_12p40用于抗细菌感染制剂。[0007]本发明具有如下优点:
[0008]本发明的IL_12p40重组蛋白腹腔注射鱼类后能够显著抑制细菌侵染。



[0009]图1为本发明实施例提供的纯化的IL_12p40重组蛋白(泳道2)。泳道1，分子量标准。

[0010]下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
[0011]在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:
[0012]1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
[0013]2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)o
[0014]3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
[0015]实施例1
[0016]本发明的IL_12p40为序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列。
[0017]序列表SEQ ID N0.1 为:
[0018]MKTLSLWICGLLFTSLTGAHGLSHFPENFVVAKKANANPVTLTCGTKTDGAVTWKFEGEVLEDVGFEDKLQQDGQNLTASKLD SPMFGEYSCWRGVEMLSSTHLLLEADGGRESDSLLSCRAKSYDCNFGCKWTISGYTAARLGLGNDCSEGGESCHWVNSSDQLLDGGFQFELSHSLSPYAEESTMLELTAEAINDLSILRTTKRFYLRDIIQPDSPQIVRCQEVDQDLNVTIDPPASWSTPHSFFSLEHEIEYTFIDNGQNGFSSSTLIPKRISKLRVRSRDALVLSTffSQWTPWKNVTYWYYLNSTLSASALSLFLHVYRVLSCPLPSCFSLTVSGCLPLGQTHTDGQEITQHSPEAQ
[0019](a)序列特征:
[0020]?长度:361 (有效长度361)
[0021]?类型:氨基酸序列
[0022]籲链型:单链
[0023]?拓扑结构:线性
[0024](b)分子类型:蛋白质
[0025](C)假设:否
[0026](d)反义:否
[0027]( e )最初来源:条石鲷
[0028]结构特点:该蛋白含有一个保守的IL_12p40结构域(氨基酸114 一 197)。
[0029]实施例2
[0030]重组IL_12p40的制备:
[0031]I) IL-12p40表达质粒pP40的构建
[0032]以条石鲷cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为:94 V 60s预变性模板DNA，然后94 °C 40s, 60 V 60s, 72 V 60s, 5个循环后改为94 0C 40s, 65 °C 60s, 72 °C 60s, 30 个循环后再在 72 °C 延伸反应 7 — IOmin0 PCR 产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体PET259 (pET259构建过程参见Hu YH, Zhengffff, Sun L.1dentification and molecular analysis of a ferritin subunit from red drum(Sciaenops ocellatus).Fish Shellfish Immunol2010; 28:678-86)用限制性内切酶 EcoRV酶切后与上述纯 化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pP40。DNA测序表明PP40含有编码序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的基因。
[0033]所述LB组成成分按重量百分比计:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97.5%蒸馏水。所述 Fl 为 5’ -GATATCATGCTCAGCCACTTTCCAGAAA-3’ ；R1 为 5’ -GATATCCTGAGCTTCTGGTGAGTGCT-3，。
[0034]2)重组 IL_12p40 的纯化
[0035]将上述的质粒pP40用常规方法转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有Ap(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18 — 24小时，挑取一个转化子，将其命名为BL21/pP40。将BL21/pP40于含有Ap(100ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取Iml过夜后的培养液，加入100mL新鲜的含有Ap(100ug/ml)的LB液体培养基中，于37°C下转速200rpm摇动培养至OD6tltl为0.6，加入终浓度为ImM的IPTG，37°C继续以转速160rpm摇动培养4 一 5h,而后以5000g,4°C离心10min,收集菌液,加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4°C离心30min,回收上清。将上清中的蛋白用His Trap HP Columns (购于美国GE Healthcare公司)回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25 — 30min,随后15v/cm电压下电泳2 — 2.5h),测定其分子量大小,发现其分子量与IL_12p40相同(参见图1)。
[0036]所述裂解液含IOmM NaH2PO4, IOmM Tris 和 8M 尿素，ρΗ8.0。
[0037]实施例3
[0038]重组IL-12P40的应用
[0039]步骤I)蛋白注射
[0040]将上述实施例2步骤2)的重组IL-12P40在PBS中稀释至0.2mg/ml,即为IL-12P40稀释液。将10条条石鲷(重约28g)随机分为2组，每组5条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼腹腔注射IOOul IL-12P40稀释液，将B组(对照组)的每条鱼腹腔注射IOOul PBS0
[0041]所述PBS 组成成分按重量百分比计:0.8%NaCl, 0.02%KC1, 0.358%Na2HP04.12H20, 0? 024%NaH2P04，余量为水。
[0042]步骤2)细菌悬液制备
[0043]在LB培养基中培养哈氏弧菌T4至OD6tltl为0.8，然后离心(5000g，4°C，lOmin)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为5xl07cfu/ml，即为哈氏弧菌T4悬液。
[0044]所述菌株哈氏弧菌T41保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCJia:北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏日期:2007年3月22日，保藏编号为=CGMCC N0.1985，分类命名为哈氏弧菌T4 (Vibrio harveyi)。
[0045]步骤3)攻毒感染
[0046]在上述步骤I)注射后4h，将A和B组鱼腹腔注射IOOul上述步骤2)的细菌悬液。在注射后24h，取鱼肾脏组织，在2ml PBS中匀浆，将IOOul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于30°C培养48h，计算出现的菌落数。结果表明A组鱼肾脏的细菌数(4.2xl02)显著(Ρ〈0.01)低于B组鱼肾脏的细菌数(6.3χ102)。
[0047]这些结果表明，IL-12P40重组蛋白能够显著抑制细菌侵染。