专利名称：一种利用魔芋粉诱导生产壳聚糖酶的方法壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的多糖，其水解产物壳寡糖的生物活性功能巨大，广泛应用于医药保健、食品、日化、农业等领域。目前国内外降解壳聚糖制备壳寡糖的方法主要有化学法与生物酶法，由于化学法降解效率与环境污染的限制因素，则主要以生物酶法为主，其中又以专一性酶——壳聚糖酶为主，是理想的大规模制备壳寡糖的主要酶。壳聚糖酶主要存在于微生物细菌和真菌中，如何使微生物中的壳聚糖酶高产量生产成为研究的主要方向。目前国内外生产微生物壳聚糖酶的方法主要是利用底物或底物类似物使其诱导表达，例如曲霉(Aspergillus sp. Y2K、Aspergillus sp. CJ22-326), 环状芽孢杆菌(B. circulans WL-12)，鞘胺醇单胞菌(Sphingomonas sp. CJ-5)，微球菌 (Microbacterium sp. 0U01)，爺病键刀菌(Fusarium solani)，苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis)和链霉菌(Sti^ptomyces sp. no. 6)都可用壳聚糖为碳源或诱导物诱导生产壳聚糖酶；多粘类芽孢杆菌(Paenikicillus fukuinensis D2)以胶链壳聚糖或氨基葡萄糖为底物生产壳聚糖酶；假单胞菌O^eudomonas sp. TKU015)和氨基戊酸梭菌 (Clostridium aminovalericum)以蟹壳甲壳素为诱导物生产壳聚糖酶；蜡状芽胞杆菌 (Bacillus cereus Si)和黏质沙雷菌(Serratia marcescensTKUOll)以虾和蟹的粉末为诱导物生产壳聚糖酶。以上诱导物或碳源中的壳聚糖、甲壳素和虾蟹粉末在水溶液中溶解度极低，以非均相状态存在，结果影响了微生物的吸收利用及壳聚糖酶的生成；而氨基葡萄糖虽然水溶性较好，但由于其生产成本价格高，在大规模生产壳聚糖酶工业上成为了主要的限制因素。
比较以上壳聚糖酶的生产方法，本发明提出了一种利用魔芋粉为诱导物生产壳聚糖酶的新技术。该技术具有原料来源易得、生产成本低廉、诱导物水溶性好，菌体对诱导物利用速率快，在体系中为均相、产酶能力稳定、酶活性高，具有较高的实用价值。该技术很好的丰富与补充了壳聚糖酶的生产途径。本发明所述生产壳聚糖酶技术方案内容如下1.使用的菌种本发明所使用的菌种是一种枯草芽孢杆菌，该菌株来源于中国典型培养物保藏中心，名称为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HD145，保藏号为CCTCC N0: AB 2010353。2.种子培养将CCTCC NO =AB 2010353号菌株，使用LB液体培养基为种子培养基进行培养。培养基经121°C 30min灭菌后，挑取一环斜面菌种，于37°C活化培养Mh，即得种子液。LB液体培养基的配方为蛋白胨1 %，酵母粉0.5%，氯化钠1 %，其余为水。3.以魔芋粉为诱导物生产壳聚糖酶(1)将37°C活化24h的CCTCC NO =AB 2010353号枯草芽孢杆菌接种于诱导培养基中，诱导培养基的配方由7% 14% 60-80目魔芋粉和LB液体培养基组成(w/v)，接种量为 2%,诱导温度31°C 37°C，pH为5. 5 9. 0，在摇床200rpm条件下进行诱导36 Mh，测定壳聚糖酶活性。最佳诱导参数诱导培养基的配方由12%魔芋粉和LB液体培养基组成(w/v)，接种量为2%，诱导温度34°C，pH为6. 5，在摇床200rpm条件下进行诱导42h。(2)诱导完成后，将培养液于4°C、10，OOOrpm离心lOmin，收集上清，得粗酶液。(3)壳聚糖酶水解壳聚糖实验取稀释100倍后的IOOul壳聚糖酶粗酶液，与浓度2%的胶体壳聚糖底物，于40°C 条件下反应30-60min，测定酶活性大小。壳聚糖酶活力单位(U)定义为每分钟释放Iug氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。本发明与目前所公开的文献相比，具有突出的实质性特点是1.本发明用于壳聚糖酶生产的诱导物为魔芋粉，相比于壳聚糖酶其他诱导物如氨基葡萄糖等，其来源易得，生产成本价格低廉；而相比于甲壳素、壳聚糖、虾蟹粉末等，魔芋粉易溶于水溶液，在溶液中为均相体系，这样更有利于菌体吸收利用，促进壳聚糖酶的诱导生产。2.本发明以魔芋粉为产壳聚糖酶的诱导物，确定了生产的最佳工艺条件，包括最佳诱导物浓度、诱导温度、诱导起始PH及最适诱导周期。优化的最佳工艺，其产酶量周期短，为42h，最适产酶温度为34°C，有利于工业化生产，且产酶条件易于控制。3.本发明以魔芋粉作为诱导物，与不加诱导物的对照进行生产比较，单位发酵液体积所含壳聚糖酶活力达到了 11762U/ml，说明魔芋粉能够大大地诱导CCTCC NO =AB 2010353号枯草芽孢杆菌分泌壳聚糖酶，水解壳聚糖的活性得到很大的提高，可以较好地应用于工业规模生产。图1不同魔芋浓度产生壳聚糖酶的活性比较图。图2不同诱导温度产生的壳聚糖酶比较图。图3不同诱导起始pH产生的壳聚糖酶比较图。图4不同诱导周期产生的壳聚糖酶比较图。，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。实施例一以60-80目魔芋粉作为诱导物，诱导生产壳聚糖酶。1.最适诱导物浓度的确定将37°C活化Mh的CCTCC NO =AB 2010353号枯草芽孢杆菌菌液分别接种于含有
4终浓度为0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14% (W/V)魔芋粉的LB液体培养基中，500ml三角瓶装LB液体50ml，接种量为2% (V/V)，于37°C、摇床200rpm条件下进行诱导产壳聚糖酶，其中魔芋粉诱导物浓度为0的体系作为对照。4 后测定壳聚糖酶活性，比较不同魔芋浓度产生壳聚糖酶的活性大小。结果见图1，说明与对照相比，在魔芋粉存在的情况下，有壳聚糖酶产生，且随着诱导物浓度的增加，产生的壳聚糖酶活性也增大，在魔芋粉浓度为12% 时，壳聚糖酶活性最大。2.最适诱导温度的确定配制系列12% (W/V)魔芋粉浓度的LB液体培养基，121 °C 30min灭菌后，按2% (V/V)的接种量接种37°C活化Mh的CCTCC NO =AB 2010353号枯草芽孢杆菌菌液，分别置于25°C、28 V、30°C、34。C、37。C及摇床200rpm条件下进行诱导产壳聚糖酶，比较不同诱导温度所产壳聚糖酶活性大小，根据酶活性大小确定最适诱导温度。结果见图2，说明在不同诱导温度下都产生了壳聚糖酶，而在34°C下产生的壳聚糖酶活性最大。3.最适诱导起始pH的确定分别用pH 为 5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5,9. 0 的缓冲液配制含 12% (W/
V)诱导物的LB液体培养基，12rC30min灭菌后，按2% (V/V)的接种量接种37°C活化Mh 的枯草芽孢杆菌菌液，于34°C、200rpm条件下进行诱导产壳聚糖酶，比较不同起始pH所产壳聚糖酶活性大小，根据酶活性大小确定最适起始PH。结果见图3，说明在不同的起始诱导 PH下都有壳聚糖酶产生，而pH为6. 5时产生的壳聚糖酶活性最大。4.最适诱导周期的确定用pH 6.5的缓冲液配制含12% (W/V)诱导物的LB液体培养基，121°C 30min灭菌后，按2% (V/V)的接种量接种37°C活化24h的枯草芽孢杆菌菌液，于34°C、200rpm条件下进行诱导产壳聚糖酶，分别在诱导时间为12h、18h、Mh、30h、36h、42h、48h、Mh、60h、66h、 7 测定所产壳聚糖酶活性大小，根据酶活性大小确定最适诱导周期。结果见图4，说明不同的诱导周期产生的壳聚糖酶活性大小不同，周期为4 生产的壳聚糖酶活性最高。实施例二壳聚糖酶的最优条件生产与壳聚糖的水解1.最适工艺条件下壳聚糖酶的生产综合以上确定的最适诱导物浓度、诱导温度、起始pH及诱导周期等工艺，进行壳聚糖酶生产。即用PH 6.5的缓冲液配制含12% (W/V)魔芋粉的LB液体培养基，于 121°C 30min灭菌后，按2%的接种量接种37°C活化24h的枯草芽孢杆菌菌液，于34°C、摇床 200rpm条件下进行诱导4 产壳聚糖酶，测定壳聚糖酶活性。同时，在最佳工艺条件下，将 37°C活化24h的CCTCC NO =AB 2010353号菌株枯草芽孢杆菌液接种于不含有魔芋粉的LB 液体培养基中，作为对照，4 后测定壳聚糖酶活性。2.壳聚糖酶粗酶液的分离以魔芋粉为诱导物的培养液与不加诱导物的对照培养液分别于4°C、10，OOOrpm 离心lOmin，收集上清，得粗酶液。3.壳聚糖酶水解壳聚糖取稀释100倍后的壳聚糖酶粗酶液IOOul与浓度2%的胶体壳聚糖底物，于40°C 条件下反应30-60min，加入一定量的DNS，煮沸5_10分钟，10，OOOrpm离心lOmin，去除不溶性物质，收集上清于波长MOnm下测定吸光指，换算出酶活性大小。壳聚糖酶活力单位(U)定义为每分钟释放Iug氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。结果魔芋粉诱导最佳条件下产壳聚糖酶活性为11762U/ml，而不含诱导物的对照中活性为221U/ml，魔芋粉诱导产酶活性提高了约53倍。


本发明公开了一种枯草芽孢杆菌利用魔芋粉生产高活力壳聚糖酶的方法。它是将CCTCC NOAB 2010353号枯草芽孢杆菌37℃活化24h，接种于诱导培养基中，以7％～14％60-80目魔芋粉为诱导物，产壳聚糖酶的最佳工艺为12％诱导物浓度、34℃诱导，诱导起始pH为6.5，42h诱导后离心收集上清，测定壳聚糖酶活力为11762U/ml，较无诱导物条件下酶活性提高了53倍，酶解工艺效率可大为提高。该工艺具有诱导物原料易得，成本低廉，生产操作简单，产酶能力稳定，壳聚糖酶活力高，具有较高的经济与实用价值。