产糖苷酶的黑曲霉及其应用于提高虎杖中白藜芦醇含量制作方法_应国清专利（糖苷酶,黑曲霉,应用）-早鸽网

产糖苷酶的黑曲霉及其应用于提高虎杖中白藜芦醇含量制作方法

专利名称

产糖苷酶的黑曲霉及其应用于提高虎杖中白藜芦醇含量制作方法
发明者

应国清, 梅建凤, 王琼芝, 王鸿, 罗溜彬, 许南儿
公开日

2012年7月4日
申请日期

2011年11月22日
优先权日

2011年11月22日
申请人

浙江工业大学
文档编号

C12N9/24GK102533565SQ20111037476
关键字

糖苷酶黑曲霉应用提高
权利要求

1.黑曲霉(Aspergullisniger) XW-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No =M 2011；358，保藏日期2011年10月19日2.如权利要求1所述的黑曲霉XW-2，其特征在于所述黑曲霉XW-2的18srRNA的部分核苷酸序列如下CCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCT TCGGAGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTGGGTGCGGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCAGA GAGGGTGAGAATCCCGTCTTGGGCGGGGTGTCCGTGCCCGTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAAT GCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATC GAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACT CGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTC AAAGGCCCCTGGAATGTAGTACCCTCCGGGGTACCTTATAGCCAGGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAAC GCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAACGAC3.如权利要求1所述的黑曲霉XW-2在微生物发酵制备糖苷酶中的应用4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为将黑曲霉XW-2菌种接种至产酶培养基中，25 30°C培养48 72h，获得含有糖苷酶的发酵液5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述产酶培养基组成如下蔗糖40 60g/L、 NH4Cl 2 4g/L、K2HP04 0.5 lg/L、KCl 0. 3 0. 5g/L、MgS04 0. 3 0. 5g/L、FeS04 0 . 02 — 0. 05g/L，溶剂为水，pH 6. 5 7. 56.如权利要求1所述的黑曲霉XW-2在生物转化法提高虎杖中白藜芦醇含量中的应用7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为将黑曲霉XW-2菌种接种至产酶培养基中，25 30°C培养48 72h，发酵液经固液分离获得糖苷酶粗酶液，往粗酶液中加入 50 150g/L的虎杖粉，于25 35°C、200 400r/min振荡条件下进行转化8 24h后，过滤除去粗酶液，虎杖粉经烘干备用8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述产酶培养基组成如下蔗糖40 60g/L、 NH4Cl 2 4g/L、K2HP04 0.5 lg/L、KCl 0. 3 0. 5g/L、MgS04 0. 3 0. 5g/L、FeS04 0 . 02 — 0. 05g/L，溶剂为水，pH 6. 5 7. 5
技术领域

本发明涉及一株糖苷酶产生菌——黑曲霉(Aspergullis niger) XW-2，及其在生物转化法提高虎杖中白藜芦醇含量中的应用背景技术中药材虎杖为蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum)的干燥根茎，主要有效成分为二苯乙烯类和蒽醌类化合物，前者包括虎杖苷和白藜芦醇，虎杖苷也称为白藜芦醇苷白藜芦醇是一种活性多酚类物质，具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和防治冠心病、缺血性心脏病、高血脂症等疗效，白藜芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一干燥虎杖根茎中白藜芦醇含量仅为0. 0.2%，而虎杖苷的含量明显高于白藜芦醇，含量约为2%左右虽然虎杖苷可在人的肠道中被一些微生物降解而转化为白藜芦醇，发挥其药理作用，但转化率较低，大部分虎杖苷不能充分发挥其药理作用采用化学或生物的方法，可以将虎杖苷转化为白藜芦醇采用酸碱水解可将虎杖苷转化为白藜芦醇，但酸碱容易破坏白藜芦醇的结构，并生成大量的异构体，造成分离纯化困难，转化率，实际应用的可行性不大生物法则可以专一性地实现这一转化，微生物产生的糖苷酶可以将虎杖苷中的葡萄糖残基水解，从而使得虎杖苷转化为白藜芦醇相比之下，生物转化法将虎杖苷转化为白藜芦醇，具有结构不被破坏，转化率高、反应条件温和等优点ο目前，有关采用生物转化法提高虎杖中白藜芦醇含量的国内专利公开的方法有三种(1)将新鲜的虎杖打浆，在一定的温度和搅拌转速下自然发酵酶解此法简单，但转化率低、易污染，在生产过程中新鲜虎杖不便于保存，大批量生产有困难；( 在虎杖粉或虎杖粗提物中加入纤维素酶等糖苷酶，在一定的温度下酶解此法专一性好，但使用商品酶的成本高，对虎杖苷进行粗提，操作较繁琐，效率低；C3)虎杖粉碎后加水，接种某种微生物，或不接种的自然发酵此法具有方法简单，成本低优点，但微生物菌体及其代谢产物留在中药材中，影响药材的品质发明内容本发明提供一株糖苷酶产生菌——黑曲霉(Aspergullis niger) XW-2，及其在生物转化法提高虎杖中白藜芦醇含量中的应用，较好地克服了现有提高虎杖中白藜芦醇含量方法的缺点，具有成本低、周期短和经处理的虎杖品质高等优点本发明采用的技术方案是黑曲霉(Aspergullis niger)XW-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No =M 2011；358，保藏日期2011年10月19日本发明所述黑曲霉XW-2由土壤中分离，经过筛选得到的优良菌株所述黑曲霉XW-2的菌落特征如下在斜面或平板培养基上，30°C条件下，培养2天，菌落即可长满菌落初期为白色绒毛状，之后逐渐呈黑色，产生大量黑色分生孢子显微镜下观察到分生孢子头呈黑褐色放射状，分生孢子梗长短不一，顶囊球形，双层小梗，分生孢子黑褐色球形所述黑曲霉XW-2的18s rRNA的部分核苷酸序列如下CCGGGATTGCCTCAGTAACGGC GAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGAGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTGG GTGCGGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCTTGGGCGGGGTGTCCGTGC CCGTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTA AATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAG CACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTAC TTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCCTGGAATGTAGTACCCTCCGGGGTACCTT ATAGCCAGGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAAC GAC 本发明还涉及所述的黑曲霉XW-2在微生物发酵制备糖苷酶中的应用具体的，所述应用为将黑曲霉XW-2菌种接种至产酶培养基中，25 30°C培养 48 72h，获得含有糖苷酶的发酵液所得发酵液经过滤或离心除去菌体的清液为糖苷酶粗酶液，可以直接应用于生物转化法提高虎杖中白藜芦醇含量；也可以保藏于4°C冰箱10 天内使用；也可以经过冷冻干燥，制成粗酶粉保藏于4°C冰箱长期使用所述产酶培养基组成如下蔗糖40 60g/L、NH4Cl 2 4g/L、K2HP040. 5 lg/L、 KCl 0. 3 0. 5g/L、MgS04 0. 3 0. 5g/L、FeS04 0 . 02 0. 05g/L，溶剂为水，pH 6. 5 7. 5本发明还涉及所述的黑曲霉XW-2在生物转化法提高虎杖中白藜芦醇含量中的应用具体的，所述应用为将黑曲霉XW-2菌种接种至产酶培养基中，25 30°C培养 48 72h，发酵液经固液分离获得糖苷酶粗酶液，往粗酶液中加入50 150g/L的虎杖粉，于25 35°C、200 400r/min振荡条件下进行转化8 24h后，过滤除去粗酶液，虎杖粉经烘干备用经生物转化法处理后的虎杖粉，既可作为中药材使用，也可用于白藜芦醇的提取制备所述产酶培养基组成如下蔗糖40 60g/L、NH4Cl 2 4g/L、K2HP040. 5 lg/L、 KCl 0. 3 0. 5g/L、MgS04 0. 3 0. 5g/L、FeS04 0 . 02 0. 05g/L，溶剂为水，pH 6. 5 7. 5所述菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面培养基活化培养，然后经种子培养基扩培、获得种子液，或斜面孢子直接接入产酶培养基进行产酶培养具体的，所述活化及种子培养和产酶方法如下(1)将黑曲霉XW-2菌种孢子接种于斜面培养基，于25 30°C培养48 72h，得到活化后的黑曲霉XW-2菌种；所述的斜面培养基组成为马铃薯100 200g/L(马铃薯洗净去皮，切成小块，加5倍质量水煮沸20 30min，4层纱布过滤去除马铃薯块)、葡萄糖10 20g/L、NaCl 5 10g/L、琼脂15 20g/L，溶剂为自来水，pH自然；(2)将步骤(1)活化培养后黑曲霉XW-2孢子接种至种子培养基中，于25 30°C、 100 250r/min振荡条件下培养36 48h，得种子液；所述种子培养基组成为葡萄糖 30 60g/L、(NH4)2SO4 5 10g/L、KH2PO4 3 5g/L、MgSO4 0. 5 1. Og/L，溶剂为自来水， PH自然；(3)将步骤⑵种子液以5% 10%的体积比的接种量，移种到产酶培养基中，或将步骤(1)的黑曲霉XW-2孢子直接接入产酶培养基，产酶培养基于25 30°C、150 250r/ min振荡条件下培养48 72h，得到黑曲霉XW-2的发酵液；所述产酶培养基组成为蔗糖 40 60g/L、NH4Cl 2 4g/L、K2HPO4 0. 5 lg/L、KCl 0. 3 0. 5g/L、MgSO4 0. 3 0. 5g/ L、FeSO4O. 02 0. 05g/L,溶剂为自来水，pH 6. 5 7. 5本发明将虎杖粉碎后直接为原料，利用特异性较高的微生物产生以糖苷酶为主要活性成分的粗酶液直接进行生物转化处理，糖苷酶将其中的虎杖苷转化为白藜芦醇，而且微生物产生其他类水解酶对虎杖中淀粉、纤维素等的降解，也有利于白藜芦醇的释放，因此经生物转化处理的虎杖中，白藜芦醇的含量便可大幅度提高虎杖经过此法处理后，既可作为中药材使用，也可用于白藜芦醇的提取制备，其药理作用或白藜芦醇的提取收率将大幅度提高本发明的有益效果主要体现在(1)黑曲霉是发酵工业中常用菌种，无毒无害，使用安全；(2)黑曲霉XW-2营养要求简单、生长迅速、容易培养；(3)黑曲霉XW-2产生的糖苷酶为胞外酶，分离除去菌体后，粗酶液直接作为生物转化体系，虎杖粉碎加入转化后，其中的白藜芦醇的含量最高可提高4倍；(4)生物转化处理过的虎杖中无菌体及其代谢产物残留，既可作为中药材使用，也可用于白藜芦醇的提取制备

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专利名称：产糖苷酶的黑曲霉及其应用于提高虎杖中白藜芦醇含量的制作方法图1为标准品白藜芦醇(浓度为0. 05g/L)高效液相色谱图2为未经生物转化处理的虎杖乙醇浸提液的高效液相色谱图3为经生物转化处理的虎杖乙醇浸提液的高效液相色谱图。下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 产糖苷酶微生物的富集、分离和筛选250mL三角瓶中加入约50g虎杖干粉(粉碎后过80目筛)，加适量自来水和5g田园土壤，搅拌均勻，置于30°C的恒温箱培养7天，进行产糖苷酶微生物的富集。将长满霉菌的上述富集物用无菌水稀释后涂布于平板培养基上，于30°C的生化培养箱中培养48h。挑取形态和颜色不同的霉菌菌落接种于斜面培养基上，斜面置于30°C恒温培养48h，得孢子丰富的斜面菌种。用接种环分别挑取上述菌株斜面菌种的孢子，接入50mL产酶培养基中Q50mL三角瓶装)，于30°C、200r/min振荡条件下发酵培养4 后，将发酵液用4层纱布过滤，滤液转入另一只250mL的三角瓶中，加入5g的虎杖粉。三角瓶于30°C、300r/min的水浴振荡箱中生物转化24h后，三角瓶中转化物用布氏漏斗抽滤，虎杖粉于烘箱中烘干，得经过生物转化处理的虎杖。用薄层色谱法分析经生物转化处理的虎杖中白藜芦醇含量，由此比较不同菌株所产糖苷酶将虎杖苷为转化为白藜芦醇的能力大小，经过比较，黑曲霉XW_2(CCTCC No =M 2011358)的能力最高。
所述的平板培养基和斜面培养基的组成相同，按如下组成和方法配制马铃薯洗净去皮，切成小块，称取200g，加自来水IOOOmL煮沸30min，4层纱布滤去除马铃薯块，滤液补足到IOOOmL,再加入葡萄糖20g、NaCl 5g、琼脂20g，pH自然，加热至各成分溶化后分装试管。
所述的产酶培养基按如下组成配制蔗糖40g/L、酵母浸出粉6g/L、K2HPO4 lg/L、 KCl 0. 5g/L, MgSO4 0. 5g/L, FeSO4 0. 05g/L，溶剂为自来水，pH 6.5。
实施例2 用于虎杖苷生物转化为白藜芦醇糖苷酶的发酵
以黑曲霉XW-2为产酶菌种，经过培养基组成和发酵条件优化后，粗酶液中糖苷酶的活性较实施例1的活性有大幅度提高，优选的制备方法如下
(1)将试管斜面保藏的黑曲霉XW-2菌种接种于斜面培养基，斜面于30°C生化培养箱中培养48h。所述的斜面培养基按如下组成和方法配制马铃薯洗净去皮，切成小块，称取200g，加自来水IOOOmL煮沸30min，4层纱布滤去马铃薯块，滤液补足到lOOOmL，再加入葡萄糖20g、NaCl 5g、琼脂20g，pH自然，加热至各成分溶化后分装试管。
(2)用接种环挑去步骤(1)活化培养后黑曲霉XW-2孢子至种子培养基中，种子培养基于3(TC、2(K)r/min振荡条件下培养48h，得种子液；所述种子培养基按如下组成配制葡萄糖 60g/L、(MM)2SO4 10g/L, KH2PO4 5g/L, MgSO4 lg/L、溶剂为自来水，pH 自然；
(3)步骤(2)种子液以5%的体积比接种量接至产酶培养基，30°C、200r/min振荡条件下培养48h，得到含糖苷酶的发酵液；所述产酶培养基按如下组成配制蔗糖40g/ L、NH4Cl 2g/L、K2HPO4 lg/L、KCl 0. 5g/L、MgSO4 0. 5g/L、FeSO4 0. 05g/L，溶剂为自来水， pH6. 5 7· 5。
(4)将步骤(3)黑曲霉XW-2的发酵液，用4层纱布纸过滤除去菌体，所得清液即为糖苷酶粗酶液。
所得糖苷酶粗酶液可以用于生物转化法提高虎杖中白藜芦醇含量，可以立即使用，也可以保藏于4°C冰箱10天内使用，也可以经过冷冻干燥后保藏于4°C冰箱长期保藏使用。
实施例3 生物转化法提高虎杖中白藜芦醇含量
将市售中药材虎杖根茎于85°C的烘箱中烘干Mh，用粉碎机将其粉碎，过80目筛。将实施例2中制备的糖苷酶粗酶液50mL于250mL三角瓶中，加入5g虎杖干粉，三角瓶用保鲜膜封口后，于30°C、300r/min的水浴振荡箱中生物转化Mh。三角瓶中转化物用布氏漏斗抽滤，虎杖粉于85°C的烘箱中烘干，得经过生物转化处理的虎杖。采用高效液相色谱法分析经生物转化处理的虎杖中白藜芦醇含量，达到了 0. 92% (图幻，而未经生物转化处理虎杖中白藜芦醇含量为0. 23% (图幻，可见，经生物转化处理虎杖中，白藜芦醇含量提高了 4. 1 倍。

本发明提供了一株糖苷酶产生菌株——黑曲霉(Aspergullisniger)XW-2，及其在生物转化法提高虎杖中白藜芦醇含量中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NoM2011358，保藏日期2011年10月19日。本发明的有益效果主要体现在(1)黑曲霉是发酵工业中常用菌种，无毒无害，使用安全；(2)黑曲霉XW-2营养要求简单、生长迅速、容易培养；(3)黑曲霉XW-2产生的糖苷酶为胞外酶，分离除去菌体后，粗酶液直接作为生物转化体系，虎杖粉碎加入转化后，其中的白藜芦醇的含量最高可提高4倍；(4)生物转化处理过的虎杖中无菌体及其代谢产物残留，既可作为中药材使用，也可用于白藜芦醇的提取制备。

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