专利名称：4－去二甲氨基四环素衍生物的应用的制作方法 四环素(Tetracyclines)被发现是广谱的抑菌药(即对格兰氏阳性和阴性细菌的生长都有抑制作用，但不能杀死细菌)，是由细菌Streptomyces aureofaciens产生的抗菌药，主要抗菌作用是通过抑制细菌的蛋白质合成。其抑菌作用机理是四环素分子进入细菌内结合到细菌核糖体的小亚基(即30S亚基)，直接影响了氨基酰-tRNA的反密码子与mRNA的密码子间的识别和配对，因而阻止细菌内的蛋白质合成，导致细菌停止生长繁殖。在人体内的免疫系统作用下，停止生长的细菌可被白细胞消灭，从而达到痊愈。四环素母核(四环结构)具有很强的脂溶性，是该类药物进入细菌细胞以及结合到菌细胞内靶结构(targeted components)所必须。四环素母核上的各基团对抗菌具有不同的作用，其中以4-二甲氨基(第四位的-N(CH3)2基团)的影响最大。过去的研究证明，除去4-二甲氨基的四环素分子(即4-去二甲氨基四环素)失去90％以上的抗细菌能力。病毒是一类无细胞结构的原生质颗粒，只由遗传物质(核酸)与蛋白质组成。病毒通过进入人体细胞后，借助细胞内的生物合成系统(如蛋白质与核酸的合成系统)进行自身复制，同时影响或破坏细胞的正常功能，甚至杀死宿主细胞以达到扩散和导致病理变化。很多病毒感染造成的组织破坏(如肝炎等)或增生(如性病湿疣等)，主要是因为被感染的宿主细胞表达了一些病毒抗原，导致局部的细胞免疫反应(炎症反应)，组织细胞破坏、纤维化、以及异常的细胞增生。过度的炎症反应是病毒感染造成组织器官丧失正常生理功能甚至患者的死亡的重要因素。由于目前尚无特效的抗病毒药物能进入细胞内阻止病毒的复制和抑制其毒性，故一般的治疗方法是控制过激的免疫反应(如类固醇激素)，促进被感染细胞的清理(如干扰素)，以及支持疗法(如营养疗法)等。但这些疗法的效果都不太理想。螺旋体是活动性很强的线状微生物，可寄宿于组织、血液、分泌液中。螺旋体常常引起消化道，泌尿、生殖道，呼吸道以及全身性的急慢性感染，其中由螺旋体引起的慢性胃炎是一种很常见的慢性胃病，病程长达数十年。螺旋体亦能侵入细胞，破坏细胞的功能甚至杀死寄宿细胞。螺旋体致病的机理之一，是宿主与病原体间的相互作用引发的炎症反应，包括免疫细胞的激活和炎症因子的释放(如TNF-α和IL-1β等)，以及白细胞的骤集和组织的破坏。对螺旋体病的治疗主要使用抗菌素(如青霉素治疗梅毒)。但有些螺旋体病却很顽固，例如由螺旋体引起的慢性胃炎、慢性子宫颈炎等，可能是由于这些螺旋体产生了耐药性，或者这些病原体已进入宿主细胞而逃避药物的攻击所致。分枝杆菌(包括支原体与依原体)是介于病毒与细菌之间的致病微生物。由于此类病原体能进入人体细胞，并且对一般的抗菌素容易产生耐药性，其造成的疾病往往是难以根治的慢性、反复发作性炎症和组织破坏。由于这类病原体进入宿主细胞后导致细胞表面抗原的改变，被感染的细胞与免疫细胞的相互作用引起免疫反应，造成局部组织炎症细胞的骤集(主要是白细胞的浸润)，甚至形成结节，一般的药物很难有效地进入结节组织或进入被感染的宿主细胞并杀死这类病原体，是造成此类疾病慢性和反复发作性的主要原因之一。对支原体与依原体病的治疗通常使用抗菌素(如乙酰螺旋霉素等)。然而，对于某些产生耐药性的结核病必须使用毒性很大的二线药物(如利福平等)。因此，对该类疾病的治疗需要多种药物交替使用以减少其耐药性的产生。综上所述，病毒、螺旋体和分枝杆菌(包括支原体与依原体)等除了存在于细胞外直接激活宿主的免疫系统造成炎症反应外，还能侵入宿主细胞并影响细胞的代谢与功能，以及通过改变被感染细胞的表面抗原而间接地引发炎症反应。在这些病原体引发的炎症反应和组织破坏过程中，被激活的宿主细胞(即炎症细胞)释放的炎症因子(如TNF-α和IL-1β等)和基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP，如胶原酶)起着关键性的作用。理想的药物除了毒性小和能够减轻炎症反应外，还能抑制或杀死病原体，特别是能进入宿主细胞消灭病原体。
本发明的目的就是提供一种对病毒(包括引起SARS的冠状病毒)、螺旋体和分枝杆菌(包括支原体与依原体)引起的感染具有防治作用的4-去二甲氨基四环素衍生物的应用。本发明的目的是这样实现的4-去二甲氨基四环素衍生物制备抗SARS病毒的药物中的应用。
本发明的目的可以这样实现4-去二甲氨基四环素衍生物制备抗病毒的药物中的应用。
本发明的目的还可以这样实现4-去二甲氨基四环素衍生物制备抗螺旋体的药物中的应用。
本发明的目的也还可以这样实现4-去二甲氨基四环素衍生物制备抗分枝杆菌的药物中的应用。
本发明的目的又可以这样实现4-去二甲氨基四环素衍生物制备抗毒血症的药物中的应用。
本发明的目的也可以这样实现4-去二甲氨基四环素衍生物制备抗皮肤搔痒症的药物中的应用。
本发明的目的还可以这样实现一种用于治疗SARS的药用组合物，它含有有效量的权利要求1～6所述的4-去二甲氨基四环素衍生物和药用载体。
本发明的4-去二甲氨基四环素衍生物具有图1和表2所示的分子结构。
由于4-二甲氨基具有的亲水性作用，从而使4-去二甲氨基四环素衍生物的脂溶性(或蔬水性)与四环素相比显著增加，同时也增加了它们的进入细胞的能力(图2、表1)。4-去二甲氨基仙环素(4-dedimethylamino sancycline)在母核的第四位失去二甲氨基(亲水基团)和第六位失去羟基(亲水基团)和甲基，其脂溶性和进入细胞的能力均大大增加(表2、表1)，这是该药进入细胞发挥作用的重要特点。4-去二甲氨基四环素衍生物的抗真菌作用与它们的高脂溶性有关，因为真菌细胞壁结构较一般的细菌的细胞膜(或夹膜)结构更复杂，如真菌的几丁质(Chitin)在真菌细胞壁功能中具有重要的作用，对药物进入真菌细胞的影响很大。而4-去二甲氨基四环素衍生物能大量进入真菌细胞，其抗真菌作用很可能是通过结合并抑制细胞内的细胞器(如线粒体等)及某些酶的功能得以实现。
4-去二甲氨基四环素衍生物还有一个重要的生物学作用，即对金属蛋白酶(Metalloproteinase，MP)的抑制作用。该类衍生物对MP的抑制被广泛认为具有抗炎作用，因为在炎症中宿主细胞与病原体(如细菌)释放的金属蛋白酶(如胶原蛋白酶等)对炎症组织蛋白的降解作用是导致组织破坏和病原体扩散的重要因素。同时，某些金属蛋白酶也是一些白介素(如肿瘤坏死因子TNF-α)生成和释放的关键因素。
4-去二甲氨基四环素衍生物作为抗病毒、抗螺旋体、和抗分枝杆菌(包括支原体和依原体)药的依据，主要包括两方面(a)此类衍生物的抗炎作用和抑制金属蛋白酶对组织蛋白质的降解作用(图3，图4)；(b)此类衍生物具有的高度脂溶性和穿透组织细胞膜的能力(表1、图2)，可能直接进入被感染细胞抑制甚至杀死病原体，从而达到治疗(或根治)作用。
某些4-去二甲氨基四环素衍生物可有效抑制培养的人单核细胞(Monocyte)在脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激下产生TNF-α，白介素IL-1β等炎症因子(图4)，这些作用都能有效地降低人体对病原体及其毒素(如LPS)的过激炎症反应，从而减轻炎症组织的破坏程度，有利于炎症组织的恢复。
由于4-去二甲氨基四环素衍生物能有效地进入细胞(图2)并抑制其中的一些细胞器与某些酶的功能，这就有利于这种药物抑制病毒复制或清除细胞内病毒，从而达到抗病毒作用。
4-去二甲氨基四环素衍生物由于能抑制宿主细胞释放炎症因子(如TNF-α和IL-1β等)和基质金属蛋白酶(MMP)活性，从而大大减轻螺旋体引起的炎症反应和组织破坏。另外，4-去二甲氨基四环素衍生物具有高脂溶性和容易穿透进入细胞的特点，也可能具有抑制螺旋体生长甚至杀死该微生物的作用，因而具有治疗由螺旋体引起的疾病的药用价值。实验显示，与4-去二甲氨基仙环素保温(37C)12小时后，100％的螺旋体(Spirocheteborreba kurgdorferi)被消灭，这说明四环素衍生物可能具有杀死该螺旋体的作用(图5)。
该类四环素衍生物通过抑制炎症因子(TNF-α，白介素IL-1β等)的产生而有效地减轻分枝杆菌造成的过激免疫反应(急性期)和慢性炎症反应，同时也可能通过渗入结节组织或进入感染的细胞内抑制病原体的生长繁殖。
该类四环素衍生物除了有效地抑制炎症因子释放外，其有效地抑制金属蛋白酶(如MMP)对组织蛋白的降解作用，是减轻或熄灭由炎症引发的皮肤搔痒症的机理之一。
目前在我国发现并流行的非典型性肺炎是由冠状病毒引起的急性呼吸系统综合症(SARS)。该病的严重性在于病毒所引起的过度的急性炎症反应(如毒血症引起体内大量炎症因子释放，特别是TNF-α和IL-1β等)，导致肺组织严重破坏，造成患者呼吸困难甚至死亡。类固醇激素对于减轻该病对肺部的破坏程度和降低死亡率有明显效果，就是利用类固醇激素的抗炎作用。但由于类固醇激素同时抑制病人的免疫系统，其副作用不言而喻。与类固醇激素不同，4-去二甲氨基四环素衍生物的抗炎作用不是通过抑制免疫系统，而是直接抑制炎症因子的释放，从而减少炎症细胞(主要是被激活的白细胞)的化学趋化作用(即由炎症因子引导白细胞向炎症部位转移)，和炎症细胞的浸润。此外，4-去二甲氨基四环素衍生物能非常有效地抑制组织基质金属蛋白酶的活性(MMP，白细胞破坏后能大量释放此类酶导致组织蛋白质的降解)，直接减少炎症组织的破坏，必然对SARS具有治疗作用。同时，该类药物还可能进入被病毒感染的宿主细胞，抑制病毒的复制甚至杀死病毒，对于减少该病的传染性具有巨大的应用潜力。
四环素衍生物是以四环素母核为基础经化学改造而衍生的一系列化合物，计有几千种，其中有利用价值的极少数。本发明是基于如下事实4-去二甲氨基四环素衍生物丧失全部或部分抗细菌功能，其分子的脂溶性增加(穿透细胞膜功能增加)以及抗真菌、抗金属蛋白酶功能也显著增加。使用4-去二甲氨基四环素类药，一方面可防止抗细菌药通常引起的抗药性出现而导致反弹性细菌感染或/和其他微生物(如真菌)的失衡性感染(因为细菌对其它微生物有抑制作用，当正常细菌被严重抑制后其它病原体失去制约而大量繁殖而致病)，另一方面可利用这些衍生物的抗炎和抗金属蛋白酶作用减轻病毒，螺旋体和分枝杆菌引发的炎症反应和组织破坏，以及利用其高脂溶性特点进入细胞，干扰或终止上述病原体的繁殖或复制，以达到可能抑制或杀死这些病原体(包括在细胞内)的目的。故本发明专利只限于4-去二甲氨基四环素衍生物，以及由这些衍生物所组成的药用载体。对于上述所列致病微生物的应用(包括防治方面的应用)，这类药物具有双管齐下的治疗作用(即既可抑制病原体繁殖或复制，又抑制病原体所引发的炎症反应)，和防止细菌抗药性反弹感染的特点。
由于上述所列病原体有入侵细胞的能力，导致一般药物难以彻底治疗这类疾病，例如尖锐性湿疣(病毒感染)，某些慢性胃炎(胃炎螺旋体)，以及依原体或支原体引起的非典型性肺炎等，目前对这类疾病的治疗并无特效药物，而且可供治疗使用的药物种类很少。故本发明为这些疾病可能提供一个全新的，高效的防治手段，不仅具有巨大的商业潜力，而且也具有深远的医学研究意义。
本发明1、对病毒引起的局部与全身性感染(a)病毒性赘生物[如扁平疣，尖锐性湿疣(性病湿疣)，肠道息肉等]，(b)病毒性疱疹(如带状疱疹，口腔或皮肤病毒性疱疹等)，(c)全身性病毒性感染(如病毒性肺炎，包括目前在中国发现的烈性传染病SARS，病毒性脑膜炎等)；
2、对螺旋体引起的局部与全身性感染局部感染(如呼吸道、消化道、生殖和泌尿道的螺旋体感染)，全身性感染(如经血液扩散的螺旋体感染等)；3、对分枝杆菌引起的局部与全身性感染(如由支原体或依原体引起的皮肤、呼吸道、消化道、泌尿和生殖道感染，或全身性分枝杆菌感染等)；4、对毒血症(如细菌、病毒感染引起的毒血症、如目前在中国发现的烈性传染病SARS)；5、对炎症引起的皮肤搔痒症(如神经性、感染性、接触性皮炎等)；都具有防治作用，即抗病毒、抗SARS、抗螺旋体、抗分枝菌的作用。
当作外用药时，a.其有效药量(重量百分比)0.01～5％，脂溶性介质95～99.99％，；b.其有效量(重量百分比)0.01～5％，乳化剂0.0001～0.5％，水94.5～99.99％。
当作内服药时，其有效药量(重量百分比)90～99％，糖衣1～10％。
当作注射剂时，a.其有效药量(重量百分比)0.1～10％，氯化钠0.9～1％，水89～99％；b.其有效药量(重量百分比)0.1～10％，葡萄糖5～10％，水80～94.9％；c.其有效药量(重量百分比)0.1～10％，氯化钠0.9～1％，葡萄糖5～10％，水79～94％。


图1为本发明四环素衍生物分子的结构示意图，图2为本发明的4-去二甲氨基四环素衍生物进入人单核细胞内，图3为本发明的HPLC图谱，图4为本发明在脂多糖(LPS)引发的炎症因子被抑制的图谱，图5为本发明在螺旋体被消灭的图谱。

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详述如图1所示，当R1R2R3R4R5R6R7是不同的基团时，其四环素衍生物分别是如表2所列。
如图2所示，激光电镜扫描图谱显示，4-去二甲氨基仙环素与人单核细胞悬液保温2小时后，被发现大量进入细胞内(细胞中的荧光为该药物所产生)。
如图3所示，HPLC图谱显示，A从酵母菌提取的金属蛋白酶能水解人工合成的八肽(DNP-OP，类似人胶原蛋白肽链)，B加4-去二甲氨基仙环素后，该酶的水解作用受到显著抑制。
如图4所示，在脂多糖(LPS)刺激下人单核细胞释放肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素-1(IL-1β)受4-去二甲氨基仙环素(C3)的抑制。(A当C3＝5，10μg/ml时对TNF-α的抑制；B当C3＝2.5，5.0μg/ml时对IL-1β的抑制；Dxy为多思环素；Cx为未知结构的四环素衍生物)。
如图5所示，螺旋体(Spirochete borreba kurgdorferi)与4-去二甲氨基仙环素(C3)保温(37℃)24小时后，在显微镜下观察每视野的活螺旋体数量从8下降到0，其IC50小于1μg/ml。Cx为未知结构的四环素衍生物。
实施例1外用药时其含有效药量0.01％，脂溶性介质凡士林99.99％，常规工艺制成外用达到抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌作用。
实施例2外用药时其含有效药量5％，脂溶性介质硬脂酸甘油酯95％，常规工艺制成外用达到抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌作用。
实施例3外用药时其含有效药量0.05％，脂溶性介质月桂醇硫酸钠99.95％，常规工艺制成外用达到抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌作用。
实施例4外用药时其含有效药量1％，脂溶性介质白凡士林99％，常规工艺制成外用达到抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌作用。
实施例5外用药时其含有效药量2％，脂溶性介质芘麻油98％，常规工艺制成外用达到抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌作用。
实施例6外用药时其含有效药量3％，脂溶性介质液态石腊97％，常规工艺制成外用达到抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌作用。
实施例7外用药时其含有效药量4％，脂溶性介质羊毛脂96％，常规工艺制成外用达到抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌作用。
实施例8外用药时其含有效药量2.5％，脂溶性介质月桂醇硫酸钠97.5％，常规工艺制成外用达到抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌作用。
实施例9外用药时其含有效药量0.01％，乳化剂磷脂0.0001％，水99.9899％，常规工艺制成外用达到抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌作用。
实施例10外用药时其含有效药量5％，乳化剂硬脂酸钠0.05％，水94.95％，常规工艺制成外用达到抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌作用。
实施例11内服药时其含有效药量为90％，糖衣10％，常规工艺制成，服用而达到抗病毒、抗SARS、抗螺旋体、抗分枝菌的作用。
实施例12
内服药时其含有效药量为99％，糖衣1％，常规工艺制成，服用而达到抗病毒、抗SARS、抗螺旋体、抗分枝菌的作用。
实施例13注射用药含有效药量0.1％，氯化钠1％，水98.9％，常规工艺制成，注射后达到抗病毒、抗SARS、抗螺旋体、抗分枝菌的作用。
实施例14注射用药含有效药量10％，氯化钠0.9％，水89.1％，常规工艺制成，注射后达到抗病毒、抗SARS、抗螺旋体、抗分枝菌的作用。
实施例15注射用药含有效药量0.1％，葡萄糖10％，水89.9％，常规工艺制成，注射后达到抗病毒、抗SARS、抗螺旋体、抗分枝菌的作用。
实施例16注射用药含有效药量10％，葡萄糖5％，水85％，常规工艺制成，注射后达到抗病毒、抗SARS、抗螺旋体、抗分枝菌的作用。
实施例17注射用药含有效药量0.1％，氯化钠1％，葡萄糖10％，水88.9％，常规工艺制成，注射后达到抗病毒、抗SARS、抗螺旋体、抗分枝菌的作用。
实施例18注射用药含有效药量10％，氯化钠1％，葡萄糖10％，水79％，常规工艺制成，注射后达到抗病毒、抗SARS、抗螺旋体、抗分枝菌的作用。
在实施例1～18中，因为病毒感染会引起炎症因子如TNF-α、IL-1β等白介素和金属蛋白酶的释放，导致炎症反应以及组织的破坏(如SARS)，因此，验证4-去二甲氨基四环素衍生物能抑制病毒感染时TNF-α、IL-1β的释放和金属蛋白酶的活性，即表示其能减轻病毒感染时的病理变化，即减轻病毒感染时的临床症状；加入4-去二甲氨基四环素衍生物与分枝杆菌一起培养，可验证4-去二甲氨基四环素衍生物是否抑制该分枝杆菌的生长；加入4-去二甲氨基四环素衍生物与螺旋体一起培养，再用显微镜观察活的螺旋体数量减少情况，可验证4-去二甲氨基四环素衍生物是否抑制该病原体的生长。
表14-去二甲氨基四环素衍生物的脂溶性和进入人单核细胞的情况。
表24-去二甲氨基衍生物的重要基团分布。
表1、4-去二甲氨基四环素衍生物的脂溶性和进入人单核细胞的情况*名称脂溶性[Log(Poctanol)]进入细胞(μg/106cells)Cx -0.03131 1.13391C3 1.1372632.84602C4 0.2547182.40653四环素 -0.16573 0.95218多思环素 -0.0972 1.65336*Cx未知结构四环素衍生物；C34-去二甲氨基仙环素；C44-去二甲氨基氯四环素。
表2、几种4-去二甲氨基四环素衍生物的重要基团分布(R的位置见图1)名称R基团4-去二甲氨基四环素 R1＝-CONH2，R4＝-OH，R5＝-CH3，R2R3R6R7＝-H4-去二甲氨基氯四环素R1＝-CONH2，R4＝-OH，R5＝-CH3，R6＝-Cl，R2R3R7＝-H4-去二甲氨基氧四环素R1＝-CONH2，R3R4＝-OH，R5＝-CH3，R2R6R7＝-H4-去二甲氨基多思环素R1＝-CONH2，R3＝-OH，R5＝-CH3，R2R4R6R7＝-H4-去二甲氨基仙环素 R1＝-CONH2，R2R3R4R5R6R7＝-H4-去二甲氨基小环素 R1＝-CONH2，R6＝-N(CH3)2，R2R3R4R5R7＝-H2-羟甲基-4-去二甲氨基四环素 R1＝-CONH-CH2OH，R4＝-OH，R5＝-CH3，R2R3R6R7＝-H2-甲基-4-去二甲氨基四环素R1＝-CONH-CH3，R4＝-OH，R5＝-CH3，R2R3R6R7＝-H2-吡咯甲基-4-去二甲氨基四环素R1＝-CONH-CH2-N R4＝-OH，R5＝-CH3，R2R3R6R7＝-H4-去二甲氨基-9-氨基仙环素R1＝-CONH2，R7＝-NH3，R2R3R4R5R6＝-H4-去二甲氨基9-氨基多思环素 R1＝-CONH2，R3＝-OH，R5＝-CH3，R7＝-NH3，R2R4R6＝-H


本发明涉及一种4－去二甲氨基四环素衍生物制备抗SARS、抗病毒、抗螺旋体、抗分枝杆菌、抗毒血症、抗皮肤搔痒症等的药物中的应用；一种用于治疗SARS的药用组合物，它含有有效量的权利要求1～6所述的4－去二甲氨基四环素衍生物和药用载体；本发明具有对病毒(包括引起SARS的冠状病毒)、螺旋体和分枝杆菌(包括支原体与依原体)引起的感染具有防治作用的4－去二甲氨基四环素衍生物的应用的优点。