专利名称：富含多糖多酚植物高质量细胞核dna的提取方法随着高通量测序技术的快速发展和测序成本大幅度的降低，基因组测序和重测序已成为植物基因组学研究的一个重要内容。高质量细胞核DNA(脱氧核糖核酸)获取是高通量测序的基础。目前，用于高通量测序或者构建基因组文库的细胞核DNA —般采用SDS法 (十二烷基苯磺酸钠)、CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)或基于硅胶基质的吸附离心柱等方法提取。对于植物的DNA提取，以上几种方法均被广泛使用。但由于植物特别是水生植物、木本植物生长过程中产生大量多糖、多酚等次生代谢产物,严重困扰DNA的提取。采用常规DNA提取方法无法获得纯度高、质量优的细胞核DNA。此外，植物多糖、多酚的组分与含量随植物生长周期和环境条件以及物种而异，目前尚缺乏一种适用于绝大多数植物种类或组织材料细胞核DNA提取方法。高通量测序技术对于DNA的完整性以及核外DNA (如线粒体DNA和叶绿体DNA等) 的污染极为敏感，这是因为多酚等物质会氧化基因组DNA双链，造成基因组完整性的破坏以及序列长度的降低，多糖类物质和DNA的理化性质接近，容易造成核酸的共沉淀而使得率降低；核外DNA的存在造成测序有效覆盖度的降低，不久大大增加研究成本，而且严重干扰结果的分析。可见，不管对于de novo (首次)测序或重测序，多酚氧化和核外DNA的存在都会严重干扰基因组序列的拼装。为了去除如叶绿体DNA之类的核外遗传物质，现有的几种基因组提取方法均需要对植物材料进行黄化处理，但黄化处理的负面作用是造成材料的生长状态变差，往往又会诱导次生代谢产物如多酚增多，从而加重多酚氧化的程度。而且即便经过黄化处理,也很难去掉高等植物细胞中线粒体DNA的污染。对于高大的多年生木本植物以及多数水生植物而言，很难获得大量的黄化幼嫩叶片；因此，开发一种能够利用植物在自然生长条件下的叶片等组织为材料，进行高纯度、高质量细胞核DNA的提取方法，已成为当前果树、水生植物等经济作物基因组学研究的迫切需要。发明内容本发明的目的就在于克服现有植物基因组核酸提取方法存在的缺点和不足，提供一种富含多糖多酚植物高质量细胞核DNA的提取方法。本发明的目的是这样实现的为了适应次生代谢旺盛、植株体积较大和不便于预处理的木本或水生材料，本方法采取了全新的预处理步骤，先粗分离材料的细胞核。一、富含多糖多酚植物高质量细胞核DNA的提取(简称方法)具体地说，本方法包括下列步骤①液氮研磨植物材料(避免过度研磨)；
②HB抽提缓冲液重悬，涡旋混匀后过滤；
③离心，沉淀使用抽提缓冲液I洗三次，重悬；
④使用抽提缓冲液2，RnaseH, 65摄氏度水浴30分钟；
⑤氯仿-异戊醇抽提一次，异丙醇沉淀；
⑥冰预冷75%乙醇洗沉淀1-2次，TE溶解。
其中①到③为预处理步骤(分离植物材料的细胞核)。
工作机理
由于细胞核直径较大，和线粒体、叶绿体等细胞器的沉降系数差异较远，比较易于离心分离；同时由于多糖、多酚等次生代谢产物主要位于液泡、线粒体、过氧化物酶体乃至细胞质中，在分离细胞核的过程中被洗去，而其他的细胞整体裂解方法中，次生代谢产物无法去除，对后续的核酸提取步骤产生干扰。因而本方法尤其适用于多糖、多酚等次生代谢产物含量较高的植物材料，此类杂质的存在和含量对所抽提得到的基因组DNA的产量与质量均无明显的影响。
二、用途
适用于广泛植物种的健康组织，或细胞结构较完整的冻存组织，特别适合于后续研究为高通量测序等用途。
本发明具有下列优点和积极效果
①预处理步骤能有效去除线粒体、叶绿体等细胞器DNA ；
②避免植物材料中大量存在的多糖、多酚等次生代谢产物对核酸提取步骤产生干扰；
③抽提缓冲液I和2中均加入山梨醇，它能调节渗透压，在预处理过程中可防止细胞核结构的过早破裂，从而减少基因组DNA损失，提高DNA产量。


图I是本方法的流程图；图中
I到3为预处理步骤，分离细胞核；
4为抽提步骤，从细胞核中抽取基因组DNA ；
5为DNA的纯化和沉淀回收步骤；
6为DNA的最终回收步骤。
图2是本方法所得的苹果基因组DNA电泳图；其中
M-分子量标准品(最大电泳条带约15000碱基对)；
A、B、C-本方法所提取的第1、2、3苹果基因组DNA;
D-普通CTAB法所提取的苹果基因组DNA。
缩略语
SDS Sodium Dodecyl Sulfate,十二烧基苯横酸钠；
CTAB Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide,十六烧基三甲基溴化铵；
PEG6000 PolyEthlene Glycol 6000,聚乙二醇 6000 ;
EDTA EthyleneDiamine Tetraacetic Acid,乙二胺四乙酸；
Tris :Tris (Hydroxymethyl) aminomethane,三轻甲基氨基甲烧；
RNase H :RNA 酶 H。

下面结合附图和实施例详细说明
一、采用本方法提取苹果的基因组DNA的实施例
I、步骤如下
①使用液氮速冻，研钵和研棒研磨约20克苹果叶片(或冻存叶片)，迅速转移到500毫升冰预冷烧杯中。
②使用200毫升冰预冷的HB抽提缓冲液(使用前加￠-巯基乙醇至总体积的0. 1%，体积/体积比)浸泡，用磁力搅拌泵涡旋混匀20分钟，抽提体系用冰降温。
使用双层粗纱布和漏斗过滤，滤过液收集到250毫升离心管中(也可使用50毫升离心管)。
③使用固定角转子在冷冻离心机上以1，800g，4摄氏度离心20分钟。
弃去上清，将细胞核沉淀用少量预冷抽提缓冲液I轻柔重悬。补足预冷抽提缓冲液I体积到30毫升，轻柔混匀后转到50毫升离心管内，重复此沉淀-重悬步骤3次(l，800g，4摄氏度离心15分钟)。
④小心弃去上清，将沉淀用5毫升抽提缓冲液2和10微升RNase H(10mg/mL)重悬。
水浴65摄氏度保温30分钟。
⑤加入5毫升氯仿抽提液(氯仿异戊醇=24 1，体积/体积比)，轻柔颠倒混匀。
室温离心，12，000g，15分钟。
吸取上清液4. 5毫升，加入冰预冷异丙醇3毫升。
混匀，放置于-20度沉淀I小时。
4度离心。12，OOOg 15分钟。
⑥弃去上清，加入5毫升冰预冷75%乙醇(75毫升无水乙醇加蒸馏水至总体积100毫升)洗1-2次，4度离心，12，OOOg 5分钟。
弃去上清，室温晾干半小时，加入500微升灭菌TE溶解。
2、所使用的缓冲液配方
I) HB抽提缓冲液
0. 5M sucrose (鹿糖)；
IOmM Tris-HCl(pH7. 0)；
80mM KCl ；
IOmM EDTA ；
ImM spermidine (亚精胺，临用前加入)；
Imm spermine (精胺，临用前加入)。
2)抽提缓冲液I
50mm Tris-HCl(pH8. 0)
5mm EDTA (用 NaOH 调节 pH 值至 8. 0)
350mm sorbitol (山梨醇)
100g/L PEG60000
0. I %巯基乙醇(体积/体积比，临用前加入)
3)抽提缓冲液2:
50mm Tris-HCl (pH8. 0)
5mm EDTA (用 NaOH 调节 pH 值至 8. 0)
350mm sorbitol (山梨醇)
lOg/L SDS
710mm NaCl
0. I % CTAB
0. I %巯基乙醇(体积/体积比，临用前加入)。
4) TE 缓冲液
10mm Tris-HCl (pH8. 0)
Imm EDTA (用 NaOH 调节 pH 值至 8. 0)。
5) 75% 乙醇
75%为乙醇在溶液中所占的体积比，具体配制方法为75毫升无水乙醇加蒸馏水至总体积100晕升。
3、检测结果
(以下为检测步骤，不属于本方法的提取步骤):
取2微升所提取的DNA在0. 8%琼脂糖凝胶上电泳，比电压降约5伏/厘米，电泳 I小时后用溴化乙啶染色，在凝胶成像系统中用紫外线照射成像。所得DNA分子量完整(> 15，000碱基对)，对照分子量标准品，估计其浓度约50纳克/微升，如图2所示，电泳带型清晰锐利，无明显拖尾，可见较好的去除了蛋白和多糖等杂质。使用紫外分光光度计测得所得DNA在260纳米和280纳米的吸光度比值约等于I. 9，说明本方法所得基因组DNA具备较高纯度。
二、采用本方法提取李树、桃子以及猕猴桃的基因组DNA均获得成功，步骤与结果类上述，从略。


本发明公开了一种富含多糖多酚植物高质量细胞核DNA的提取方法，涉及植物功能基因组学领域。本发明包括下列步骤①液氮研磨植物材料；②HB抽提缓冲液重悬，涡旋混匀后过滤；③离心，沉淀使用抽提缓冲液1洗三次，重悬；④使用抽提缓冲液2，RnaseH，65摄氏度水浴30分钟；⑤氯仿-异戊醇抽提一次，异丙醇沉淀；⑥冰预冷75%乙醇洗沉淀1-2次，TE缓冲液溶解。本发明预处理步骤能有效去除线粒体、叶绿体等细胞器DNA；避免植物材料中大量存在的多糖、多酚等次生代谢产物对核酸提取步骤产生干扰；适用于广泛植物种的健康组织，或细胞结构较完整的冻存组织，特别适合于后续研究为高通量测序。