专利名称：二聚化合物及其作为抗病毒剂的用途的制作方法 在很多微生物中存在着具有将N-乙酰神经氨酸(NANA)，也称作唾液酸，从其它碳水化合物上裂解下来的能力的酶。这些微生物包括细菌如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、Arthrobactersialophilus，和病毒如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、新城疫病毒和仙台病毒。这些病毒中的大多数属于正粘病毒或副粘病毒类，并在病毒颗粒表面带有神经氨酸酶活性。很多具有神经氨酸酶的微生物是人和/或动物的主要病原体，并且其中一些，如流感病毒和新城疫病毒引起重大的疾病。长期以来一直认为，神经氨酸酶抑制剂可能防止携带有神经氨酸酶的病毒的感染。大多数已知的神经氨酸酶抑制剂是神经氨酸类似物，如2-脱氧-2，3-脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)及其某些衍生物(Meindl等，Virology，1974 58 457)。我们的国际专利申请WO 91/16320描述了许多DANA类似物，它们具有抗病毒神经氨酸酶活性，并且尤其已证明，4-胍基-2-脱氧-2，3-脱氢-N-乙酰神经氨酸(化合物(A)，代号GG167)对于治疗甲型和乙型流感有效(N.Engl.J.Med.，1997 337874-880)。其它专利申请描述了各种密切相关的唾液酸衍生物(例如PCT公开WO 95/18800、WO 95/20583和WO 98/06712)，并且也描述了GG167的抗病毒大分子缀合物(国际专利申请PCT/AU97/00771)。 化合物(A)Ac代表乙酰基国际专利公开WO 00/55149描述了包含二个神经氨酸酶结合分子的二聚化合物，例如连接到长度达100个原子的常规间隔或连接基团上的化合物(A)。我们现已发现落在国际专利公开WO 00/55149的一般范围之内但未被其具体公开，并表现出意外有利的抗流感活性曲线，包括长肺停留时间和高效力的一类新化合物。不希望受限于理论，认为在肺中的长停留时间的基础是由于防止通过呼吸上皮中的紧密连接的进入的化合物的大小和分子量，以及使细胞膜的通道极为无效地存在的化合物的极性。另一理论是化合物本身与细胞膜中的磷脂或呼吸上皮的其它组分相互作用并增加在肺中的停留时间。
通式(I)的化合物或其药学可接受的衍生物 其中R为氨基或胍基；R2为乙酰基或三氟乙酰基；n和q相同或不同，并选自0、1或2；且X为任选地取代的苯基、任选地取代的萘基或任选地取代的苯基-Y-任选地取代的苯基，其中Y选自共价键、CH2、CH2CH2、O或SO2，条件是当X为苯基或萘基时，n和q均为2，而当X为苯基-Y-苯基，其中Y为共价键时，n和q不都为0。
优选R为胍基。
优选R2为乙酰基。
优选n和q相同。
优选X为可以被邻、间或对位取代的苯基、其中各苯环任选地被烷氧基取代的萘基或苯基-Y-苯基。
术语“任选地取代的”意指可以或可以不进一步被一个或多个选自以下的基团取代烷基、链烯基、炔基、芳基、卤素、卤代烷基、卤代链烯基、卤代炔基、卤代芳基、羟基、烷氧基、链烯氧基、芳氧基、羧基、苄氧基、卤代烷氧基、卤代链烯氧基、卤代芳氧基、硝基、硝基烷基、硝基链烯基、硝基炔基、硝基芳基、硝基杂环基、叠氮基、亚硝基、氨基、烷基氨基、链烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、苄基氨基、酰基氨基、酰基、链烯基酰基、炔基酰基、芳基酰基、酰基氨基、酰氧基、醛基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺酰基氨基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、杂环基、杂环氧基、杂环基氨基、卤代杂环基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳烷氧基、碳芳氧基、巯基、磺酸、烷硫基、芳硫基和酰硫基。
优选所述烷基、链烯基、炔基和烷氧基取代基含有达6个碳原子。
本领域技术人员将理解，式(I)的化合物可在其任何一个或多个官能团上进行修饰以提供其药学可接受的衍生物。其中特别令人感兴趣的衍生物是在羧基官能团、羟基官能团或在氨基上进行修饰的化合物。因此令人感兴趣的化合物包括式(I)的化合物的烷基酯如甲基、乙基、丙基或异丙基酯，芳基酯如苯基、苯甲酰基酯和乙酰基酯。
术语“药学可接受的衍生物”意指式(I)的化合物的任何药学可接受的盐、醚、酯或这种酯的盐，或者在给予受试者时能够提供式(I)的化合物或其抗病毒活性代谢物或残留物的任何其它化合物。特别令人感兴趣的衍生物是在唾液酸羧基或甘油羟基或在氨基和胍基上修饰的化合物。
式(I)的化合物的药学可接受的盐包括由药学可接受的无机和有机酸和碱衍生的化合物。适宜的酸的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它的酸如草酸，虽然本身不是药学可接受的，但可以用于制备用作获得本发明的化合物及其药学可接受的酸加成盐的中间体的盐。
由适宜的碱衍生的盐包括碱金属(如钠)、碱土金属(如镁)、铵和NR4+(其中R为C1-4烷基)盐。
本发明的化合物可以通过本文所述的方法制备。本领域技术人员将清楚，在将单体连接于芳基间隔基团的过程中，需要使用保护基保护神经氨酸酶结合分子的一个或多个官能团。例如参见T.W.Green和P.G.M.Nuts的“Protective Groups in Organic Synthesis”(JohnWiley & Sons，1991)。式(I)的化合物的药学可接受的盐可以根据已知的方法制备。
为了易于制备和加工，优选式(I)的化合物为结晶形式。
因此，本发明还提供以上定义的式(I)的化合物的制备方法，所述方法包括将式(II)的化合物脱保护的步骤
其中R、R2、n、q和x如以上定义。
式(I)的化合物具有抗病毒活性。具体而言，这些化合物是正粘病毒和副粘病毒的病毒神经氨酸酶，例如甲型和乙型流感、副流感、腮腺炎和新城疫的病毒神经氨酸酶的抑制剂。
因此，本发明第二方面提供式(I)的化合物或其药学可接受的衍生物在治疗病毒感染，例如正粘病毒和副粘病毒感染中作为活性治疗剂的用途。
本发明第三方面提供预防或治疗病毒感染的方法，所述方法包括给予需要其的受试者有效量的式(I)的化合物或其药学可接受的盐或衍生物的步骤。
优选所述病毒感染为正粘病毒或副粘病毒感染。更优选所述病毒感染为甲型或乙型流感病毒感染。
优选所述受试者为动物如哺乳动物，更优选人，或者马属的成员如马、驴或骡。最优选哺乳动物为人。
本发明第四方面提供本发明的化合物用于生产治疗病毒感染的药物的用途。
本领域技术人员将理解，本文提及的治疗延伸至预防感染和治疗已形成的感染或症状。
本发明的化合物还用于诊断方法，特别是检测流感病毒的方法。为了用于这种方法，有利的是将本发明的化合物连接于标记物，如放射性、荧光或化学发光标记物。
例如，在我们以前的申请PCT/AU97/00109和PCT/AU97/00771中描述了本发明的化合物所适合的诊断方法。
本发明第五方面提供病毒感染的检测方法，所述方法包括使本发明的化合物与怀疑含有病毒的样品接触的步骤。
将进一步理解，用于治疗所需的本发明的化合物的量不仅随所选择的特定化合物而变，还随给药途径、所治疗的病况的性质、患者的年龄和状况而变，并将最终由值班医师或兽医斟酌决定。但是一般而言，适宜的剂量范围为约0.001-100mg/kg体重/天，优选范围为0.01-10mg/kg/天，最优选范围为0.1-1mg/kg/天。
治疗优选在感染前或感染时开始，并继续直至病毒不再存在于呼吸道。但是所述化合物当在感染后，例如在确定的症状出现之后给予时也是有效的。
适宜地，治疗进行一次或两次，优选治疗仅进行一次，而对于预防优选每周进行一次。
化合物方便地以单位剂量形式给予，例如每单位剂量形式含有1-100mg，更方便为1-20mg活性成分。
尽管在治疗应用中，本发明的化合物可以以原化学药品形式给予，但优选以药物配方的活性成分存在。
因此本发明第六方面提供包含式(I)的化合物或其药学可接受的盐或衍生物和一种或多种药学可接受的载体，并任选地包含其它治疗和/或预防成分的药物配方。所述载体必须是“可接受的”，意思是与配方中的其它组分相容，并且对受者无害。
本发明的化合物也可以与其它治疗和/或预防药，例如其它抗感染药组合使用。具体而言，本发明的化合物可以与其它抗病毒剂一起使用。因此本发明第七方面提供包含式(I)的化合物或其药学可接受的盐或衍生物与另一种治疗和/或预防活性剂，特别是抗病毒剂的组合。
上述组合可以方便地以药物配方的形式存在而使用，因此包含如上定义的组合与药学可接受的载体的这种配方构成本发明的另一方面。
在这种组合中使用的适宜的治疗和/或预防剂包括其它抗感染药，特别是抗菌和抗病毒剂，如那些用于治疗呼吸感染的。例如，这些组合中可以包含其它有效对抗流感病毒的化合物或疫苗，如上述的唾液酸类似物，例如扎那米韦、奥司他韦、金刚烷胺、金刚乙胺和利巴韦林和FluVax。
这些组合的各个组分可以单独给予、顺序给予或者以单独或组合的药物配方同时给予。
当本发明的化合物与第二种对相同的病毒有活性的治疗和/或预防剂一起使用时，各化合物的剂量可以与当各化合物单独使用时的剂量相同或不同。适宜的剂量将由本领域技术人员容易地了解。
药物配方包括适用于口服、直肠、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、阴道或非胃肠(包括肌内、皮下和静脉内)给药的配方，或者适用于呼吸道(包括鼻通道)给药的配方，例如通过吸入或吹入给药的配方。如果需要，所述配方可以方便地以分立的剂量单位存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。这些方法包括将活性化合物与液体载体或细粉固体载体或二者混合，然后如果需要，将产品成形为所需配方的步骤。
适用于口服给药的药物配方可以方便地以分立的单位如各自含有预定量活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂存在；以散剂或颗粒剂存在；以溶液剂、混悬剂或乳膏存在。活性成分也可以大丸剂、干药糖剂或糊剂存在。口服给药的片剂和胶囊剂可以含有常规赋形剂如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可以按照本领域公知的方法包衣。例如，口服液体制剂可以是水或油混悬剂、溶液剂、乳膏、糖浆剂或酏剂的形式，或者可以干产品存在，在使用前与水或其它适宜的载体混合。这种液体制剂可以含有常规添加剂如悬浮剂、乳化剂、非水载体，其可以包括食用油，或防腐剂。
本发明的化合物也可以配方以通过注射，例如快速浓注，或连续输注而非胃肠给药，并且可以是在安瓿、预填充注射器、小体积输注或加有防腐剂的多剂量容器中的单位剂量形式。组合物可以采用在油或水载体中的混悬剂、溶液剂或乳膏的形式，并且可以含有配方剂(formulating agent)如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是在使用前与合适的载体如无菌无热原水混合的粉末形式，该粉末通过无菌分离灭菌固体或通过冷冻干燥溶液来获得。
为了局部给予表皮，本发明的化合物可以配方成油膏剂、乳膏或洗剂，或者经皮贴剂。油膏和乳膏例如可以用水或油基质并加入合适的增稠剂和/或胶凝剂来配方。洗剂可以用水或油基质来配方，并且通常也含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。
适于在口中局部给药的配方包括锭剂，其在香味基质中包含活性成分，香味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄耆胶；软锭剂，其在惰性基质中包含活性成分，惰性基质如明胶或蔗糖和阿拉伯胶；和漱口剂，其在合适的液体载体中包含活性成分。
其中载体为固体的适于直肠给药的药物配方最优选为单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和本领域常用的其它材料，并且栓剂可以通过活性化合物与软化的或熔化的载体混合并冷却和在模具中成型来方便地制备。
适于阴道给药的配方可以是阴道栓、棉塞、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡腾剂(foam)或喷雾剂，其除含有活性成分之外还含有本领域已知的合适的载体。
为了对呼吸道给药，包括鼻内给药，神经氨酸酶抑制剂可以通过本领域用于对呼吸道给药的任何方法和配方来给药。
因此，化合物通常可以溶液或悬浮液的形式或干粉的形式来给药。
溶液剂和混悬剂通常是含水的，如单独由水(例如无菌或无热原水)制备或由水和生理学可接受的共溶剂(例如乙醇、丙二醇或聚乙二醇如PEG 400)制备。
这些溶液剂或混悬剂可以另外含有其它赋形剂例如防腐剂(如苯扎氯铵)、增溶剂/表面活性剂如聚山梨醇酯(例如吐温80、司盘80、苯扎氯铵)、缓冲剂、等渗调节剂(例如氯化钠)、吸收促进剂和增粘剂。混悬剂可以另外含有悬浮剂(例如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠)。
通过常规方式将溶液剂或混悬剂直接施用于鼻腔，例如用滴管、吸管或喷雾器。配方可以单剂或多剂形式提供。后者需要提供定量装置。使用滴管或吸管时，这可以通过给予合适的预定体积的溶液或悬浮液由患者完成。使用喷雾器时，例如这可以通过定量雾化喷雾泵完成。
也可以通过气雾剂配方对呼吸道给药，其中化合物在有合适的抛射剂的加压包中提供，抛射剂如氯氟烃(CFC)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。气雾剂通常也可以含有表面活性剂如卵磷脂。药物的剂量可以通过定量阀的提供来控制。
或者，化合物可以以干粉的形式提供，例如化合物在合适的粉末基质中的粉末混合物，粉末基质如乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。方便地，粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。粉末组合物可以是单位剂量形式，例如胶囊剂或药筒(cartridge)，如明胶的，或水泡包装，可以从其将粉末通过吸入器给药。
在打算对呼吸道给药的配方，包括鼻内给药配方中，化合物通常具有小的粒度，例如5微米或更小的数量级。可以通过本领域已知的方法来获得这样的粒度，例如通过微粉化。
需要时，可以采用适于活性成分缓释的配方。
优选本发明的化合物通过吸入、吹入或鼻内给药或它们的组合而给予呼吸道。
“Relenza”通过“Diskhaler”(GlaxoSmithKline group of companies的商标)用口吸入自由流动粉末而给药。类似的配方将适于本发明。
因此，本发明在第八方面提供含有上述配方的吸入器。
将理解，吸入器还可以是定量(metered dose)气溶胶吸入器的形式。
为了本发明的目的，应清楚地理解，词语“包含”意指“包括但不限于”，并且词语“包括”具有一致的意思。
在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均引入本文作参考，如同将每个单独的出版物具体而单独地指明将其引入本文作参考。
具体实施方案本发明现在仅通过参考下列非限制性实施例的方式详细描述。
仪器方法方法A(LC/MS)Micromass Platform II质谱仪，在阳离子电喷雾模式下工作，质量范围为100-1000amu。
柱3.3cm×4.6mm ID，3μm ABZ+PLUS流速3ml/分钟注射体积5μl溶剂A95％乙腈+0.05％甲酸溶剂B0.1％甲酸+10mMolar乙酸铵梯度0％A/0.7分钟，0-100％A/3.5分钟，100％A/1.1分钟，100-0％
A/0.2分钟方法B(LC/MS)Waters ZQ质谱仪，在阳离子电喷雾模式下工作，质量范围100-1000amu。
柱3.3cm×4.6mm ID，3μm ABZ+PLUS流速3ml/分钟注射体积5μl溶剂A95％乙腈+0.05％甲酸溶剂B0.1％甲酸+10mMolar乙酸铵梯度0％A/0.7分钟，0-100％A/3.5分钟，100％A/1.1分钟，100-0％A/0.2分钟方法C(自动制备HPLC)所用的制备柱为Supelcosil ABZplus(10cm×2.12cm)。
UV波长230nm注射体积2ml流速4ml/分钟溶剂A乙腈+0.05％TFA溶剂B水+0.1％TFA梯度5-40％A/20分钟，40％A/20分钟，40-100％A/0.3分钟，100％A/15分钟，100-5％A/3分钟方法D (质量导向的自动制备HPLC)所用的制备柱为Supelcosil ABZplus(10cm×2.12cm)UV波长200-320nm流速20ml/分钟注射体积1ml溶剂A0.1％甲酸溶剂B95％乙腈+5％甲酸梯度100％A/1分钟，100-80％A/9分钟，80-1％A/3.5分钟，1％A/1.4分钟，1-100％A/0.1分钟方法E (制备HPLC)所用的制备柱为Dynamax60A C18(25cm×4.14cm)UV波长230nm流速40ml/分钟溶剂A乙腈+0.05％TFA溶剂B水+0.1％TFA梯度0-50％A/25分钟，50-100％A/0.3分钟，100％A/15分钟，100-0％A/3分钟方法F(制备HPLC)所用的制备柱为Kromasil C18(20cm×5cm)UV波长230nm流速80ml/分钟溶剂A1％TFA溶剂B80％乙腈+1％TFA梯度在HPLC之后为0-100％B/70分钟，合并适宜的馏分，并通过减压蒸发而除去挥发性组分。将水溶液施加于Amberchrom CG-161树脂(10×2.5cm)柱，所述柱用水(500ml)洗脱，然后用2∶2∶1的乙腈∶MeOH∶水(500ml)的混合物洗脱。
缩写TFA 三氟乙酸DMAP 4-二甲基氨基吡啶DCM 二氯甲烷EtOAc 乙酸乙酯Et2O 乙醚MeOH 甲醇HPLC 高压液相色谱DPM 二苯基甲基
SPE 固相萃取NMR 核磁共振LC/MS液相色谱/质谱中间体1 中间体1将二苯甲基(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-({(E)-[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}氨基)-2-[(1R，2R)-1，2，3-三羟基丙基]-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸酯(参见J.Med.Chem.1998，41，787-797)(12.38g；17.7mmol)于氮气氛和室温下溶于无水乙腈(130ml)。搅拌溶液并加入1，1′-羰基二咪唑(2.87g；17.7mmol)。16小时后，LC/MS显示存在原料三醇，因此进一步加入1，1′-羰基二咪唑(总共0.493g；3mmol)。数小时后LC/MS显示无三醇存在。蒸发溶剂并用硅胶快速柱色谱法纯化残余物，用1∶1乙酸乙酯/40-60石油醚洗脱。蒸发含有产物的馏分，然后回收于二氯甲烷，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发得到中间体1(二苯甲基(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}氨基)-2-{(S)-羟基[(4R)-2-氧代-1，3-二噁烷-4-基]甲基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸酯)，为一种米色固体(11.05g；86％)。
中间体3 中间体1 中间体2 中间体3中间体1(2.0g，2.76mmol)通过与无水甲苯(3×20ml)共沸混合而干燥，然后将其溶于无水吡啶(8ml)。加入DMAP(1.01g，8.29mmol)和氯甲酸对硝基苯酯(0.67g，3.3mmol)，并将混合物于室温下搅拌过夜。加入另一份氯甲酸对硝基苯酯(0.28g，1.38mmol)，并继续搅拌2小时。LCMS(方法B)显示MH+＝890；TRET＝4.19分钟，对应于中间体2。
将一份混合物(1.6ml)转移到另一反应容器，并用DMAP(0.20g，1.66mmol)、三乙胺(0.08ml，0.55mol)处理，然后用1，3-苯二乙胺二盐酸盐(65mg，0.27mmol)[关于制备，参见Chem.Ber.，1984，117(4)，1487-1496]处理，将混合物搅拌70小时，然后真空浓缩，并用DCM(10ml)和水(5ml)分配。用疏水烧结柱体完成有机层的分离。在氮气氛下通过吹出气体而干燥DCM层，然后将其施加于5g二氧化硅SPE柱体，并首先用环己烷∶Et2O(1∶1)洗脱，然后用Et2O洗脱，然后用Et2O∶EtOAc(9∶1)洗脱，然后用Et2O∶EtOAc(5∶1)洗脱，然后用Et2O∶EtOAc(3∶1)洗脱，然后用Et2O∶EtOAc(1∶1)洗脱，最后用EtOAc洗脱得到中间体3，为一种白色固体(0.29g；63％收率)。LC/MS(方法A)显示(M+2H+)/2＝834；TRET＝4.56分钟。
中间体4 中间体4将中间体3(0.29g，0.2mmol)溶于10∶1 DCM∶茴香醚(0.80ml)的混合物，并用TFA(0.73ml)处理。将所得的溶液于室温下搅拌2小时，然后通过在氮气氛下吹出气体而蒸发至干。用乙醚滴定残余物得到中间体4的双TFA盐，为一种白色固体(0.142g，76％收率)。LC/MS(方法B)显示(M+2H+)/2＝467；TRET＝2.05分钟。
中间体5 中间体1 中间体5
通过与无水甲苯共沸混合三次而将中间体1(0.10g，0.14mmol)干燥，然后将其溶于无水DCM(0.5ml)。向所得的溶液中加入DMAP(0.005g，计算量)，然后加入1，1′-氧双[4-异氰酰基苯](0.012g，0.046mmol)和一些3A分子筛小球。将混合物回流过夜，然后冷却并直接施加于5g二氧化硅SPE柱体。用Et2O(10×20ml)洗脱，然后用EtOAc(5×20ml)洗脱得到中间体5，为一种无色玻璃(0.025g，33％收率)。LC/MS(方法A)显示(M+2H+)/2＝852；TRET＝4.55分钟。
中间体6 中间体1 中间体6 通过与无水甲苯共沸混合而干燥中间体1(4.0g，5.6mmol)，然后将其溶于无水DCM(5ml)。向在氮气氛下搅拌的所得的溶液中加入4，4′-亚甲基双[苯基异氰酸酯](0.48g，1.9mmol)、一些3A分子筛小球和DMAP(0.2g，计算量)，然后将混合物回流20小时。冷却后将混合物真空浓缩，并通过硅胶快速柱色变谱法纯化。用DCM，然后用EtzO，然后用Et2O∶EtOAc(95∶5)、Et2O∶EtOAc(90∶10)和Et2O∶EtOAc(80∶20)完成洗脱，得到中间体6，为一种白色固体(2.60g，80％收率)。
LCMS(方法B)显示(M+2H+)/2＝850；TRET＝4.57分钟。
中间体7 将1，4-亚苯基二丙酸(0.50g，2.25mmol)与甲苯共沸混合，然后悬浮在一些3A分子筛小球上的二噁烷(5ml)中，并在氮气氛下搅拌10分钟。加入三乙胺(0.68ml，4.90mmol)，然后加入二苯基磷酰基叠氮化物(0.96ml，4.50mmol)，并将混合物于室温下搅拌2小时。然后将温度升至80℃，并将混合物搅拌45分钟，然后冷却并过滤除去不溶物质。用石油醚(40-60℃)洗涤固体，并真空浓缩合并的滤液。用石油醚(40-60℃)萃取所得的油得到中间体7，为一种无色油(0.12g，25％收率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.12(s，4H)，3.45(t，4H)，2.83(t，4H)。
中间体8 根据与中间体5和6相同的方法，由中间体7和1制备完全保护的中间体8，然后如下进行脱保护将(0.09g，0.05mmol)溶于DCM(0.37ml)和茴香醚(0.037ml)的混合物，并在冰浴中冷却。用TFA(0.37ml)处理混合物，并将所得的溶液加热至室温，然后搅拌2.5小时，随后进行真空浓缩。用Et2O滴定混合物得到中间体8的双-TFA盐，为一种白色固体(0.05g；93％收率)。LC/MS(方法B)显示(M+2H+)/2＝467；TRET＝2.01分钟。
中间体9 中间体9用三光气(1.40g，4.70mmol)处理在无水甲苯(100ml)中的4，4′-亚乙基双苯胺(0.50g，2.36mmol)的溶液，并将混合物加热回流(120℃)4小时。将混合物冷却，并在重力下过滤除去不溶的残余物。将滤液真空浓缩得到中间体9，为一种黄色固体(0.54g，86％收率)。
1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ(ppm)6.98-7.05(8H，ABq)和2.86(4H，s)中间体10 中间体1中间体10 将中间体1(0.40g，0.56mmol)与无水甲苯共沸混合两次，然后将其溶于无水DCM(0.4ml)。向所得的溶液中加入DMAP(0.02g，计算量)，然后加入中间体9(0.05g，0.19mmol)和一些3A分子筛小球。将混合物回流18小时，然后直接施加于40g二氧化硅Biotage柱体。用Et2O∶EtOAc(6∶1)洗脱得到中间体10，为一种白色固体(0.10g，31％收率)。LC/MS(方法B)显示(M+2H+/2＝858；TRET＝4.57分钟。
中间体11 中间体1 中间体11
通过与无水甲苯共沸混合三次而干燥中间体1(2.0g，2.76mmol)，然后将其溶于无水吡啶(8ml)。加入DMAP(1.01g，8.29mmol)和氯甲酸对硝基苯酯(0.67g，3.30mmol)，并将混合物于室温下搅拌18小时。加入另一份氯甲酸对硝基苯酯(0.28g，1.38mmol)，并继续搅拌2小时。LC/MS(方法B)显示MH+＝890；TRET＝4.19分钟，对应于中间体2。
将一份混合物(1.6ml)转移到另一反应容器，并用DMAP(0.20g，1.66mmol)、三乙胺(0.08ml，0.55mmol)处理，然后用4，4′-磺酰基二苄基胺二盐酸盐(0.10g，0.28mmol)[关于制备，参见J.Chem.Soc.，1946，466]处理，并将混合物搅拌70小时。将混合物真空浓缩，并用DCM(10ml)和水(5ml)分配。用50ml疏水烧结柱体完成两相的分离。通过在氮气氛下吹出气体而浓缩DCM层，然后将其施加于5g二氧化硅SPE柱体，并首先用环己烷∶Et2O(1∶1)洗脱，然后用Et2O洗脱，接着用Et2O∶EtOAc(9∶1)洗脱，随后用Et2O∶EtOAc(5∶1)洗脱，接着用Et2O∶EtOAc(3∶1)洗脱，然后用Et2O∶EtOAc(1∶1)洗脱，最后用EtOAc洗脱得到中间体11，为一种米色固体(0.15g；30％收率)。LCMS(方法A)显示(M+2H+)/2＝890；TRET＝4.47分钟。
类似地制备以下

中间体16 中间体14 中间体15 中间体16通过与无水甲苯共沸混合四次而干燥中间体14(2.74g，4.79mmol)，然后将其溶于无水吡啶(13.75ml)。加入DMAP(1.46g，11.98mmol)和氯甲酸对硝基苯酯(1.06g，5.27mmol)，并将混合物于室温下搅拌3小时。LCMS(方法B)显示MH+＝738；TRET＝3.87分钟，对应于中间体15。
向混合物加入更多的吡啶(8.25ml)，然后加入[1，1′-联苯基]-4，4′-二甲胺(0.51g，2.4mmol)(根据J.Med.Chem.，2000，43，420-431制备)，并再继续搅拌16小时。将混合物真空浓缩，并作为在DCM中的溶液施加于90g二氧化硅Biotage柱体。用乙醚洗脱，然后Et2O∶EtOAc(1∶1)洗脱，然后用Et2O∶EtOAc(1∶2)洗脱，最后用EtOAc洗脱得到中间体16，为一种白色固体(1.92g，57％收率)。LC/MS(方法A)显示(M+2H+)/2＝705；TRET＝3.96分钟。
中间体17

中间体17在玻璃小瓶中将中间体10(0.1g，0.06mmol)溶于10∶1 DCM∶茴香醚(0.44ml)的混合物，并用TFA(0.04ml)处理。将所得的溶液于室温下搅拌2小时，然后真空浓缩。用乙醚滴定残余物得到中间体17的双TFA盐，为一种白色固体(0.06g，87％收率)。LC/MS(方法A)显示(M+2H)/2＝491；TRET＝2.38分钟。
类似地制备以下


中间体23 将中间体16(1.92g，1.36mmol)溶于10∶1 DCM∶茴香醚(27.5ml)的混合物，并用TFA(25ml)处理。将所得的溶液于室温下搅拌2小时，然后真空浓缩。用乙醚滴定残余物得到中间体23的双TFA盐，为一种白色固体(1.59g，94％收率)。LCMS(方法A)显示(M+2H+)/2＝505；TRET＝2.27分钟。
实施例1(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R)-1-[({[2-(3-{2-[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氢-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羟基丙基]氧}羰基)氨基]乙基}苯基)乙基]氨基}羰基)氧]-2，3-二羟基丙基}-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸 将中间体4(0.14g，0.15mmol)溶于水(1.20ml)和甲醇(1.20ml)的混合物。加入三乙胺(0.30ml)，并将溶液振荡2小时，然后真空浓缩。反相制备HPLC(方法D)得到实施例1(0.048g；44％收率)。LC/MS(方法A)显示(M+2H+)/2＝441；TRET＝1.83分钟。
实施例2(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R)-1-[({[2-(4-{2-[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氢-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羟基丙基]氧}羰基)氨基]乙基}苯基)乙基]氨基}羰基)氧]-2，3-二羟基丙基}-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸 将中间体8(0.03g；0.06mmol)溶于水(1ml)和甲醇(1ml)的混合物。加入三乙胺(0.25ml)，并将溶液搅拌1小时，然后真空浓缩。将残余物作为水溶液施加于C18SPE柱体(用甲醇预调节)。用乙腈∶水(5∶95)(3×5ml)洗脱柱，然后用乙腈∶水(7.5∶93.5)(3×5ml)洗脱，最后用乙腈∶水(15∶85)(3×5ml)洗脱得到实施例2，为一种白色固体(0.005g；9％收率)。LC/MS(方法B)显示(M+2H+)/2＝441；TRET＝1.79分钟。
实施例3(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R)-1-[({[4-(2-{4-[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氢-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羟基丙基]氧}羰基)氨基]苯基}乙基)苯基]氨基}羰基)氧]-2，3-二羟基丙基}-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸双TFA盐
用三乙胺(1ml)处理在2∶1二噁烷∶水(3ml)的混合物中的中间体17(0.06g，0.06mmol)的溶液，并在室温下将混合物搅拌18小时。通过反相HPLC(方法C)纯化得到实施例3，为一种白色固体(0.01g，22％收率)。LC/MS(方法A)显示(M+2H+)/2＝465；TRET＝2.16分钟。
实施例4(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-[(1R，2R)-1-({[({4-[(4-{[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氢-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羟基丙基]氧}-羰基)氨基]甲基}苯基)磺酰基]苯基}甲基)氨基]氧)-2，3-二羟基丙基]-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸 将中间体20(0.09g，0.07mmol)溶于水(0.70ml)和甲醇(0.70ml)的混合物。加入三乙胺(0.18ml)，并将溶液振荡2小时，然后真空浓缩。反相制备HPLC(方法D)得到实施例4，为双TFA盐(0.014g，20％收率)。LC/MS(方法B)显示(M+2H+)/2＝497；TRET＝1.93分钟。
类似地制备以下

实施例5(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-[(1R，2R)-1-({[({4-[(4-{[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氢-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羟基丙基]氧}羰基)氨基]甲基}苯基)氧]苯基}甲基)氨基]羰基)氧)-2，3-二羟基丙基]-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸实施例6(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-[(1R，2R)-1-({[({4-[(4-{[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氢-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羟基丙基]氧}羰基)氨基]甲基}苯基)甲基]苯基)甲基)氨基]羰基}氧)-2，3-二羟基丙基]-4-(氨基(亚氨基)甲基}氨基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸实施例7(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R，-1-[({[4-({4-[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氢-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羟基丙基]氧}羰基)氨基]苯基氧)苯基]氨基}羰基)氧]-2，3-二羟基丙基}-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸双TFA盐
将中间体18(0.005g，0.004mmol)溶于水(1ml)，并在40℃下加热8小时。将混合物冷却，并直接施加于500mg C18SPE柱体(用甲醇预调节)。用水(5ml)洗脱柱，然后用乙腈∶水(15∶85)(2×5ml)洗脱。包含乙腈的馏分含有不纯产物，因此将其合并并真空浓缩。将残余物再溶于含有一滴TFA的水(1ml)以帮助溶解，并再次施加于500mgC18SPE柱体(用甲醇预调节)。用乙腈∶水(2∶98)(2×5ml)洗脱柱，然后用乙腈∶水(4∶96)(2×5ml)洗脱，然后用乙腈∶水(6∶94)(2×5ml)洗脱，然后用乙腈∶水(8∶92)(2×5ml)洗脱，最后用乙腈∶水(10∶90)(2×5ml)洗脱得到实施例7，为一种白色固体(0.002g，47％收率)。LC/MS(方法A)显示(M+2H+)/2＝459；TRET＝2.01分钟。
实施例8(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R)-1-[({[4-({4-[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氢-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羟基丙基]氧}羰基)氨基]苯基}甲基)苯基氨基}羰基)氧]-2，3-二羟基丙基}-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸双TFA盐
将中间体19(1.0g，1.0mmol)溶于水(4ml)和甲醇(4ml)的混合物。加入三乙胺(1ml)并将溶液搅拌3.5小时。减压蒸发除去挥发性组分，并通过加入TFA将剩余水溶液调节至pH3。反相制备HPLC(方法E)得到实施例8的双TFA盐，为一种白色固体(0.29g；24％收率)。LCMS(方法B)显示(M+2H+)/2＝458；TRET＝2.08分钟。
实施例9(2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-2-{(1R，2R)-1-[({[(4′-{[({[(1R，2R)-1-((2R，3R，4S)-3-(乙酰氨基)-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-6-羧基-3，4-二氢-2H-吡喃-2-基)-2，3-二羟基丙基]氧}羰基)氨基]甲基}-1，1′-联苯-4-基)甲基]氨基}羰基)氧]-2，3-二羟基丙基}-4-{[氨基(亚氨基)甲基]氨基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸双TFA盐 将中间体23(1.59g；1.3mmol)溶于水(28.5ml)和甲醇(28.5ml)的混合物。加入三乙胺(2.85ml)，并将溶液搅拌4小时。在真空下除去挥发性有机组分，并通过加入TFA将剩余溶液调节至pH2。反相制备HPLC(方法F)得到两性离子实施例9(0.70g；57％收率)。LC/MS(方法A)显示(M+2H+)/2＝465；TRET＝2.00分钟。
实施例10式(I)的化合物的评价—流感病毒复制的抑制基本上如Watanabe等人(J.Virological Methods，199448257)所述进行细胞病变效应(CPE)分析。在本发明化合物的连续稀释液存在下，用确定的病毒接种体(通过实验确定为足以在72小时后产生足够的CPE并易于将化合物控制在认为与公开的标准一致的浓度的最小量)感染MDCK细胞。将培养物于37℃和5％CO2气氛下培养达72小时。根据公开的方法(例如参见Watanabe等人，1994)，通过病毒染料3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定CPE的程度及其导致的病毒复制。使用关于曲线匹配的计算机程序计算CPE抑制50％的化合物浓度(ID50)。分析流感A/悉尼/5/97和B/哈尔滨/7/95病毒，结果如表1所示。关于WO 00/55149具体公开的化合物和化合物A的参照数据也如表1所示。
表1

*WO 00/55149中提及+WO 00/55149提供的与病毒H3N2分离物A/维多利亚/3/75而不是H3N2分离物A/悉尼/5/97有关的数据。如果比较这些数据，则本领域技术人员将明显看出，当针对多种不同的病毒进行体外分析时，抗病毒效力的差别对确定的化合物来说并非罕见。例如，Woods等人(Antimicrob Agents Chemother 1993 371473-9)已报道，化合物A在涉及目前的临床分离物的体外分析中表现出宽范围的EC50值(从0.02至0.16μM)。因此，发现化合物8在涉及目前的流感A H3N2分离物A/悉尼/5/97的CPE分析中比在先前的涉及H3N2分离物A/维多利亚/3/75的CPE分析中更为有效。表1提供的数据证明化合物E1-E5，除了基本上比高活性化合物A更有效外，甚至更有效地抗A/悉尼/5/97，并基本上比WO 00/55149的化合物8和10更有效地抗目前的乙型流感分离物B/哈尔滨/7/95。
实施例11空斑减数试验将Madin Darby犬肾(MDCK)细胞接种到六孔组织培养平板，并通过标准方法使其生长至融合。用最小体积的补充0.2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水稀释流感病毒以得到50-100的空斑形成单元(pfu)每孔的估计滴定度。在37℃和5％CO2大气下在MDCK上吸附一小时后，吸入病毒接种物，并用含有充足的琼脂或琼脂糖(一般1-2％)的病毒生长培养基(补充最佳浓度的BSA、胰蛋白酶和胰岛素/铁传递蛋白/硒的最低Eagle培养基)代替，以使培养基在室温和37℃及5％CO2气氛下胶凝至空斑形成(一般2-4天)。在计数前采用适宜的染色(例如在甲醛生理盐水中的0.4％结晶紫)使空斑可视。抗病毒效力表示为将未治疗的对照值(EC50)的空斑数减少50％的试验物的浓度。

*A/WSN/33BVLV09(H1N1)A/维多利亚/3/75 BVLV017(H3N2)A/悉尼/5/97 BVLV015(H3N2)A/新喀里多尼亚/20/99 BVLV008(H1N1)A/巴拿马/2007/99 BVLV008(H3N2)
A/拜恩州/7/95 BVL006(H1N1)

*B/维多利亚/67B/香港/5/72 BVLV012B/哈尔滨/7/95.BVLV008B/Yamanashi/166/98 BVLV007实施例12长期作用评价将啮齿动物麻醉，并通过气管内途径使其服用剂量体积为0.8ml/kg的令人感兴趣的化合物。然后将啮齿动物保持在垂直位置，直至获得完全恢得。在不同的时间点，例如给药后2、8、24和48小时，通过分析方法评价肺中化合物的水平。可以使用任何适于检测这种类型化合物的分析方法。化合物水平下降至分析鉴定技术的灵敏度以下的时间决定化合物在肺组织中的停留时间。
关于所选择的化合物在大鼠肺中的停留数据如下所示。请注意，所有的实验包括共同给药的内标，即国际专利公开WO 02/20514的化合物3以进行比较。数据表示为相对于此化合物的比率，此化合物的结构如以下所示。
化合物3为比较目的纳入化合物A的数据。如果将停留表示成化合物浓度与标准浓度的比率，则本发明的化合物在7天的停留明显大于化合物A。
大鼠肺停留测定结果


实施例13肺长期作用和效力的另一评价用于感染小鼠的方案已在前面描述(1-4)。将流感病毒接种到适度麻醉的小鼠的外鼻孔。
治疗方法和方案在确定的时间点进行单一剂量的化合物的给药，直至感染前第10天，优选感染前4-7天，或者感染之后给药，优选在感染后立即给药直至感染后48小时。在大部分的实验中，使用非致命的流感株，并由肺病毒滴定度的减小来评价效力。对于在感染前给予化合物的小鼠，在感染后取出肺，可以在感染后一天或数天内取出，优选在感染后1-4天取出。使用确定的方法分析均化的肺样品的病毒，评价病毒负载的滴定度，并与未治疗小鼠的肺病毒的滴定度作比较。
在使用小鼠适应的致命流感病毒株的实验中，通过与未治疗的小鼠相比的存活率和/或存活者数的增加来评价效力。
参考文献1.Ryan，D.M.，J.Ticehurst，M.H.Dempsey和C.R.Penn，1994.Inhibition of influenza virus replication in mice by GG167(4-guanidino-2，4-dideoxy-2，3-dehydro-N-acetylneuraminic acid)isconsistent with extracellular activity of viral neuraminidase(sialidase).Antimicrob.Agents and Chemother.38(10)2270-2275.
2.von Itzstein M.，W.-Y.Wu，G.B.Kok，M.S.Pegg，J.C.Dyason，B.jin，T.V.Phan，M.L.Smythe，H.F.White，S.W.Oliver，P.M.Colman，J.N.Varghese，D.M.Ryan，J.M.Woods，R.C.Bethell，V.J.Hogham，J.M.Cameron和C.R.Penn.1993.Rational design ofpotent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication.Nature(London)363418-423.
3.Woods，J.M.，R.C.Bethell，J.A.V.Coates，N.Healey，S.A.Hiscox，B.A.Pearson，D.M.Ryan，J.Ticehurst，J.Tilling，S.A.Walcott和C.R.Penn.1993.4-Guanidino-2，4-dideoxy-2，3-dehydro-N-acetylneuraminic a cid is a highly e ffective inhibitor both ofthe sialidase(neuraminidase)and of growth of a wide range of influenzaA and B viruses in vitro.Antimicrob.Agents Chemother.371473-1479.
4.Robert J Fenton，Peter J Morley，Ian J Owens，David Gower，Simon Parry，Lee Crossman和Tony Wong(1999).Chemoprophylaxis ofinfluenza A virus infections，with single doses of zanamivir，demonstratesthat zanamivir is cleared slowly from the respiratory tract.Antimicrob.Agents and Chemother.43，11，2642-2647.


本发明涉及通式(I)的化合物或其药学可接受的衍生物，它们的制备方法，包含它们的药物配方或它们用于预防或治疗病毒感染的用途，其中R为氨基或胍基；R