专利名称：人参愈伤组织细胞冻干及超低温保存方法植物遗传多样性是保护人类生存环境和维持农业持续发展的一个关键因素，如何保存和利用物种多样性是当今社会面临的重大课题之一。植物组织培养技术与超低温保存技术在植物种质的长期保存中有重要作用，其中一些方法已开始进入应用。至今还未形成一种既在实验室常用，同时又能够大规模长期稳定地保存植物种质的技术手段，在一些技术环节上尚需进一步完善。而对于许多植物细胞，例如人参愈伤组织细胞，尚未有任何保存方法被提出。
本发明的目的之一是提供一种保存植物种质，特别是人参愈伤组织细胞的方法。本发明的另一目的是提供一种恢复植物种质，如人参愈伤组织细胞的方法。本发明的另一目的是提供一种保存的植物种质，如人参愈伤组织细胞。本发明的其它目的，体现在本发明内容的详细描述之中根据本发明，一种保存人参愈伤组织细胞的方法，包括1)在低温下，将人参愈伤组织细胞与保护剂混合，2)将混合物用冷冻干燥法或超低温法进行处理，3)保存处理后的混合物。本发明中采用的保护剂含有海藻糖，例如含有10％的海藻糖；根据需要，还可以添加蔗糖，例如添加10％的蔗糖。
根据本发明的一个实施方案，该保护剂含有10％海藻糖，5-10％DMSO和5-10％甘油。
本发明的一个优选实施方案中，该保护剂含有10％海藻糖，10％蔗糖，5-10％DMSO和5-10％甘油。
根据本发明的方法，人参愈伤组织细胞与保护剂混合前，可对该细胞进行预培养(加速传代、提高培养基渗透压、低温锻炼)。该保护剂与预培养细胞按1∶1-1∶3的体积比混合。
根据本发明一种恢复保存的细胞生长的方法，包括1)在40-60℃解冻保存的细胞，2)在培养基中培养解冻的细胞。
本发明还涉及一种保存的人参愈伤组织细胞。


图1是本发明人参愈伤组织细胞冻干及超低温保存方法的流程图。
1.本发明采用了冷冻干燥保存技术成功地保存了人参愈伤组织，具有操作简单、经济合理、可大批量保存冷冻材料优点。
2.本发明采用了超低温保存技术成功地保存了人参愈伤组织，具有操作简单、细胞冻存后恢复生长快优点。
3.本发明使用海藻糖作为植物细胞保存保护剂组分，作为植物种质资源的细胞保存保护剂，特别是人参愈伤组织细胞保存保护剂，目前还尚未有报道。
4.本发明提供了理想的玻璃化保护剂，海藻糖可以和甘油、DMSO、蔗糖、葡萄糖、鲜脱脂牛奶、脯氨酸中配制成复合保护剂并选择各组分最佳组合，使细胞更容易进入玻璃化状态。

下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例1待冻存材料的准备用液体悬浮培养，愈伤组织细胞以培养5～7天为宜；用固体培养，愈伤组织细胞以培养10～15天为宜。
实施例2保护剂配制取海藻糖、蔗糖、葡萄糖、鲜脱脂牛奶、脯氨酸分别配制1-6号保护剂，1、2、4、5、6号保护剂使用67V液体培养基溶解，3号保护剂直接使用鲜脱脂牛奶溶解。分别进行冻干及超低温保存。各浓度如下1号保护剂5％DMSO、10％甘油2号保护剂20％蔗糖、5％DMSO、10％甘油3号保护剂鲜脱脂牛奶、5％DMSO、10％甘油4号保护剂1.0M脯氨酸、5％DMSO、10％甘油5号保护剂10％海藻糖、5％DMSO、10％甘油6号保护剂10％海藻糖、10％蔗糖、5％DMSO、10％甘油实施例3预培养取待冻存材料在添加海藻糖、蔗糖、葡萄糖、鲜脱脂牛奶、脯氨酸成分的培养基中进行预培养，如按5、6号保护剂配方冻存细胞时，在添加5％DMSO和5％海藻糖的67V培养基中25℃预培养3d，再在5％DMSO和10％海藻糖67V培养基中4℃预培养1d。
实施例4冷冻干燥保存方法首先在冰浴上(0℃)保护剂与预培养细胞按1∶3的体积混合，其浓度为原浓度的1/4，缓缓加入，轻轻搅拌，10min后吸去液体。然后，在原浓度的保护剂中冰浴处理5min，最后以每冷冻管细胞和保护剂的总体积为1ml分装于西林瓶中，置冻干机内经预冻后，-28℃冷冻干燥22h，取出置-20℃冰箱中冻存。
实施例5超低温保存方法首先在冰浴上(0℃)保护剂与预培养细胞按1∶3的体积混合，其浓度为原浓度的1/4，缓缓加入，轻轻搅拌，10min后吸去液体。然后，在原浓度的保护剂中冰浴处理5min，最后，以每冷冻管细胞和保护剂的总体积为1ml分装于塑料冻存管中，以每分钟降1℃，至-50℃迅速投入液氮中冻存。
实施例6将实施例4中冻存后的细胞放入液体洗涤培养基中洗涤10min，洗涤时应逐渐稀释，液体洗涤培养基为预培养所用的67V液体培养基吸去洗涤液，液体洗涤培养基需置于0℃，洗涤后细胞转入预培养所用67V固体培养基上恢复培养。观察细胞恢复生长情况。细胞恢复生长良好。
实施例7将实施例5中冻存后的细胞在60℃水浴中1min快速化冻，把细胞团放入液体洗涤培养基中洗涤10min，洗涤时应逐渐稀释，液体洗涤培养基为预培养所用的67V液体培养基吸去洗涤液，液体洗涤培养基需置于0℃，洗涤后细胞转入预培养所用67V固体培养基上恢复培养。观察细胞恢复生长情况。细胞恢复生长良好。
本发明结果说明在本发明中观察到当使用1、2、3、4、5、6号保护剂，分别采用冷冻干燥和超低温法保存人参愈伤组织细胞，在经过0-6月保存期后，解冻再培养，均有部分细胞恢复生长。但是，使用5、6号保护剂按冻干和超低温法保存解冻后，细胞恢复期短，生长较快，在5-6周后便可观察到细胞分裂长出鲜嫩的新细胞，而且6号优于5号。而使用1-4号保护剂按冻干和超低温法保存解冻后，细胞恢复期较长，细胞存在不同程度褐化现象，生长较慢，在8-10周后，甚至更长时间，才能观察到细胞分裂长出鲜嫩的新细胞。本发明还观察到使用5、6号保护剂，同时按冻干和超低温法保存悬浮培养细胞，超低温法细胞恢复生长较冻干法快。
实验说明，采用含海藻糖的保护剂，用冻干法和超低温法冻存人参愈伤组织细胞是可行的，并且效果很好。
在观察细胞恢复生长时，由于目前最常用的TTC法和FDA法检测细胞活性，检测的只是细胞内某中酶的综合作用，而真正细胞活性，还需保持细胞结构的完整性，即使经TTC法和FDA法检测的相对存活率很高，但接种到恢复培养基上，可能根本不能恢复生长，说明细胞的内膜系统或其他结构已遭受不可逆的致命损伤。因此，在本发明中采用最直接、最有力、最具有实际价值的方法，既观察细胞冻存后恢复生长的比率为判定细胞存活指标。


本发明提供了人参愈伤组织细胞冻干及超低温保存的方法，其中使用海藻糖作为人参细胞冻干及超低温保存保护剂组分。本发明还涉及一种保存的人参愈伤组织细胞。采用本发明的方法，保护人参愈伤组织细胞的效果明显。