专利名称：一种组织细胞分离培养试剂盒的制作方法传统的原代细胞分离方法主要有消化法和小块组织贴壁法。消化法主要有胰蛋白酶消化法、EDTA消化法、胰蛋白酶EDTA消化法、胶原酶消化法及胶原酶混合胰酶消化法等。胰蛋白酶消化法胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰蛋白酶的作用不一样。胰蛋白酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8. O、温度为37°C，浓度为0. 25%时，胰蛋白酶消化作用最佳。所以使用胰蛋白酶时，需要把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。EDTA消化法EDTA是一种非酶性消化物，常用不含Ca2+和Mg2+的BSS平衡液配成0. 02%的工作液。EDTA的作用机制一般认为是一些组织，尤其是上皮组织，在生存中需要Ca2+和Mg2+才能维持组织的完整性。EDTA能从这些组织生存环境中吸收这些离子，形成螯合物，能促进组织中细胞相互分离。胰蛋白酶EDTA消化法EDTA作用比胰蛋白酶缓和，很少用于单独消化新鲜组织(传代细胞可单用)，如与胰蛋白酶按不同比例相混合并用，消化作用更好。EDTA最适消化传代细胞，也多与胰蛋白酶混合使用(I :1或2 :1)。胶原酶消化法胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在特定的生理PH和温度条件下特异性地水解胶原蛋白的三维螺旋结构，对非胶原蛋白无水解作用。所以胶原酶消化法适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。当胶原酶浓度为2mg/ml, PH为6. 0，温度为37°C，可达到最佳消化效果。胶原酶混合胰酶消化法因胶原酶不含胰蛋白酶的水解位点，所以不对胶原酶造成破坏，而胶原酶只能水解胶原蛋白也不对胰蛋白酶产生影响，所以两种酶按最佳消化浓度I :1混合使用，能分离硬度较强的组织，如软骨细胞等。小块组织贴壁法利用组织小块对细胞瓶的贴壁生长性，使其长出延伸细胞，通过胰蛋白酶消化加以分离，从而获得原代细胞。上述各类方法均存在一定的缺陷性胰蛋白酶消化法，由于胰蛋白酶在长时间消化过程中使细胞间连接蛋白得以消化的同时也消化细胞膜表面蛋白，从而影响细胞活性；EDTA消化法，其消化强度极弱，细胞难以从组织分离，同时容易螯合细胞所必须的钙、镁离子，细胞在消化过程中缺乏营养物质，易而降低活性；传统胶原酶消化法因溶剂中多用平衡液或简单培养基，不含促细胞生长因子，在较长的消化过程中，，也会影响所分离出来的细胞质量，也不能实现高效分离；传统胶原酶混合胰酶消化法，同样不能添加细胞因子和必须蛋白，只因胰蛋白酶对这些细胞生长因子和必须蛋白发生竞争式消化，即损耗了胰蛋白酶也消化了必须蛋白。总之，传统消化法，要么消化强度过大，要么分离时间较长，或使细胞消化过度死亡，或使细胞在分离过程中因缺少营养而活性减弱，还有小块组织贴壁法依靠细胞延伸生长，因延伸生长速度慢，因而获得原代细胞少且慢，大大降低组织细胞分离效率。
图I是本实用新型试剂盒的结构组成示意图。为使本实用新型更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例I :本实用新型的细胞分离培养试剂盒的优选实施例[0024]本实用新型的一种组织细胞分离培养试剂盒的优选实施例，包括试剂盒本体1，在所述试剂盒本体I内盛装胶原酶浓缩液试剂瓶2、胰蛋白酶EDTA浓缩液试剂瓶3、培养基浓缩液试剂瓶4、抗生素浓缩液试剂瓶5和5个5ml青霉素玻璃瓶6。培养基浓缩液试剂瓶4内盛装有多种细胞生长因子、牛血清白蛋白和转铁蛋白浓缩液。抗生素浓缩液试剂瓶5为抗细菌、霉菌等抗生素浓缩液试剂瓶。试剂盒I中还含有说明书7。在本实施例中，胶原酶浓缩液试剂瓶2包含两个试剂瓶肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶21和非肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶22。具体结构可见图1，图I是本实用新型试剂盒的结构组成示意图。实施例2 :利用本实用新型的试剂盒分离狗肾脏器官组织细胞本实施例以分离狗肾脏器官组织细胞为例，说明本试剂盒在组织细胞分离中的应用。所用试剂盒为实施例I中所述的试剂盒。分离步骤如下I、实验室购买的实验狗经解剖获得肾脏器官；2、用医用剪刀剪成小块，至I克重，分装到5ml容量的青霉素玻璃瓶6中。3、再在5ml容量的青霉素玻璃瓶6中加入Iml的BSS平衡液(Dhank，s或PBS)，用眼科小剪剪至Imm3大小。4、组织待剪至Imm3大小后，加入4ml BSS平衡液，用移液管移至15ml离心管中，以600转/min离心I分钟,弃上清,此步骤反复操作3次，由于细胞碎片含大量的胶原蛋白，所以此操作的目的是除去细胞碎片等蛋白成分，以免影响A消化液的消化作用。5、以上操作经3次低速离心除去上清，加入A消化液，37°C恒温，直至含组织小块的消化液浑浊可终止消化。注通过浑浊程度辨别终止消化，可参照说明书彩图，脑、肝脏组织等软组织消化速度较快，一般为4-6小时，而软骨、表皮等硬组织消化速度较慢，可过夜消化。6、终止A消化液消化，即使用15ml离心管1000转/min离心3分钟，以除去A消化液，加IOml BSS平衡液再次1000转/min离心3分钟，除去上清，以达到洗掉A消化液的目的，以免影响B消化液的作用。注A消化后细胞外残留大量的蛋白，影响B消化液的对组织细胞进一步消化的活性。7、除去上清后加入B消化液，37°C消化5-15分钟后，1000转/min离心3分钟，除去B消化液。加入细胞培养适合的完全培养基5ml进行原代培养。上述步骤可见，使用本试剂盒主要是机械致碎，换液加消化液A，浑浊终止，再换液加消化液B进行短暂消化，过程相当简单，能节省实验人员的操作时间。按上述步骤，利用本试剂盒可分离培养狗脾脏原代细胞、狗脑原代细胞、狗肾原代细胞、兔软骨原代细胞、兔心脏细胞、兔肺细胞。可见，本试剂盒适用的器官是非常广泛的。对上述分离细胞进行台盼蓝鉴定细胞成活率实验，台盼蓝鉴定细胞成活率实验结果见表1，表I的数据表明与现有多种消化法比较，P < 0.01，统计学差异显著。说明本发明所获得的细胞成活率明显高于现有的胰蛋白酶消化法及胶原酶消化法，本发明消化分离所得的原代细胞成活率高。从形态学上，对传统胰蛋白酶消化、传统胶原酶消化法和本发明所分离的细胞的贴壁速度做比较。通过原代细胞出现贴壁集落及贴壁细胞汇合度达70%以上所需要的时间的比较(比较结果见表2)，结果证实利用本发明试剂盒所分离的原代细胞具有贴壁优势；与现有多种消化法比较，P < O. 01，统计学差异显著；说明本发明所分离的细胞的贴壁速度明显快于现有多种消化法。表I