抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表达载体和应用的制作方法[0002]STAT3是IL-6/JAK-STATs转导通路的重要成员，分子量89KD左右，最初发现并认识STAT3是从研究细胞因子IL-6介导的急性期反应时开始，它是一种转录因子，促进众多基因的转录。后来随着研究的深入，发现STAT3不仅参与细胞因子介导的急性期反应，而且在人类的多种恶性肿瘤中STAT3是异常活化的，调控肿瘤细胞的生物学行为，其中包括恶性脑胶质细胞瘤。[0003]近年的研究发现，一些小的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)可以高效、特异地促使体内特定基因mRNA降解，诱使细胞出现特定基因缺失的表型，这种技术即RNAi。在RNAi作用的起始阶段中外源性或内源性的双链RNA被Dicer酶切割为19~21bp的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs , siRNAs);随后siRNA与核酶复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex, RISC) ； RISC激活后通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上并切割mRNA，从而部分或完全抑制目的基因的表达。另一方面，细胞在RNA依赖性RNA聚合酶作用下，可以siRNA为引物、以mRNA为模板，合成出mRNA的互补链，从而使mRNA也变成了 dsRNA，然后在Dicer酶的作用下再次被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有 诱发RNAi的作用，通过这个链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。[0004]从RNAi的作用机制中可见，这种基因表达调控方法属于转录后的调节并具有明显优势:RNAi基因抑制效果确切，应用微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上、甚至可以达到基因敲除的效果；其次，RNAi抑制具有严格的序列特异性，治疗的针对性强，因而应用此项技术能够同时抑制同一基因的多个靶点或多个不同基因而不致相互干扰；同时，RNAi的作用具有级联式放大效应和高穿透性更适合恶性肿瘤的实验研究；此外，RNAi序列识别的特异性即或对由野生型点突变形成的癌基因也能够产生准确有效的封闭效果而对野生型基因没有影响。在对多种肿瘤细胞系实验中也证实:肿瘤细胞中均存在着RNAi的机制，化学合成、质粒/病毒或其他方式介导的RNAi可以有效地抑制内源性RNA的表达。
[0005]本发明就是为了解决胶质瘤等肿瘤基因治疗问题，以RNA干扰机制为基础，通过人工合成或表达质粒序列转录形成的STAT3小双链RNA(SiRNA)可以靶向作用于STAT3基因的mRNA，从而阻断其翻译过程，达到使STAT3基因表达降低的结果，而提供一种抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表达载体和应用。[0006]本发明是按照以下技术方案实现的。[0007]一种抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA，该siRNA具有特异性抑制恶性脑胶质瘤细胞增殖的作用，其碱基序列为:5’-TGAAATCATCATGGGCTAT-3’。 所述抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA，其特征在于:该siRNA靶向人的基因序列号为NM_003150的STAT3转录本，作用于该基因序列mRNA的第2169至2188位。
[0008]一种抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表达载体，其包含如权利要求1所述的siRNA，具有特异性抑制人STAT3基因表达，特异性抑制人恶性脑胶质瘤细胞增殖的作用。
[0009]所述抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表达载体，该表达载体包含有PGC-LV载体 ，其DNA序列中病毒表达载体是慢病毒。
[0010]所述抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA在制备抑制人恶性脑胶质瘤治疗药物中的应用。
[0011]所述抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表达载体在制备抑制人恶性脑胶质瘤治疗药物中的应用。
[0012]结果表明:STAT3siRNA可通过慢病毒体介导作用成功转染入胶质瘤细胞内，转染STAT3siRNA后的细胞代谢受抑制，细胞生长减慢，CCK8吸收值较对照组和空载组明显下降；Western blot结果显示:转染了 STAT3siRNA的细胞STAT3的总蛋白和磷酸化蛋白表达均受抑制；流式细胞分析实验表明:STAT3-siRNA在转染96小时后凋亡比例较对照组和空载组明显增多。
[0013]这样，本发明是将STAT3_siRNA导入恶性脑胶质瘤细胞后，靶向作用于STAT3基因的mRNA，阻断其翻译过程，有效地沉默STAT3基因，有效抑制人恶性脑胶质瘤靶向STAT3的基因表达，能有效抑制恶性脑胶质瘤细胞的增殖活性，诱导细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤发生和生长的目的。该siRNA及其慢病毒表达载体可用于制备高效、快速、特异性强的抗肿瘤药物。



[0014]图1是U87细胞qRT-PCR法筛选靶点柱状图分析图；
图2是U251细胞qRT-PCR法筛选靶点柱状图分析图；
图3是Western blot方法验证LV_STAT3siRNA在U87细胞中的敲除效果图；
图4是Western blot方法验证LV_STAT3siRNA在U251细胞中的敲除效果图；
图5是慢病毒重组载体的酶切鉴定图；
图6是PGC-LV载体图谱；
图7是U87细胞转染后96小时绿色荧光蛋白表达情况；
图8是U251细胞转染后96小时绿色荧光蛋白表达情况；
图9是Western blot方法检测转染U87细胞后凋亡蛋白的表达情况；
图10是Western blot方法检测转染U251细胞后凋亡蛋白的表达情况；
图11是U87细胞转染后各时间点CCK8吸收值；
图12是U251细胞转染后各时间点CCK8吸收值；图13是U87对照组转染后流式测定细胞凋亡情况；
图14是U87空载组转染后流式测定细胞凋亡情况；
图15是U87实验组转染后流式测定细胞凋亡情况；
图16是U251对照组转染后流式测定细胞凋亡情况；
图17是U251空载组转染后流式测定细胞凋亡情况；
图18是U251实验组转染后流式测定细胞凋亡情况；
图19是本发明siRNA的碱基序列。

[0015]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
[0016]实施例一:干扰人STAT3基因表达的siRNA序列设计和筛选
1.siRNA序列设计
本发明以RNA干扰技术为基础，利用NCBI Genbank检索基因序列号为NM_003150的STAT3mRNA的全长序列，参照siRNA设计原则，并运用RNA structure软件模拟祀mRNA的二级结构，尽量避免自身 结合的茎区，选择配对区域较少的序列，如线区和环区。分别筛选出5条siRNA均为19个核苷酸的序列，并将它们带入BLAST基因组数据库进行比对，排除了和其他编码序列/EST同源。并将其分别命名为STAT3-siRNA-l、STAT3-siRNA_2、STAT3-siRNA-3、STAT3_siRNA_4、STAT3_siRNA_5 (见表 I)如图 19 所示(由上海吉凯公司合成)。
[0017]表1干扰人STAT3基因表达的siRNA序列