专利名称：紫芝菌丝体多糖精制物冻干粉针剂及其制备方法食药用真菌具有抗肿瘤抗病毒、降血脂、延缓衰老、护肝排毒、促进核酸和蛋白质 生物合成等多种功效，在中国有悠久的使用历史。国内外大量研究表明，真菌多糖是从真菌 子实体、菌丝体、发酵液中分离得到的，为真菌类药物的药效部位，是能够控制细胞分裂分 化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖。紫芝(Ganoderma Sinense Zhao,Xu et ^iang)是灵芝属的一种，目前对紫芝研究 较少，紫芝提取物(以多糖为主)具有抗肿瘤、抗辐射、升高白细胞的作用，研究表明紫芝多 糖为其药效主要部位。中国专利200710045369. 4 “一种紫芝发酵方法及制得的紫芝菌丝体”公开了一 种紫芝液体深层发酵产生菌丝体的方法，该菌丝体用水提醇沉法提取得到的粗多糖含量在 39 75%，其体内药理实验中，口服剂量为40mg/kg/day时有明显抗肿瘤活性。中国专利 200710045368. χ “紫芝菌丝体胞内多糖及其制备方法和应用”公开了一种从紫芝液体深层 发酵产生的菌丝体中提取制备得到粗多糖的方法。涉及了水提醇沉法提取得到粗多糖含量 在39 75%。其药理实验证明其有明显的抗肿瘤作用(对小鼠Η22肝癌和Lewis肺癌的抑 制率分别在45 55 %，和40 50 % )，剂量也为40mg/kg/day (给药方式口服喂药)。杨国 红，杨义芳，金隽迪(紫芝液体深层发酵的抗肿瘤活性部位研究[J].中草药，2008，39 (6) 877-880)对紫芝液体深层发酵的抗肿瘤活性多糖进行了研究，从紫芝菌丝体中提取得到胞 内多糖，药理实验证明其抗肿瘤活性与双灵固本散相当。多糖由于其分子量大，不易透过生物膜，故影响其吸收率。紫芝菌丝体多糖制备成 冻干粉针剂可直接透过生物膜，进入血液循环，提高生物利用度。多糖类冻干粉针剂的配方多含右旋糖酐，临床上已发现有其过敏性休克导致死亡 的案例多起。另外，传统的紫芝菌丝体多糖提取方法一般使用水提醇沉法，该法得到的粗多糖 含量低，多糖组分复杂，并同时含有蛋白质色素等大分子成分，也容易引起输液反应。鉴于现有技术的状况，需要寻找制备多糖含量高、分子量范围小、不含蛋白质等杂 质、具有明显的抗肿瘤活性且起效剂量低，毒性更小的紫芝菌丝体多糖精制物的方法，从而 提供不会产生不良反应的多糖精制物的冻干粉针剂。
本申请人由紫芝(Ganoderma Sinense Zhao, Xu et Zhang)经过液体深层发酵得 到菌丝体提取分离精制，得到紫芝菌丝体多糖精制物。该多糖精制物的多糖含量达到90% 以上，不含蛋白质。该多糖经药理实验证明具有明显的抗肿瘤作用，且起效剂量低，毒性甚微。 本发明要解决的技术问题是利用紫芝抗多糖菌丝体多糖精制物为原料，提供一种 抗肿瘤活性更好、起效剂量低、毒性更小、且不良反应发生率更低的紫芝菌丝体多糖精制物 冻干粉针制剂。 因此，本发明的第一个目的是提供一种紫芝菌丝体多糖精制物冻干粉针剂，其特 征在于，其由5-25wt%的紫芝菌丝体精制物的75-95wt%的冻干赋形剂组成。作为本发明的进一步优选，所述的紫芝菌丝体多糖精制物冻干粉针剂由8-20wt% 的紫芝菌丝体精制物和80-92wt%的冻干赋形剂组成。更有选地，本发明的紫芝菌丝体多糖精制物冻干粉针剂由15wt %的紫芝菌丝体精 制物和85wt%的冻干赋形剂组成。进一步，所述冻干赋形剂选自甘露醇、聚乙二醇、羟丙基β环糊精、磷酸二氢钠或 柠檬酸钠中的一种或几种。优选的赋形剂是甘露醇和/或柠檬酸钠。进一步，所述粉针剂的ρΗ为7. 44-7. 47。本发明的第二个目的是提供上述紫芝菌丝体多糖精制物冻干粉针剂的制备方法， 所述方法包括在原料混合物中加入针剂活性炭并用微孔滤膜过滤的步骤。本发明冻干粉针剂的原料紫芝菌丝体多糖精制物的制备方法包括如下步骤紫芝 菌丝体经水提醇沉得到粗多糖，粗多糖经超滤、浓缩和沉析，得到紫芝菌丝体多糖精制物。具体方法如下粗多糖提取采用山东紫芝菌种(Ganoderma sinense)进行液体发酵，得发酵液1300L，得到菌 丝体用水洗，板框压滤。取菌丝体用3倍水提加热提取2次，每次池，提取温度为90°C。水 提液合并浓缩至菌丝体量和药液量比为1 2，后加4倍95%醇沉过夜，沉淀取出晾干，得 到粗多糖119. 22g。粗多糖精制取上述粗多糖用20倍水溶解，用分子量为3万的超滤膜分离粗多糖液，取截留液 用纳滤膜浓缩。取干燥后的多糖部位lg，溶于IOOmL去离子水中，离心分离，取上清液加2%三甲 基十六烷基溴化铵，混勻，离心分离，取上清液加硼酸50mL，用IMNaOH溶液调ρΗ至11， 继续用乙酸调PH至7，离心分离。取上清液用乙酸调ρΗ至4. 4，加1. 5倍乙醇醇沉过夜，离 心分离取沉淀，用水溶解后用透析袋流水透析，取出透析袋内液后，浓缩，冷冻干燥，即得紫 芝菌丝体多糖精制物。该多糖精制物的得率为64. 5%，多糖含量为92. 5%，单糖含量为1. 7%，蛋白质反 应为阴性。由上述紫芝菌丝体多糖精制物制备本发明紫芝菌丝体多糖精制物冻干粉针剂的 方法包括如下步骤取紫芝菌丝体多糖精制物，用适量注射用水溶解，加入处方量赋形剂，加入针剂活 性炭，微孔滤膜过滤，分装在西林瓶中，冷冻干燥，封口，制取针剂。本发明的紫芝菌丝体多糖精制物冻干粉针剂由于采用了紫芝菌丝体多糖精制物 制备，后者多糖含量高、分子量范围小，因此该冻干粉制剂具有更好的抗肿瘤活性且起效剂量低、毒性更小；另一方面，由于多糖精制物不含蛋白质等杂质，因此使用该冻干粉制剂产 生不良反应的概率较之现有技术的紫芝菌丝体多糖冻干粉针剂大大降低。 空白配制取2ml去离子水，加5 %苯酚Iml，浓硫酸7ml，水浴加热，冷却，作空白液。标准曲线绘制将标准待测液和空白液用紫外分光光度法于490nm处测其吸收 值，并做标准曲线。样品配制取粗多糖样品精密称定20mg，加入IOml的去离子水中配制^iig/ml溶 液，取0. 2ml于试管中，加水补足1ml，按标品液依次加入苯酚、浓硫酸，水浴加热，冷却，作样品液。检测将待测样品用紫外分光光度法于490nm处测其吸收值，用标准曲线测其多糖含量。用葡聚糖标准品Dextron系列标定本发明紫芝菌丝体多糖精制物的分子量的方 法如下(也请补充具体操作步骤及计算方法)单糖含量测定3，5- 二硝基水杨酸试剂精密称取1. OOOg 3，5_ 二硝基水杨酸于IOOmL烧杯中， 先加入20mL2mol/L氢氧化钠溶液，再加入30g酒石酸钾钠，加水充分溶解定容至500mL葡萄糖溶液配制精密称取干燥好的葡萄糖200mg，定溶至IOOml配制成2mg/ml 溶液，分别取0,0. 4,0. 8,1. 2,1. 6,2. Oml于25ml容量瓶中，分别加水补足2ml，各加入3， 5-二硝基水杨酸anl，沸水煮5min，立即冷却，用去离子水稀释至刻度，摇勻，在550nm处测 其紫外吸收值，做标准曲线。样品检测取样品12mg于IOml容量瓶中，加去离子水2ml使之溶解，再加3，5-二 硝基水杨酸anl，沸水煮5min，立即冷却，加水稀释至刻度。在550处测其紫外吸收，带入标准曲线，算出单糖含量。采用高效凝胶法测定纯度及分子量色谱条件TSK-GEL GMPWxl色谱柱；流动相为水；流速0. 3mL/min ；柱温35°C;检 测器为示差检测器。标品Dextron、多糖样品分别用水溶解，进样。测定葡聚糖Dextron系列和样品保留时间，以Dextron的保留时间-Dextron系列 的分子量对数值做标准曲线，将多糖样品的保留时间带入标准曲线，可推知每个多糖峰的 分子量。蛋白质阴性反应的具体步骤如下茚三酮试液配制方法0. 2g茚三酮溶于100mL95%乙醇，浓度为0. 2%茚三酮反应 (蛋白质鉴别)将样品溶液滴于白瓷板(蒸发皿)上，加一滴茚三酮液，定性检测是否有蛋 白质。实施例1 处方组成

本发明公开一种紫芝菌丝体多糖精制物冻干粉针剂，其特征在于，其由5-25wt％的紫芝菌丝体精制物的75-95wt％的冻干赋形剂组成。本发明的紫芝菌丝体多糖精制物冻干粉针剂由于采用了紫芝菌丝体多糖精制物制备，后者多糖含量高、分子量范围小，因此该冻干粉制剂具有更好的抗肿瘤活性且起效剂量低、毒性更小；另一方面，由于多糖精制物不含蛋白质等杂质，因此使用该冻干粉制剂产生不良反应的概率较之现有技术的紫芝菌丝体多糖冻干粉针剂大大降低。