专利名称：副溶血性弧菌产毒株鉴定平板试剂盒、制备及使用方法目前，国内外尤其是沿海国家副溶血性弧菌是引起食源性疾病的重要的病原菌，根据其是否含有毒力因子可以分为产毒株和非产毒株两类，95%左右的产毒株含有毒力因子耐热直接溶血素(TDH)，是导致食物中毒事件的主要菌株，因此针对副溶血性弧菌产毒株的分离鉴定工作尤其重要。目前检测副溶血性弧菌产毒株的方法主要依靠分子生物学的方法，即利用聚合酶链扩增(PCR)检测耐热直接溶血素基因( *)，该法较虽然具有操作简单、快速且灵敏特异的优点，但是应用于食品和其他样品中副溶血性弧菌产毒株的筛选还存在一定的局限性，即筛选到的阳性结果无法通过细菌学方法分离到，也可能因为存在死菌而产生假阳性结果；另外PCR结果需要依靠电泳图谱去判断，判定标准不够直观，影响因素较多，在不同实验室较难形成统ー的标准。还有报道利用副溶血性弧菌的荚膜抗原(K抗原)特性，制备免疫磁珠的方法去检测副溶血性弧菌产毒株，但是由于副溶血性弧菌产毒株的K抗原种类多达71种，这在很大程度上影响此法在副溶血性弧菌产毒株检测中的应用。本发明是基于利用副溶血性弧菌产毒株的溶血特性所产生的溶血环进行鉴定的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的分子生物学方法以及免疫磁珠的检测方法更具有综合成本低、操作简单、快速、无需依赖特殊仪器且准确性及阳性预期值高的优点，而且能缩短鉴定时间，有利于副溶血性弧菌产毒株鉴定的标准化流程的建立和应用。适用于临床医疗、出入境检验检疫、食品卫生、疾病预防控制及相关实验室开展的副溶血性弧菌产毒株的鉴定。更在原理设计、操作人员与实验室要求方面和分子生物学方法有本质的区别，且使用针对性更强。
本发明的目的是公开一种即用型副溶血性弧菌产毒株鉴定平板的试剂盒、配制及使用方法。主要解决目前副溶血性弧菌产毒株鉴定繁琐、鉴定方法难以统一以致无法建立标准化流程等技术难题。本发明利用副溶血性弧菌产毒株的溶血特性配制血平板，使用一步接种-培养法观察副溶血性弧菌的溶血现象，达到对产毒株的快速、简单的鉴定效果。本发明的技术方案为副溶血性弧菌产毒株鉴定平板试剂盒，包括副溶血性弧菌产毒株鉴定培养基，其组成成分酵母浸膏3.0g，蛋白胨lO.Og，氯化钠80.0g，磷酸氢ニ钠30. 0g，葡萄糖10. 0g，琼脂15. 0g，蒸馏水1000. 0ml，调节培养基pH为8. O土O. 2 ; 新鲜兔血50ml (含体积百分比0. 3%枸櫞酸钠的抗凝血剂)； 制法将上述成分混合，加热至100°C，保持30min，冷至46°C 50°C，与50ml预先洗涤的新鲜兔血(含抗凝血剂)混合，倾注平板。待平板表面干燥后，尽快使用。 本发明的有益效果是改进副溶血性弧菌产毒株的鉴定方法，使用标准化的配方培养基对副溶血性弧菌产毒株进行培养，有利于减少操作者个体差异而造成的误差，溶血现象容易观察判断，通过观察是否出现透明的溶血环较容易做出判断。由此解决了现有的副溶血性弧菌产毒株鉴定难，难以检测等问题，快速、准确的检测副溶血性弧菌产毒株有利于对其带来的食源性疾病进行预防和控制。同时，操作过程简便也极大的提高了単位时间的工作效率，使操作者更易掌握和接受，減少实验过程中认为因素造成的个体差异。即用型副溶血性弧菌产毒株鉴定平板使用方法
(I)应用新培养的纯菌菌苔或单个菌落；
⑵在副溶血性弧菌产毒株鉴定平板上，以接种环挑取被测菌涂一小块面积(直径约为I-3mm的圆形面积),于36°C温箱培养18h ；
⑶看结果前用清洁玻片轻轻刮去全部菌苔，并将用过的玻片于121°C，15min灭菌。有透明斑或半透明斑为阳性(半透明斑为弱阳性)。表I显示了即用型副溶血性弧菌产毒株鉴定平板的使用效果，共215株菌，PCR检测结果显示有153株菌含有溶血素基因tdh，m株菌不含溶血素基因tdh，即用型副溶血性弧菌产毒株鉴定平板显示152株含tdh的菌株呈溶血阳性，而62株不含tdh的菌株呈溶血阴性，还有I株含tdh的菌株呈溶血弱阳性，两种检测结果的一致率达100%。呈弱阳性的现象是由于溶血素基因 *存在亚型，不同的亚型表达量有所不同，所以其溶血现象存在少许差异，但这不影响结果的判读。因此，本发明即用型副溶血性弧菌产毒株鉴定平板的鉴定结果可靠，可作为产毒株的鉴定方法推广使用。表I即用型副溶血性弧菌产毒株鉴定平板与PCR方法鉴定结果比较
IJSiriaI PCReiISt性# 「一致藥
I _产灘徽平摄
152!52 株PSIt152 株 It1 4
6.262 _ 性62 =Pf注_%
II株阳性100%


本发明涉及利用副溶血性弧菌产毒株的溶血现象进行鉴定的试剂盒、制备和使用方法。主要解决目前副溶血性弧菌产毒株鉴定繁琐、鉴定方法难以统一以致无法将其作为常规检测目标进行使用等技术难题。技术方案即用型副溶血性弧菌产毒株鉴定平板试剂盒，其特征是包括副溶血性弧菌产毒株鉴定培养基，其组成成分酵母浸膏 3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠80.0g，磷酸氢二钠30.0g，葡萄糖10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000.0ml，调节培养基pH为8.0±0.2；新鲜兔血50ml，兔血含体积百分比0.3%枸橼酸钠的抗凝血剂。本发明利用副溶血性弧菌产毒株的溶血特性配制血平板，使用一步接种-培养法观察副溶血性弧菌的溶血现象，达到对产毒株的快速、简单的鉴定效果。